Исторические Просмотр и физиологии Демонстрация на NMJ из мышц открывалка раков

Summary

Нож мышцы ног раков представляется для ее историческое значение и экспериментальных гибкость в мышцах фенотип, синаптической пластичности и физиологии.

Abstract

Здесь мы представляем некоторые из ключевых важных открытий, сделанных с нервно-мышечными нож (NMJ) подготовка ракообразных и показать, что есть еще чему поучиться у этой модели подготовки. В понимании истории можно понять, почему даже сегодня это NMJ по-прежнему предлагает богатую площадка для решения вопросов, касающихся пред-и пост-синаптические функции и пластичности. Жизнеспособность и легкость доступа к терминалу для внутриклеточной, так и внеклеточной электрофизиологии и визуализации значительные преимущества. Механизмы, лежащие в модуляции везикулярного кинетики и слияния в области высоких и низких выходных клемм просят о расследовании. Препарат также предлагает проверяемых модельной системой для оценки вычислительной и манипуляций для изучения ключевых переменных в теоретических моделях синаптической функции, например кальция динамику во время краткосрочных операций. Синаптических сложности активной зоны и статистического характера квантово-релиз также открытая площадка для будущего расследования как экспериментально, так и вычислительно.

Protocol

Введение

Нервно-мышечной стыках ракообразных предоставили важный вклад в физиологию и особенно синаптических физиологии за эти годы. Легкость вскрытия и жизнеспособность, вероятно, ключевыми факторами, которые способствовали ранние анатом и физиолог позже использовать ракообразных в качестве экспериментальных препаратов. Раки, в частности, легко получить из самых пресных вод рек и озер, а также их легко поддерживать в лабораторных условиях по сравнению с ракообразными требующих холодной, соленой воде окружающей среды.

Зоолог еще в конце 1800-х годов принял близко к сердцу отдельных видов ракообразных (например, рака) и написал книгу под названием Раки ( Хаксли , 1879). Этот текст служил путеводитель на эти организмы в течение многих лет и по сей день остается приветствовали как всесторонняя книга избирательно на раков дело с жизнью история, анатомия и физиология. Хаксли рассматривается раков как модель животного, чтобы погрузиться в глубины зоологии во всех аспектах, таким образом, комплексный характер его книги. Время было выгодно, как физиология был цветущий в конце 1880-х годов с пониманием Рингера ионов, необходимых для поддержания сердца лягушки препаратов (Ringer, 1882a, б). Это, вероятно, одна из причин, что физиологические эксперименты прогрессировала быстро и в других видов, а также раки. Кроме того, для поддержания солевого ракообразных приготовления были описаны Ван Harreveld в 1936 году.

Удивительно иннервации нож мышцы в ногах раков была также характерна в это время в истории (Бидерман, 1887). Но еще более удивительно то, что физиологические исследования уже ведутся в мышцах раков Чарльзом Рише во Франции. На самом деле, эксперименты в раков можно было бы сделать первым, чтобы продемонстрировать содействие в нервно-мышечной (NMJ) (Рише, 1879, см. также Рише, 1881). В течение следующих нескольких десятилетий раков NMJs были описаны анатомически и физиологически по отношению к развитию напряженности и анатомии (Van Harreveld и Вирсма, 1936).

Появление внутриклеточной регистрации, с острыми электродами (Линг и Жерар, 1949), обновленной местах для решения различных наборов вопросов. Ракообразных мышцы, как известно, производят градуированных сокращений (Кац и Kuffler 1946; Кац, 1949; Вирсма, 1949), но оно не было до 1953 года, что Fatt и Кац записал трансмембранных потенциалов краткосрочных содействие в волокнах мышц краба.

Нож мышц конечностей раков вновь подчеркивается в 1961 году, когда Dudel и Kuffler продемонстрировали содействие в этой мышце и показал на ^1-й раз явления пресинаптического торможения (1961а, б; Dudel, 1963, 1965а). Они также сообщили о квантовой природе синаптической передачи на этом NMJ (1961б). В последние 50 лет произошло довольно много внимания уделяется подготовке и различные методы, используемые для контроля синаптических физиологии. В течение краткого учетом более исследований с использованием этого препарата, мы начнем с отметив, что вся мышца иннервируется один возбуждающих и тормозных аксонов, которые могут быть выборочно стимулировать. Этвуд (1964) продемонстрировано с поезда стимуляции возбуждающих постсинаптических потенциалов способствовал и производится мышечное напряжение. Iravani (1965) сообщили о региональных различиях в синаптических ответов в зависимости от региона мышцы. Вскоре после этого Dudel (1965а, б), записанные потенциалов вдоль нервных окончаний на нож и показал, что серотонин нейромодулятора расширенной синаптической передачи за счет увеличения средней квантовой содержания.

К этому времени было установлено, что ракообразное мышцы ответил на глутамат и различные аминокислоты, а также ГАМК (Van Harreveld и Мендельсон, 1959; Robbins, 1959;. Kerkut и др., 1965). Тормозных реакций ГАМК была определена Флори (Bazemore и соавт., 1956, 1957) и др. (Boistel и Fatt, 1958). Позже ГАМК был выделен и подтверждается Kravtiz (Кравиц и Поттер, 1965; Кравитц и др., 1963а, б;. Kravitz, 1962) из аксонов препаратов омара открывалка.

Раков мышц предлагаются не только легко доступны подготовки, но позволяет изучать как идентифицировать одного моторных нейронов может привести к различным постсинаптических ответов на физиологические и структурном уровне. В частности нож мышцы иннервируются одной возбуждающих нейронов двигательной функции, но возбуждающих постсинаптических потенциалов (ВПСП) в различных местах, могут отличаться более чем в 50 раз в спинной поверхностные слои (Биттнер, 1968а, б) и целых 8 раз в вентральной поверхностные волокон (Iravani, 1965).

"> С семенных обнаруживают, что нож в NMJ раков выставлены долгосрочного содействия (ЛТС) (Шерман и Этвуд, 1971), в дополнение к краткосрочным облегчение, механистический основы этих явлений необходимо решать. В качестве побочного Отметим, долгосрочные потенцирования (LTP) было обнаружено в мозге позвоночных через два года (Bliss и L мес, 1973) без ссылок на оригинальные открытия явления на раков NMJ. С этого периода на многих исследователей направлены на атрибуты СТП и LTF использованием нож NMJ раков для изучения клеточных механизмов (Этвуд, 1973, 1976, 1982; Этвуд и др., 1994;. Zucker, 1973, 1974а, б; Биттнер и Сьюэлл, 1976;. Парнас и др., 1982а, б, в, г; Dudel и др., 1983;.. Vyshedskiy и Лин, 1997а, б, в) Также фокус в том, чтобы понять, как единый двигательный нейрон иннервирующих различные волокна мышц на нож мышц может привести таким разнообразным синаптических ответов (Линдер, 1974; G ° nzel и др., 1993;. Говинд и др., 1994;. Iravani, 1965; Этвуд, 1967; Биттнер, 1968а, б; Шерман и Этвуд, 1972; Цукер, 1974а; Парнас и др., 1982а;. Цукер и Хейдон, 1988; Dudel, 1989а, б, в, г).

Synaptic структуры для учета дифференциальных синаптических ответов может быть исследован с помощью ультраструктурным анализа (Jahromi и Этвуд, 1974). Меры ионных различия, связанные с деятельностью может быть исследована с аксонального инъекции Ca2 + и Na + показатели, а также Са2 + буферов (Малки и Цукер, 1993;. Уинслоу и др., 2002), и эти потоки могут быть смоделированы в терминал (Winslow и др., 1994;. Cooper и др., 1996b).. Деятельностью, которая зависит адаптации (Этвуд и др., 1991.) И фармакологические идентификации нейромодулятора подтипов рецепторов (Dropic и др., 2005;. Ruffner и др., 1999;. Спаркс и Купер, 2004; Sparks и др., 2004;. Фавор и Купер , 2002;), которые влияют на синаптических пузырьков бассейна и кинетика (Логсдон и др., 2005;. Саутард и др., 2000;.. Sparks и др., 2003) также был рассмотрен которая является лидером на новые вопросы решать. Понятия роли кальция во время STF против деполяризацию мембраны в синаптическую передачу на нож NMJ привести к некоторым расхождения во мнениях (Малки и Цукер, 1991; Hochner и др., 1989).

Относительно недавно региональная дифференциация в синаптической силы и облегчение от одного двигательного нейрона, была решена и, кажется, из-за разногласий с местными пресинаптические изменения в синаптической структуре и физиологии (Этвуд и др., 1994;. Этвуд и Купер, 1995, 1996а , б; Купер и др., 1995b, 1996a, б).. Ультраструктурные анализа от электронных микрографические исследования показали, что варикоз содержат большинство синаптических контактов (Флори и Кэхилл, 1982;. Cooper и др., 1995b). Сила синаптической передачи уменьшается по длине одного терминала, который, кажется, из-за сложности синаптические структуры (Cooper и др., 1996a;.. Говинд и др., 1994). Различия в структуре синаптических может частично объяснить различия в Ca 2 + во время стимуляции притока на разных частотах (Cooper и соавт., 1995b, 1996b).

Поскольку Есть региональные различия в фенотипе мышц и биохимии среди мышечных волокон нож (G ° nzel и др., 1993;.. Mykles и др., 2002), которые разделены на области, могли бы объяснить зрения развития регулируется мышц фенотип, воздействий и поддерживает региональные различия двигательных нейронов (Mykles и соавт., 2002). Идея ретроградного влияния была исследована в скелетных мышцах лягушки (Nudell и Grinnell, 1983), в омар (Katz и соавт., 1993), а в раков (Lnenicka и Меллона, 1983) с разумной убедительных доказательств. Местного регулирования терминалов в отдельных нейронов, не влияя на другие терминалы пространственно вполне возможно в ракообразных моторных нейронов, поскольку терминалы могут измерять от 1 см до 10 см на расстоянии друг от друга. В отличие от позвоночных, блок двигателя может включать более одной мышцы у беспозвоночных (см. обзор Этвуд, 1973). Нейрона excitor двигатель, который иннервирует все мышцы нож также иннервирует мышцы носилках в более проксимальных ногу сегменте. Упрощение измерений между мышечными волокнами мышц нож показал, что Есть разногласия, которые могут быть связаны с отдыха уровней ионов Са 2 + (Cooper и соавт., 2005b) и / или, возможно, совместно выпуска (Парнас и соавт., 1982а, б)

Различия в структурной сложности между высоко-и низко-вывода синапсов вдоль терминалов на нож мышцы были исследованы квантовые подписи по отношению к набору активе зон в синапсах при STF но это оказалось трудно установить (Lancaster и др., 2007;. Viele и др., 2003, 2006.). Возможные бассейны везикул между высоко-и низко-вывода синапсов окажется регулируется дифференциально кинетики как известно neromodulators имеют различное влияние на низких и высоких выходных клемм (Логсдон и др., 2005;. Спаркс и Купер, 2004; Cooper и соавт., 2003).

Использование в будущем подготовку нож мышцы в раков так богат, как это было 50 или 100 лет назад. Подготовка по-прежнему очень выносливы по сравнению со многими другими синаптических препаратов. Квантильного ответы могут быть записаны электрофизиологических непосредственно в синаптических контактов, а также отображаемого на динамику пузырька в различных типах четко определенных терминалах. Препарат не потерял свое очарование в том, чтобы идентифицировать одного нейронов для возбуждающих и тормозящих входов. Несмотря на раков не практично для генетических манипуляций, исследования можно обратиться роль синаптических белков и для дрозофилы. Есть много общего в синаптическую функцию Drosophila NMJs (Этвуд и Купер, 1995, 1996а, б), которые могут быть рассмотрены исследования белков инъекций (Он и соавт., 1999). Регулирование синаптических пузырьков в бассейнах терминалы двигательного нерва также богатая область для будущих исследований, а также механистические исследования, чтобы понять кальция регулирования при STF (Десаи-Шах и др., 2008;. Десаи-шаха и Купер, 2009) для объяснения многих из оставшихся тайн в основе синаптической передачи.

Методы

Рассечение

Раки, Procambarus clarkii, измерения 6-10 см в длине тела (Атчафалайя Биологические питания Ко, Raceland, Л. А.) индуцируются автоматизировать первой или второй ходьбе ногу силой щипать на ischiopodite сегменте.

Поверните ноги вокруг, пока можно быть уверенным, снаружи (боковые стороны) вверх на вскрытии пластины. Это, как правило, арочные стороной вверх. Размещение ногой на папиросную бумагу помогает так препарат может быть включен легко, делая эти сокращения.

С скальпель выключателя лезвия и держатели острое лезвие бритвы используют для травления кутикулы пока только прорезая в картине показано на этом рисунке для meropodite сегменте. Уход должен быть использован, чтобы не порезать далеко дистальных на спины к брюху сокращены на meropodite - карпоподит сустава. Оставьте кутикулу на место на данный момент.

С бритва лезвие скальпеля травления кутикулы на проподит пока только прорезая в картине показано на рисунке выше для проподит сегмента на одной стороне и затем повторите на другой стороне присоединения проксимальных разрезов. Уход должен быть использован не врезаться нож мышцы. Это можно сделать, держа лезвие опираясь на тесное мышц при резке через кутикулу. Также для спины к брюху вырезать, соединяющий вокруг брюшной стороны, будьте осторожны, чтобы не порезать слишком проксимальных как совместное соединение узким и легко ломаются. Оставьте кутикулу на место на данный момент.

Препараты должны быть введены в солевом растворе. Это рассечение блюдо должно иметь Sylgard (Dow Corning) покрытие на нижней (1 см толщиной). Sylgard используется так, чтобы насекомое контакты могут застрять в ней на проведение подготовки до сих пор. На данный момент палку штифт в спинной хвостовой углу, в разрезе, из окна, сделанные в meropodite.
С тонкой пинцет (# 5) поднять немного кутикулу от дистального конца и с бритвой, разрезать волокна мышц сгибателей от кутикулы, резка в дистальной к проксимальной образом. Поднимите окно кутикула прочь.

Теперь сократить аподема (сухожилия) при meropodite - карпоподит сустава (см. ниже). Будьте очень осторожны, чтобы потянуть сухожилия от ноги полости, прежде чем вырезать и только вырезать сухожилие, а не главный нерв нога, которая находится на внутренней стороне сухожилия. Pinch сухожилия, где она была сокращена с помощью пинцета и тянуть мышцы сгибателей с, подняв его в каудальном направлении. Теперь главный нерв ноги и разгибателей мышц подвергаются.

Приступить к проподит сегменте, а теперь разрезать по крайней проподит dactylopodite сустава. Здесь ближе сухожилия, может быть, вырезанные из кутикулы привязанности. Вытяните вентральной (ближе мышц стороны) сегмент проподит вниз и назад каудально, так что мышцы в хвостовом отделе можно увидеть. Сокращение этих мышц с бритвой. Будьте осторожны, чтобы не порезать мышцы слишком близко к совместной и риск резки филиала двигательного нерва на мышцу нож. Нож мышцы теперь подвергается физиологическим раствором.

Вернуться в meropodite регионе, чтобы изолировать нервных пучков содержащие возбуждающих и тормозных нейронов двигателя нож мышцы. В наиболее хвостового отдела meropodite сегменте пучок нервов ног обычно содержит разделенные нерва расслоения. Этот короткий региона, где два пучка можно увидеть то, где спинной расслоение может быть перерезана с мелкими ножницами. Срез может быть подобран с № 5 пинцетом и аккуратно вытащил дистально примерно до половины длины meropodite сегменте будет достигнуто. Эта длинная ветвь нерва содержит возбуждающих нервы нож и больше комок нервов содержит тормозных нейронов двигатель нож мышцы.

Подготовка в meropodite сегмент в настоящее время сокращение диагональ таким образом, чтобы насекомое вывод может быть размещен через спинной части meropodite. Это позиции вентральной аспект нож мышцы так, чтобы она сталкивается наблюдателя (как показано на рисунке ниже).

Остаточные волокна мышц, которые ближе блоков зрения нож мышцы теперь могут быть удалены нажатием волокна от кутикулы и из проподит полости. Иногда соединительная ткань охватывает нож, который может быть удален, тщательно используя # 5 пинцетом. Главный нерв нога, которая проходит по нож мышцах и переходит в dactylopodite может быть либо сокращение начало dactylopodite совместных или просто подъехал с тонким пинцетом. Это главный нерв ноги, а иногда и очевидные связанные кровеносных сосудов можно достать из нежно в проксимальном направлении на длину нож мышц, а затем отрезать.

Теперь нож мышцы подвергается без каких-либо ткань, чтобы получить на пути внутриклеточного электрода или координационного электрода macropatch.

В целях стимулирования возбуждающие нерв нож мышц подготовки в настоящее время переехал в записи камеры разработаны с пластиковым электродом всасывания. После стимулирующего электрода встроен в камеру позволяет избежать необходимости использования микроманипулятора разместить стимулирующий электрод. Pin подготовки вниз в записи блюдо и поместить ветвь нерва, которая содержит возбуждающих нерва в всасывающего электрода.

(Взято из: Mykles, DL, Medler, SA, Кендерс А., Купер, Р. Л. (2002) миофибриллярных белка изоформы выражение соотносится с синаптической эффективности в медленных волокнах коготь и мышцы ног нож раков и омаров журнал. Экспериментальная биология 205 (4): 513-522).

Солевой

Расчлененный подготовке ведутся в раков физиологический раствор, раствор изменение Ван Harreveld (в мм: 205 NaCl, 5,3 KCl; 13,5 CaCl2.2H2O; 2,45 MgCl2.6H2O, 5 HEPES доводили до рН 7,4).

Запись внутриклеточных ВПСП

Чтобы вызвать вызвала отклик, возбуждающие аксон избирательно стимулируется Трава стимулятора. Области нож пронзил мышцы с резким внутриклеточного электрода (от 20 до 30 мОм сопротивление), заполненной 3 М KCl. Стандартный этап головы и усилитель для внутриклеточной регистрации могут быть использованы, однако мы использовали модель Axonclamp 2B (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния, США), усилителем и 1 X LU голову стадии. Короткий срок упрощении (СТП) или различные другие типы ответов желании можно получить путем изменения стимулов условиях. STF получается, давая ход 10 или 20 импульсов на 10 или 20 секундным интервалом, соответственно, возбуждающих нервы. Частота стимуляции в поезде может быть изменен (40, 60 и 80 Гц). Intrбесклеточной записи ВПСП обычно выполняемые этими стандартными процедурами (Кридер & Cooper, 1999, 2000;. Cooper и др. 1995b; Dudel, 1983; Спаркс и Купер, 2004; Десаи-шаха и Купер, 2009).

Нож мышца делится на три основных региона: дистальный, центральных и проксимальным. Хотя все открытые мышцы иннервируются одной двигательных нейронов, NMJs структурно разные и имеют региональную специфику различий в синаптической эффективности в этих трех основных регионах (Cooper и соавт. 1995а, б). Фенотипа мышечного волокна типа также было показано, что различные в этих регионах (Mykles и соавт. 2002). По этим причинам наиболее дистального волокна используются, так как они легко разграничены на предмет соответствия среди препаратов.

Запись координационного квантовой ВПСП прямо над идентифицировать регионы нервного окончания

Синаптических варикозов визуализируются с жизненными красителя 4-Ди-2-Asp (Magrassi и соавт., 1987), которая не влияет на синаптическую передачу, в концентрации и времени занятых (5 мкМ, 5-мин лечение, Cooper и др. ., 1995b). С флуоресцентной микроскопии, просвет макро-патч записи электрода (Cooper и др., 1995c,.. St ^ hmer и др., 1983) могут быть размещены непосредственно над одной изолированной варикозное расширение вен. Чтобы вызвать нервный терминал, возбуждающие двигательного нерва стимулируется как упоминалось выше. Спонтанный, а также вызвала квантовой ответы могут быть записаны вдоль строки визуализированы варикоз, аккуратно снижение светового потока и повышение его на каждом варикозное расширение вен.

Синаптические потенциалы регистрируются через макро-патч электрода основном, как описано Dudel, 1981; Wojtowicz и соавт. (1991) и Mallart (1993). Kimax стекла (наружный диаметр: 1,5 мм) была разобрана и огневой полировкой, чтобы произвести патч советы с внутренним диаметром от 10 до 20 мкм. Просвет электрод наполнен купания среды. Усилитель же, что и для внутриклеточных записей, упомянутых выше. Электрод и печатью сопротивления может быть определен путем пропускания тест импульсов тока через электрод. Печать сопротивления колебались от 0,3 до 1,0 M0hm и сопротивления электродов в диапазоне от 0,5 до 1,0 M.0. Печать сопротивление может быть контролируется в течение записи.

Прямой подсчет квантовых событий возможно при низких частотах стимуляции. Для каждого вызвала отклик, число квантовых событий может быть определена. За серию ответов, общее число квантовых событий подсчитывается на то оценка означает квантовой содержание, основанное на этих прямого счета. Один из подходов для расчета средней квантовой содержание в результате чего общее число квантов и разделить на общее количество ответов (дель Кастильо и Кац, 1954). Есть и другие подходы могут быть использованы, а на основе максимальной амплитудой или области ВПСП (Cooper и соавт., 1995b).