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Biology

Ver histórico y demostración de Fisiología en la UNM de los músculos inaugural cangrejo de río

Published: November 9, 2009 doi: 10.3791/1595
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, University of Kentucky

Summary

El abridor de los músculos de la pierna cangrejos de río se presenta por su importancia histórica y la versatilidad experimental en el fenotipo muscular, la fisiología sináptica y la plasticidad.

Abstract

Aquí presentamos algunos de los descubrimientos clave importante hecho con el primer partido neuromuscular (UNM) la preparación de los crustáceos y ponen de manifiesto que todavía hay mucho que aprender de esta preparación del modelo. En la comprensión de la historia se puede apreciar por qué aún hoy en día esta MNJ todavía ofrece un campo de juego rico para hacer frente a preguntas sobre la función de pre-y post-sináptica y la plasticidad. La viabilidad y facilidad de acceso a la terminal para intracelulares, así como extracelular de electrofisiología e imágenes importantes ventajas. Los mecanismos que subyacen a la modulación de la cinética vesicular y la fusión dentro de las terminales de alta y baja producción-están pidiendo una investigación. La preparación también ofrece un sistema de modelo comprobable para la evaluación de cómputo y las manipulaciones para examinar las variables clave en los modelos teóricos de la función sináptica, por ejemplo, la dinámica de calcio durante el corto plazo la facilitación. La complejidad sináptica de la zona de activo y de naturaleza estadística de la liberación cuántica es también un área abierta para una futura investigación experimental y computacional.

Protocol

Introducción

La unión neuromuscular de crustáceos han aportado contribuciones importantes a la fisiología y en particular a la fisiología sináptica en los últimos años. La facilidad en la disección y la viabilidad son probablemente los factores clave que fomentaran el fisiólogo de principios de anatomía y después de usar los crustáceos en preparaciones experimentales. Cangrejos de río, en particular, son fáciles de obtener de las corrientes de la mayoría de los de agua dulce y lagos, así como que son fáciles de mantener en el laboratorio, en comparación con los crustáceos que requieren un ambiente frío, el agua salada.

Un zoólogo de nuevo en la década de 1800 llevó al corazón en particular especies de crustáceos (es decir, cangrejos de río) y escribió un libro titulado El cangrejo de río ( TH Huxley , 1879). Este texto sirvió de guía en estos organismos durante años y hoy sigue siendo aclamado como un libro completo de forma selectiva en cangrejos de río sobre la historia de vida, anatomía y fisiología. Huxley ve el cangrejo de río, como un animal modelo para sumergirse en las profundidades de la zoología en todos los aspectos, por lo que la naturaleza global de su libro. El momento fue ventajoso como la fisiología estaba floreciendo a finales de los años 1880 con la comprensión de Ringer de los iones necesarios para el mantenimiento de los preparativos rana corazón (Ringer, 1882a, b). Esto es probablemente una de las razones que los experimentos fisiológicos progresó rápidamente en otras especies, así como el cangrejo de río. Además, una solución salina para mantener la preparación de crustáceos ha sido descrito por van Harreveld en 1936.

Sorprendentemente, la inervación de los músculos en las piernas de cangrejo de río apertura también se caracteriza en esta época en la historia (Biedermann, 1887). Pero aún más sorprendente es que los estudios fisiológicos ya estaban en marcha en los músculos de los cangrejos de río de Charles Richet en Francia. De hecho, los experimentos en los cangrejos de río, posiblemente, podría ser el primero en demostrar la facilitación en el neuromuscular (UNM) (Richet, 1879; ver también Richet, 1881). Durante las próximas décadas NMJs cangrejos de río se está describiendo anatómica y fisiológicamente en relación al desarrollo de la tensión y la anatomía (Van Harreveld y Wiersma, 1936).

El advenimiento de registro intracelular, con electrodos puntiagudos (Ling y Gerard, 1949), revitalizó el campo para hacer frente a diferentes conjuntos de preguntas. Los músculos de los crustáceos se sabe que producen contracciones clasificado (Katz y Kuffler 1946, Katz, 1949; Wiersma, 1949), pero no fue hasta 1953 que Fatt y Katz registraron los potenciales de transmembrana de la facilitación de corto plazo en las fibras musculares del cangrejo.

El abridor de los músculos de las extremidades del cangrejo de río se puso de relieve una vez más en 1961 cuando Dudel y Kuffler demostrado la facilitación de este músculo y mostró por 1 ª vez los fenómenos de inhibición presináptica (1961a, b; Dudel, 1963, 1965a). También informaron sobre la naturaleza cuántica de la transmisión sináptica en esta MNJ (1961b). En los últimos 50 años ha habido un poco de atención a la preparación y diferentes técnicas utilizadas para controlar la fisiología sináptica. Durante un breve punto de vista de las investigaciones sobre el uso de esta preparación, empezamos con el señalar que todo el músculo está inervado por un excitador y un axón inhibidor que puede ser estimulada de forma selectiva. Atwood (1964) demostró con los trenes de la estimulación de los potenciales excitatorios postsinápticos facilita y produce la tensión muscular. Iravani (1965) informó sobre las diferencias regionales en las respuestas sinápticas en función de la región del músculo. Poco después Dudel (1965a, b) los potenciales registrados a lo largo de las terminaciones nerviosas en el primer partido y demostraron que la serotonina neuromodulador mejorada mediante el aumento de la transmisión sináptica contenido medio cuántico.

En ese momento se estableció que los músculos de crustáceos respondió a glutamato y varios aminoácidos, así como el GABA (Van Harreveld y Mendelson, 1959; Robbins, 1959;. Kerkut et al, 1965). Las respuestas inhibitorias de GABA fue identificado por Florey (Bazemore et al., 1956, 1957) y otros (Boistel y Fatt, 1958). Más tarde, GABA fue aislado y confirmado por Kravtiz (Kravitz y Potter, 1965; Kravitz et al, 1963a, b;. Kravitz, 1962) de los axones de las preparaciones abridor de langosta.

Los músculos del cangrejo de río que ofrece no sólo la preparación de fácil acceso, pero permite estudiar cómo las neuronas individuales de identificación del motor puede dar lugar a diversas respuestas postsinápticas a nivel fisiológico y estructural. En particular, el abridor de los músculos está inervada por una neurona motora excitatoria sola, pero el potencial postsináptico excitador (PPSE) en diferentes lugares pueden variar en más de 50 veces en la dorsal fibras superficiales (Bittner, 1968a, b) y hasta ocho veces en la ventral superficial fibras (Iravani, 1965).

"> Con el seminal descubrir que la UNM apertura de cangrejos de río mostraron facilitación de largo plazo (LTF) (Sherman y Atwood, 1971), además de la facilitación de corto plazo, los fundamentos mecánicos de estos fenómenos era necesario abordar. Como parte nota, potenciación a largo plazo (LTP) fue descubierto en el cerebro de los vertebrados dos años más tarde (Bliss y L mo, 1973), sin citar al descubrimiento original del fenómeno en la UNM cangrejos de río. A partir de este período en que muchos investigadores se centraron en los atributos del STF y LTF con la UNM primer partido de cangrejos de río a estudiar los mecanismos celulares (Atwood, 1973, 1976, 1982, Atwood et al, 1994;. Zucker, 1973, 1974a, b; Bittner y Sewell, 1976;. Parnas et al, 1982a, b, c, d; Dudel et al, 1983;.. Vyshedskiy y Lin, 1997a, b, c) También un punto de atención se ha centrado en entender cómo las neuronas motoras que inervan las fibras musculares individuales diferentes en el músculo del primer partido puede dar lugar a tales respuestas sinápticas variados (Linder, 1974; G · nzel et al, 1993;. Govind et al, 1994;. Iravani, 1965; Atwood, 1967; Bittner, 1968a, b; Sherman y Atwood, 1972; Zucker, 1974; Parnas et al, 1982a;. Zucker y Haydon, 1988; Dudel, 1989a, b, c, d).

Estructura sináptica para explicar el diferencial de las respuestas sinápticas pueden ser investigados mediante el análisis ultraestructural (Jahromi y Atwood, 1974). Medidas de las diferencias iónicas debido a la actividad es susceptible de ser investigado con inyecciones axonal de Ca2 + y Na + indicadores, así como Ca2 + buffers (Mulkey y Zucker, 1993;. Winslow et al, 2002), y estos flujos pueden ser modelados dentro de la terminal (Winslow et al, 1994;. Cooper et al, 1996b).. Dependiente de la actividad adaptaciones (Atwood et al, 1991). Farmacológica y la identificación de subtipos de receptores neuromodulador (Dropic et al, 2005;. Ruffner et al, 1999;. Sparks y Cooper, 2004; chispas et al, 2004;. Tabor y Cooper , 2002;) que influyen en las piscinas y las vesículas sinápticas cinética (Logsdon et al, 2005;. Southard et al, 2000;.. Sparks et al, 2003) ha examinado también el que está liderando el camino a nuevas preguntas que deben abordarse. Los conceptos de papel del calcio en comparación con STF despolarización de la membrana en la transmisión sináptica en la UNM abridor de llevar a algunas diferencias de opinión (Mulkey y Zucker, 1991; Hochner et al, 1989).

Hace relativamente poco tiempo la diferenciación regional de la fuerza sináptica y la facilitación de la única neurona motora, ha sido atendida y que parece ser debido a las diferencias de cambios locales en la estructura sináptica presináptica y la fisiología (Atwood et al, 1994;. Atwood y Cooper, 1995, 1996a , b, Cooper et al, 1995b, 1996a, b).. El análisis ultraestructural de los estudios micrográficos de electrones se ha demostrado que las varices contienen la mayoría de los contactos sinápticos (Florey y Cahill, 1982;. Cooper et al, 1995b). La fuerza de la transmisión sináptica disminuye a lo largo de una sola terminal, que parece ser debido a la complejidad de la estructura sináptica (Cooper et al, 1996a;.. Govind et al, 1994). Las diferencias en la estructura sináptica puede explicar en parte las diferencias en el flujo de Ca2 + durante la estimulación a frecuencias diferentes (Cooper et al., 1995b, 1996b).

Dado que hay diferencias regionales en el fenotipo muscular y la bioquímica entre las fibras musculares de la apertura (G · nzel, et al, 1993;.. Mykles et al, 2002), que se dividen en regiones, podría explicar un fenotipo muscular desarrollo regulado que influencias y mantiene las diferencias regionales de la neurona motora (Mykles et al., 2002). La idea de la influencia retrógrada ha sido investigado en el músculo esquelético de rana (Nudell y Grinnell, 1983), la langosta (Katz et al., 1993), y en el cangrejo de río (Lnenicka y Mellon, 1983) con pruebas convincentes razonable. La regulación local de terminales en una sola neurona, sin influir en otros terminales es espacialmente muy posible en los crustáceos, porque las neuronas motoras de los terminales se puede medir de 1 cm a 10 cm de distancia el uno del otro. A diferencia de los vertebrados, una unidad de motor puede incluir más de un músculo de invertebrados (ver la revisión de Atwood, 1973). La neurona Excitor motor que inerva el músculo abridor de todo también inerva el músculo camilla en un segmento de la pata más proximal. Medidas de facilitación entre las fibras musculares del músculo primer partido mostró que hay diferencias que pueden estar relacionados con los niveles de reposo de los iones de Ca2 + (Cooper et al., 2005b) y / o posiblemente en cooperación de la liberación (Parnas et al., 1982a, b)

Las diferencias en la complejidad estructural entre las sinapsis de alta y baja producción-a lo largo de los terminales en el músculo del primer partido fueron investigados por la firma cuántica con respecto a la contratación de actihe zonas entre las sinapsis durante el STF, pero esto ha demostrado ser difícil de determinar (Lancaster et al, 2007;. Viele et al, 2003, 2006.). Posible de las piscinas de vesículas entre las sinapsis de alta y baja de salida, resultará ser regulados diferencialmente en la cinética como se le conoce neromodulators tener efectos diferentes en los terminales de bajo y alto rendimiento (Logsdon et al, 2005;. Sparks y Cooper, 2004; Cooper et al., 2003).

El uso futuro de la preparación muscular apertura de cangrejo de río es tan rica como lo ha sido hace 50 o 100 años. La preparación está siendo muy resistente en comparación con muchos otros preparativos sináptica. Las respuestas electrofisiológicas cuántica puede ser grabada directamente en los contactos sinápticos, así como imágenes para la dinámica de la vesícula en diferentes tipos de terminales bien definidos. La preparación no ha perdido su encanto en el que las neuronas individuales de identificación para las entradas excitadoras e inhibidoras. A pesar de los cangrejos no resulta práctico para la manipulación genética, los estudios son posibles para abordar el papel de las proteínas sinápticas que para Drosophila. Hay muchas similitudes en la función sináptica de Drosophila NMJs (Atwood y Cooper, 1995, 1996a, b) que pueda ser examinado por los estudios de inyección de la proteína (He et al., 1999). La regulación de las piscinas de vesículas sinápticas en las terminaciones nerviosas motoras también es un área rica para la investigación futura, así como estudios sobre el mecanismo para entender la regulación del calcio durante el STF (Desai-Shah et al, 2008;. Desai-Shah y Cooper, 2009) para explicar muchos de los misterios que quedan en los fundamentos de la transmisión sináptica.

Métodos

Disección

Cangrejos de río, Procambarus clarkii, midiendo 10.6 cm de longitud corporal (Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA) son inducidos a automatizar el partido de ida o de segunda caminar por la fuerza apretando en el segmento de ischiopodite.

Figura 1
A su vez alrededor de la pierna hasta que uno puede estar seguro de la parte externa (lateral) hacia arriba en la placa de disección. Este suele ser el lado arqueado hacia arriba. Colocar la pierna en un pedazo de papel de seda ayuda para la preparación se puede girar fácilmente al hacer estos cortes.

Figura 2

Con un interruptor de hoja de bisturí y titular de una hoja de afeitar aguda se utiliza para grabar la cutícula hasta el corte justo a través del modelo que se muestra en esta figura para el segmento de meropodite. La atención debe ser utilizado para no cortar a la medida distal en el dorso ventral para cortar por la meropodite - carpopodite conjunta. Salir de la cutícula en el lugar por ahora.

Figura 3

Figura 4

Con la navaja de bisturí grabar la cutícula de la propodite hasta que estén atravesando en el modelo que se muestra en la figura anterior para el segmento de propodite por un lado y luego repetir en el otro lado unirse a los recortes proximal. La atención debe ser utilizado de no cortar el músculo abridor. Esto se puede hacer manteniendo la hoja inclinada hacia el músculo más cercano al cortar a través de la cutícula. También para el dorsal a ventral corte, que conecta alrededor de la parte ventral, tenga cuidado de no cortar demasiado próximo como la conexión conjunta es estrecho y se rompen fácilmente. Salir de la cutícula en el lugar por ahora.

Figura 5

Los preparativos se debe poner en solución salina. Este plato debe tener una disección Sylgard (Dow Corning) revestimiento en la parte inferior (1 cm de grosor). El Sylgard se utiliza de modo que los pasadores de insectos pueden ser atrapados en él para la celebración de la preparación todavía. En este punto, clavar un alfiler en la esquina caudal dorsal, en el corte, de la ventana de hecho en el meropodite.
Con unas pinzas finas (# 5) levantar ligeramente la cutícula del extremo distal y con la maquinilla de afeitar, cortar las fibras del músculo flexor lejos de la cutícula, el corte en una distal a proximal manera. Levante la ventana de apagado cutícula.

Figura 6

Figura 7

Ahora corta el apodema (tendón) en la meropodite - carpopodite conjunta (ver abajo). Tenga mucho cuidado al tirar del tendón de fuera de la cavidad pierna antes de hacer el corte y cortar sólo el tendón y no el nervio principal que es la pierna en el lado interno del tendón. Pellizcar el tendón en el que se cortó con unas pinzas y tirar del músculo flexor de levantándola en dirección caudal. Ahora el nervio principal de la pierna y el músculo extensor están expuestos.

Figura 8

Continúe con el segmento de propodite y ahora en la corte dactylop propoditeodite conjunta. Aquí el tendón cerca tal vez de corte de la unión cutícula. Tire de la ventral (más cerca de lado los músculos) del segmento de la propodite abajo y en dirección caudal hacia atrás, de modo que los músculos adheridos en la región caudal se puede ver. Cortar estos músculos con la navaja. Tenga cuidado de no cortar el músculo demasiado cerca de la articulación y el riesgo de cortar la rama del nervio motor al músculo del primer partido. El músculo de apertura se encuentra expuesto a la solución salina.

Figura 9

Figura 10

Regresar a la región meropodite para aislar los haces nerviosos que contienen las neuronas motoras excitadoras e inhibidoras del músculo primer partido. En la región más caudal del segmento meropodite el conjunto de nervios que la pierna por lo general contiene un conjunto de nervios que se separaron. Esta pequeña región en la que dos paquetes se puede ver es que el haz dorsal puede ser seccionado con tijeras finas. El extremo del corte puede ser tomado con pinzas # 5 y tira suavemente hacia distal hasta la mitad de la longitud del segmento meropodite se alcanza. Esta rama del nervio de larga contiene el nervio abridor de excitación y el paquete más grande de los nervios contiene las motoneuronas inhibitorias del músculo primer partido.

Figura 11

Figura 12

Figura 13

La preparación en el segmento de meropodite está cortado en forma diagonal de tal manera que un pin de insectos se pueden colocar a través de la cara dorsal de la meropodite. Esto posiciona a la cara anterior del músculo primer partido de tal manera que los que se enfrenta el observador (como se muestra a continuación).

Figura 14

Figura 15

Figura 16

Las fibras residuales de los músculos más cerca que bloquea la vista de la apertura de los músculos ahora se puede eliminar pulsando las fibras contra la cutícula y fuera de la cavidad propodite. A veces, un tejido conectivo cubre el primer partido que se puede quitar con cuidado con el n º 5 pinzas. El nervio pierna principal que corre a lo largo del músculo primer partido y va a la dactylopodite puede ser cortada en el comienzo de la articulación dactylopodite o simplemente se detuvo con las pinzas finas. Este nervio pierna principal y, a veces lo obvio vaso sanguíneo asociado ahora se puede tirar suavemente en una dirección próxima a la longitud del músculo primer partido y luego se corta distancia.

Figura 18

Ahora, el abridor de los músculos se expone sin ningún tipo de tejido para conseguir de la manera de un electrodo intracelular o un electrodo macropatch focal.

Figura 19

Con el fin de estimular el nervio de excitación en el músculo apertura de la preparación se ha trasladado a una sala de grabación diseñado con un electrodo de succión de plástico. Tener el electrodo de estimulación incorporado en la cámara evita tener que utilizar un micromanipulador para colocar un electrodo de estimulación. Pin de la preparación en el plato de grabación y lugar de la rama del nervio que contiene el nervio de excitación en el electrodo de succión.

Figura 20

Figura 21

(Tomado de: Mykles, DL, Medler, SA, Koenders, A., y Cooper, RL (2002) la proteína miofibrilar isoforma expresión se correlaciona con la eficacia sináptica de las fibras lentas de los músculos de las piernas y la garra de apertura de los cangrejos y las langostas del Diario. Biología Experimental 205 (4): 513 a 522).

Salina

Preparados disecados se mantienen en el cangrejo de río salina, solución de una versión modificada de Van Harreveld (en mM: 205 NaCl, 5,3 KCl; 13,5 CaCl2.2H2O; 2,45 MgCl2.6H2O, HEPES 5 se ajusta a pH 7,4).

Grabación PPSE intracelular

Para obtener una respuesta evocada, el axón de excitación es selectiva estimulado por un estimulador Grass. Una región del músculo primer partido es atravesado con electrodo afilado intracelular (20 a 30 la resistencia mOhm) lleno de 3 M KCl. Una etapa de la cabeza estándar y un amplificador para el registro intracelular puede ser utilizado, sin embargo se utilizó un modelo Axonclamp 2B (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.) y amplificador de 1 X etapa de la cabeza LU. La facilitación de corto plazo (STF) o diversos tipos de respuestas de otros deseado puede ser obtenido mediante la variación de las condiciones de estímulo. STF se obtiene dando un tren de 10 o 20 pulsos en 10 o 20 segundos de intervalo, respectivamente, en el nervio de excitación. La frecuencia de estimulación en el tren se puede variar (40, 60 y 80 Hz). Intrgrabaciones acelular EPSP se realizan rutinariamente en estos procedimientos estándar (Crider y Cooper, 1999, 2000;. Cooper et al, 1995b; Dudel, 1983; Sparks y Cooper, 2004; Desai-Shah y Cooper, 2009).

El músculo de apertura se divide en tres regiones generales: distal, central y proximal. A pesar de que el músculo abierto todo está inervado por una única neurona motora, la NMJs son estructuralmente diferentes y tienen diferencias regionales específicos en la eficacia sináptica en estas tres regiones en general (Cooper et al. 1995a, b). El tipo de fibra muscular fenotipo también se ha demostrado que ser diferente en estas regiones (Mykles et al. 2002). Por estas razones, las fibras más distales se utilizan, ya que son fácilmente demarcado por la coherencia entre los preparativos.

Figura 22

Grabación focal PPSE cuántico directamente sobre las regiones de identificación de las terminales nerviosas

Las varices sináptica se visualizan con el colorante vital 4-Di-2-Asp (Magrassi et al., 1987), que no afecta a la transmisión sináptica, en las concentraciones y tiempos empleados (5 M, 5 min de tratamiento, Cooper et al ., 1995b). Con microscopía de fluorescencia, la luz de un electrodo de registro macro-parche (Cooper et al, 1995c;.. St ¨ hmer et al, 1983) podría ser colocado directamente sobre una variz aislado. Para evocar la terminal nerviosa, el nervio motor de excitación se estimula como se mencionó anteriormente. Respuestas cuántica espontánea y evocada se puede grabar a lo largo de la cadena de varices visualizado, suavemente bajar la luz y el aumento de la vuelta de cada várices.

Los potenciales sinápticos son registrados a través de un electrodo de macro-parche esencialmente como se describe por Dudel, 1981; Wojtowicz et al. (1991) y Mallart (1993). Kimax de vidrio (diámetro exterior: 1,5 mm) fue detenido y pulido al fuego para producir puntas de parche con un diámetro interior de 10 a 20 micras. La luz del electrodo se llena con el medio baño. El amplificador es el mismo que el utilizado para las grabaciones intracelular antes mencionados. Electrodo y la resistencia del sello puede ser determinada por los impulsos de prueba que pasa corriente a través del electrodo. Resistencias sello varió desde 0,3 hasta 1,0 M0hm y la resistencia del electrodo varió desde 0,5 hasta 1,0 M.0. Resistencia del sello pueden ser monitoreados a lo largo de la grabación.

Recuento directo de eventos cuantal es posible con frecuencias baja estimulación. Para cada respuesta evocada, el número de eventos cuánticos se puede determinar. Por una serie de respuestas, el número total de eventos cuánticos se cuentan para calcular luego el contenido medio cuántico basado en estos conteos directos. Un método para calcular el contenido medio cuántica es que el número total de los cuantos y se dividen por el número total de respuestas (del Castillo y Katz, 1954). Existen otros métodos se pueden usar también se basa en la amplitud de pico o el área de la EPSPS (Cooper et al., 1995b).

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Cooper, A. S., Cooper, R. L.… More

Cooper, A. S., Cooper, R. L. Historical View and Physiology Demonstration at the NMJ of the Crayfish Opener Muscle. J. Vis. Exp. (33), e1595, doi:10.3791/1595 (2009).

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