निगरानी लारवल में हार्ट फंक्शन ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर शारीरिक अध्ययन के लिए

Summary

हम विभिन्न तरीके के लार्वा में दिल समारोह की निगरानी वर्तमान

Abstract

हम विभिन्न तरीकों वर्तमान लार्वा में हृदय समारोह रिकॉर्ड

Protocol

परिचय

दोनों कीड़े और रीढ़ के लिए दिल के समारोह में सेलुलर तंत्र आश्चर्यजनक समान हैं ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर जीन म्यूटेशनों कि मानव (टिकठी और Bodmer, 2004 सहित अन्य पशुओं में रोग राज्यों के लिए जिम्मेदार हैं की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है . पेरोन एट अल, 2009). अब इस विनयशील आनुवंशिक जीव में विभिन्न रोगों जा रहा है प्रेरित कर रहे हैं (. जॉनसन एट अल, 1998;. Ganetzky, 2000; Dowse एट अल, 1995 टिकठी और Bodmer, 2004, Ocorr एट अल, 2007a, ख) और आशा है कि के साथ समय जीन थेरेपी में सामान्य कार्य हासिल के लिए परीक्षण किया जा सकता है. इसके अलावा ड्रोसोफिला एक सेलुलर स्तर पर शारीरिक समारोह के लिए एक अच्छा मॉडल के रूप में सेवा .

ड्रोसोफिला दिल पर पिछले अध्ययनों से कई भ्रूण (Azpiazu और Frasch 1993, 1993 Bodmer, Bodmer एट अल 1990.) में विकासात्मक पहलुओं की ओर लक्षित किया गया है . वह और एडलर, 2001; मोलिना और क्रिप्स, 2001; Ponzielli एट अल, 2002;. SLAMA और Farkas, 2005 शारीरिक समारोह के कुछ अध्ययनों से पूर्व pupal pupal या वयस्क चरणों (एस्टन एट अल, 2001 में हुई; Wessells और Bodmer, 2004). हालांकि pupal चरण कायापलट और बदलते हार्मोन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अस्थिर विभिन्न biogenic amines के एक है. इसके अलावा दिल जो चर के लिए नियंत्रण जब myocytes के शरीर क्रिया विज्ञान की जांच करने के लिए मुश्किल साबित हो सकता है संरचनात्मक परिवर्तन के दौर से गुजर रहा है (Dulcis एट अल 2005;. जॉनसन एट अल 2002, मिलर, 1997; Papaefthimiou और Theophilidis, 2001). दिल के लार्वा चरण में myogenic हो जाना जाता है और आसानी से हटाया जा सकता है या बगल में छोड़ दिया, जबकि परिसंचारी हार्मोन या (Dowse एट अल 1995 पेप्टाइड्स के रूप में समझौता चर सीमा परिभाषित शारीरिक खारा द्वारा नहाया जा रहा है , जॉनसन एट अल 1997. , दासारि और कूपर, 2006; फेंग एट अल 2004).. लार्वा दिल की myogenic प्रकृति स्तनधारी दिल है कि वहाँ पेसमेकर है कि दिल के बाकी के लिए एक दिशा में तरल पदार्थ पंप स्नान अंगों में प्रभावी होना ड्राइव कर रहे हैं करने के लिए तुलनीय है. ड्रोसोफिला लार्वा दिल की chronotropic ionotropic और प्रकृति ब्याज की है क्योंकि यह एक साधन के रूप में तेजी से सेवा स्तनधारी दिल समारोह के लिए मौलिक सिद्धांतों और रोग के प्रभाव का परीक्षण के रूप में के रूप में अच्छी तरह सकता है एक के ईओण विनियमन जैसे सेलुलर शरीर क्रिया विज्ञान के लिए एक तुलनात्मक मॉडल विकसित करने में मदद पेसमेकर कोशिकाओं.

जॉनसन एट अल 1997, 2000;. निकोल्स एट अल 1999; Zornik एट अल लार्वा दिल बहुत biogenic amines और पेप्टाइड्स जो hemolymph में भिन्न खाद्य स्रोत या जानवर की आंतरिक स्थिति (दासारि और कूपर, 2006 के आधार पर करने के लिए अतिसंवेदनशील है 1999.). को संबोधित कैसे अंतर्जात या exogenous यौगिकों दिल mechanistically प्रभाव ब्याज की है. संभवत: अन्य जीवों पर कम प्रभाव के साथ उपन्यास कीटनाशकों अगर हम कीट शरीर विज्ञान और औषध विज्ञान के एक बेहतर समझ पाने के लिए विकसित किया जा सकता है.

लार्वा में न्यूरोट्रांसमीटर और हृदय modulators की कार्रवाई के सेलुलर तंत्र की तारीख के रूप में वहाँ ईओण धाराओं और चैनल लार्वा दिल है कि योगदान और पेसमेकर गतिविधि को विनियमित में मौजूद प्रकार के लिए पर्याप्त समझ नहीं किया गया है नहीं किया गया है वर्णित है. जहाँ तक हम जानते हैं, वहाँ कोई रिपोर्ट myocytes कोशिकी या intracellular रिकॉर्डिंग का दस्तावेजीकरण ईओण धाराओं का आकलन करने के लिए लार्वा ड्रोसोफिला में modulators की यंत्रवत प्रभाव का पता कर रहे हैं.

इस रिपोर्ट में हम विभिन्न तरीकों को पेश करने के लिए दिल और लार्वा दिल की दर शारीरिक गुणों रिकॉर्ड.

तरीकों

बरकरार लार्वा:

1. बरकरार पिटाई लार्वा दिल visualizing का एक अच्छा साधन एक खुर्दबीन के साथ सीधे है, तथापि, लार्वा अभी भी रहना संकुचन की गिनती के लिए पर्याप्त होना चाहिए. हम विकास के तरीकों को स्वतंत्र रूप से लार्वा के रूप में के रूप में अच्छी तरह से रोका लार्वा बढ़ने में दिल की दर पर नजर रखने के लिए. लोगों पर निर्भर करता है प्रयोगात्मक प्रश्न एक दृष्टिकोण अन्य की तुलना में अधिक उपयुक्त हो सकता है.
2. इन तरीकों अगर देखभाल करने के लिए निर्जलीकरण से बचने के लिए प्रयोग किया जाता है करने के लिए समय की विस्तारित अवधि में एक व्यक्ति का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इन विधियों भी आहार में शुरू औषधीय एजेंटों का आकलन या mutational लाइनों में विकास में या गर्मी झटका जीन की प्रेरण के साथ विभिन्न समय की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
3. पहली अनर्गल विधि हम "चींटी खेत" शब्द. इस तकनीक दो गिलास प्लेटों के लार्वा के भोजन की एक पतली परत के द्वारा अलग स्थान होते हैं. लार्वा ध्यान केंद्रित के एक विमान के भीतर visualized किया जा करने में सक्षम हैं. इस तकनीक को भी लार्वा में बिजली की गतिविधि circadian आंदोलन (कूपर और कूपर, 2004) द्वारा निगरानी के लिए इस्तेमाल किया गया था. संकीर्ण स्थान (1 के लिए 1 इस तकनीक दो गिलास प्लेट (; 75 x 25 मिमी जे मेल्विन मुक्त ब्रांड खुर्दबीन स्लाइड) के होते हैं.5) लार्वा के भोजन के एक पतली परत (जैसे नम मकई भोजन लुईस, 1960 के संशोधित संस्करण) इतना है कि लार्वा के लिए ध्यान केंद्रित के एक विमान के भीतर visualized किया जा करने में सक्षम हैं द्वारा अलग मिमी. आमतौर पर जेल electrophoreses प्लेटों के लिए इस्तेमाल किया Spacers (मिनी जैव रेड जेल, जीवन विज्ञान अनुसंधान, हरक्यूलिस, सीए 94547, संयुक्त राज्य अमेरिका) बहुत अच्छी तरह से काम करते हैं क्योंकि वे 1, 2 या 3 instar लार्वा चींटी खेत प्रक्रियाओं के साथ प्रयोग के लिए अलग मोटाई के साथ खरीदा जा सकता है. इसके अलावा एक विकल्प के लिए एक दिया मोटाई का एक ठोस प्लास्टिक का उपयोग करें और बाहर रेंगने अंतरिक्ष के रूप में उपयोग करने के लिए क्षेत्र में कटौती है.
4. इच्छित मोटाई के प्लास्टिक में प्रयोग किया जाता है कांच के दो प्लेटों के किनारों से बाहर रेंगने से लार्वा को रोकने के लिए. 20 से 45 डिग्री पर थोड़ा झुकाव मंच लार्वा रहने के लिए कारण बनता है, उनके सिर के साथ, समय के बहुमत नीचे ओर इशारा किया और उनके पूंछ spiracles युक्त भोजन के ऊपर या भोजन परत में एक हवाई यात्रा के भीतर बाहर.
5. यह "चींटी फार्म तकनीक" भी समान मोटाई के भोजन के साथ एक ही विमान के भीतर वीडियो इमेजिंग की अनुमति देता है. इस विन्यास में लार्वा के भोजन भर में क्रॉल नहीं करते हैं, लेकिन इसके बजाय खाने के लिए और 2 डी विमान में क्रमिक कदम के आसपास. सफेद रोशनी एक दर्पण के साथ खुर्दबीन मंच के नीचे से अनुमान है इतना है कि यह दिल या ट्रेकिआ दो जो दिल अनुबंध जबकि चाल का सबसे अच्छा इसके विपरीत के लिए तदनुसार ले जाया जा सकता है. एक खुर्दबीन (समायोज्य 0,67 करने के लिए 4,5 ज़ूम, विश्व परिशुद्धता उपकरण, मॉडल 501,379) प्रयोग किया जाता है. एक 2X आधार उद्देश्य और 0.5X उद्देश्य ट्यूब पर्याप्त स्थानिक संकल्प और बढ़ाई हासिल करने के लिए 0.5 सेमी आयत द्वारा एक 1cm कवर करने के लिए प्रयोग किया जाता है. Trinocular माउंट के माध्यम से एक कैमरा घुड़सवार (; विश्व प्रेसिजन उपकरण Mintron, एमटीवी) प्रयोग किया जाता है. परिवेश तापमान 20 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा है

   
   चित्रा 1 एक अक्षुण्ण 3 ^Rd instar लार्वा के पृष्ठीय दृश्य. ट्रेकिआ के कारण दिल से संलग्नक के खींच आंदोलन के लिए हृदय की दर का पालन करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

6. आज़ादी से चलती जानवर की निगरानी के लिए एक जानवरों के सिर पर एक पतला भोजन मिश्रण की कुछ बूँदें जगह कर सकते हैं. यह एक गिलास पकवान में किया जाना चाहिए ताकि संचरित प्रकाश दिल ट्यूब visualizing के लिए लार्वा के माध्यम से पारित कर सकते हैं. एक ही सेट के रूप में ऊपर वर्णित माइक्रोस्कोपी के दिल की धड़कन घड़ी और मायने रखता है प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
7. एक और दृष्टिकोण एक गिलास स्लाइड पर डबल छड़ी टेप का उपयोग और टेप (बेकर एट अल., 1999) के लार्वा के उदर पक्ष रखने के द्वारा एक स्थान पर लार्वा को नियंत्रित करने के लिए है. हालांकि इस दृष्टिकोण अच्छी तरह से काम नहीं अगर टेप गीला हो जाता है जब लार्वा खिला करता है. से बचने के लिए टेप हो रही गीला एक वेसिलीन (एक छोटी सुई के लार्वा के आधार पर चारों ओर और टेप के किनारे के आसपास इंजेक्शन) का उपयोग कर सकते हैं. यहाँ एक समय पर ध्यान केंद्रित विमान में लार्वा पीछा या जब यह एक डिश पर बढ़ रहा है बिना लार्वा फ़ीड कर सकते हैं. यदि किसी की इच्छा लार्वा मुक्त करने के लिए टेप और सिक्त किया जा सकता है यह जानवर को यह चिपचिपाहट हारता.

यदि एक प्रयोग के लिए मुक्त लार्वा में कोई दिलचस्पी नहीं है एक gluing द्वारा लार्वा निरोधक एक गिलास स्लाइड करने के लिए पशु की स्थायी विधि का इस्तेमाल कर सकते हैं. सुपर गोंद विधि के उपयोग के साथ, पशु खाने और यहां तक ​​कि एक नम समाधान में शामिल हो जबकि शेष गिलास को कवर पर्ची पालन कर सकते हैं. प्रक्रियाएं हैं:

1. एक साफ स्लाइड ले लो और इसे का एक छोर पर एक कवर पर्ची जगह.
2. Superglue के कवर पर्ची के एक कोने में एक छोटा सा थपका रखो.
3. अपने ड्रोसोफिला लार्वा का पता लगाएँ और यह टेस्ट ट्यूब से हटा.
4. एक पेट्री डिश में लार्वा प्लेस हैं और यह पानी की एक छोटी राशि के लिए किसी भी अतिरिक्त भोजन हटाने से कुल्ला.
5. भिगोएँ में एक छोटे से ऊतक या कागज तौलिया के कोने के साथ भोजन reaming.
6. धीरे चिमटी के साथ लार्वा लेने और अपनी स्लाइड पर यह जगह अपने कवर पर्ची से विपरीत छोर पर.
7. खुर्दबीन के नीचे स्लाइड प्लेस और समायोजित लार्वा पर अपने बख्शी. लार्वा अपनी पीठ का सामना करना पड़ ऊपर के साथ अपने पेट पर किया जाना चाहिए. क्योंकि उनकी पीठ दो "रेसिंग धारियों" जो ट्रेकिआ सुविधा आप लार्वा के दो पक्षों के बीच भेद कर सकते हैं. पेट बेहोश क्षैतिज बहुत ठीक काले बालों के साथ साथ चल grooves है.
8. यदि लार्वा गलत तरीके से सामना करना पड़ रहा है, बस धीरे यह अपने चिमटी के साथ flipping द्वारा सही तरीके से बारी.
9. साथ चिमटी का एक नया सेट गोंद के लिए विशेष रूप से प्रयोग किया जाता अपने कवर के अंत में ड्रॉप से ​​एक छोटे से थपका पर्ची और विपरीत अंत के कोने पर जगह ले. तुम गोंद का एक fractionally राशि का उपयोग करना चाहिए, बस पर्याप्त चिमटी के सिर को कवर. इसके अलावा, यकीन है कि तुम दूर अपने चिमटी के सिरों को मिटा इतना है कि वे बंद चिपके नहीं बन.
10. माइक्रोस्कोप के तहत, डबल यकीन है कि लार्वा सही स्थिति में अभी भी है बनाने की जाँच करें. यदि यह खत्म कर दिया गया है देखने के लिए, आठ कदम है.
11. अब, लार्वा संभाल के लिए इस्तेमाल किया चिमटी के साथ, ऊपर लार्वा लेने औरयह गोंद की ताजा पैच पर धीरे जगह. यकीन है कि काले मुंह हुक के पास या कवर पर्ची के किनारे पर स्थित हैं और न तो वे या भूरे रंग spiracles गोंद के साथ संपर्क में आते हैं.
12. ध्यान से लार्वा पर नीचे प्रेस करने के लिए इसे बाहर समतल.
13. अब है कि लार्वा जगह में है, तो आप पदार्थ जो आप उन्हें परीक्षण करना चाहते हैं प्रशासन कर सकते हैं.
14. यह अच्छा है अगर आप एक सिरिंज का उपयोग करने के लिए पदार्थ आकर्षित और इसे छोटी खुराकों में लार्वा सिर से इसे निगलना करने के लिए जगह पूरा किया है.
15. अंत में, हृदय की दर को एक मिनट में spiracles की दालों की संख्या की गणना के द्वारा देखा जा सकता है है.

सीटू: विच्छेदन और हृदय की दर की गणना :

तैयारी मध्य वेंट्रल अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ भट्ठा कर रहे हैं और फ्लैट टिकी. तैयारी पकवान चुंबकीय टेप के साथ एक गिलास स्लाइड (VWR) (उत्तम जाने - खुदरा बाहर खरीदता) एक तरफ का पालन शामिल है. चुंबकीय पट्टी के केंद्र में एक छेद तैयारी प्रेषित प्रकाश के साथ देखा जा करने की अनुमति देता है. विदारक पिंस (ललित वैज्ञानिक उपकरण, WA) तुला और पेपर क्लिप के लिए सरेस से जोड़ा हुआ. पेपर क्लिप चुंबकीय टेप पर आसानी से चतुराई कर रहे हैं जगह में filleted तैयारी पकड़. रिकॉर्डिंग पकवान की इस प्रकार पहले से जोंक वेंट्रल तंत्रिका कॉर्ड (मुलर एट अल., 1981) से अलग ganglia लगाए के उपयोग के लिए वर्णित किया गया है .

1. विच्छेदन प्लेट पर बरकरार 3 instar लार्वा रखें. अपने उदर पक्ष पर लार्वा घुमाएँ जब तक ट्रेकिआ अब छल्ली के माध्यम से दिखाई दे रहे हैं.
2. बरकरार लार्वा में चार पिन प्लेस. दो पिनों मुँह हुक के दोनों तरफ जाओ, और दो पिनों spiracles के दोनों तरफ जाओ.
3. खारा जोड़ें, और एक क्षैतिज चीरा सिर पिन से एक छोटी सी दूरी बना, तो अनुदैर्ध्य अक्ष की लंबाई नीचे एक क्षैतिज चीरा के साथ जारी है.
4. सच्चे दिल से एक कम दूरी में कटौती बंद करो. सच्चे दिल के आसपास और पक्ष के साथ spiracles कट.
5. एक पृष्ठीय पिन लिफ्ट और छल्ली नीचे हुक. पिन का प्रयोग शरीर गुहा खोलने के लिए और इसे खुला फैल. शेष पिन के साथ इस दोहराएँ.
6. हिम्मत निकालें, या तो ट्रेकिआ या दिल को नुकसान नहीं सावधान किया जा रहा है. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कुछ संरचनाओं दिल से जुड़े होते हैं और यह नुकसान अगर हटाया जा सकता है चाहिए. कई वसा शरीर और मस्तिष्क में शामिल हैं. यदि आप दिल देख सकते हैं बढ़ाया जा रहा है जबकि हिम्मत हटाने के लिए, तुरंत कि संरचना को हटाने के प्रयास में बंद हैं.

दिल और अब उजागर प्रयोगात्मक शर्तों के जोखिम के लिए तैयार है.

चित्रा 2 3 ^Rd instar के ventral विच्छेदन के लिए दिल को सीधे देखने . अपनी पीठ पर जानवरों के लगाए बाद विच्छेदन के लिए सीधे या सीएनएस बिना बरकरार दिल पर यौगिकों लागू करने के लिए प्रयोग किया जाता है. लघु तीर इंगित करता है जहां दिल और महाधमनी transected पृष्ठीय पोत के अध्ययन के लिए अलग हो रहे हैं (नीचे देखें). Tr, ट्रेकिआ, सपा Spiracles, एच, हार्ट, ए ओ, महाधमनी.

यह विच्छेदन तकनीक को सीधे ड्रोसोफिला लार्वा (गुजरात और सिंह, 1995) के दिल पर औषधीय एजेंटों का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. विच्छेदन समय 3-6 मिनट है. तैयारी के लिए आराम करते समय विच्छेदन के बाद 3-5 मिनट के लिए HL3 खारा में स्नान की अनुमति दी है.

HL3 खारा ध्यान 7.2 पीएच पर से एचआर उच्च pH में धीमा और कम पीएच (Badre एट अल., 2005) में गति नियंत्रित किया गया. गुजरात और सिंह (1995) दिल के औषधीय विश्लेषण के लिए 7.0 पीएच इस्तेमाल किया और यह भी बनाए रखा व्यवहार्यता दिखाया. इन परीक्षणों के दौरान खारा खारा repetitively इंजेक्शन के माध्यम से समाधान का आंदोलन द्वारा वातित बने रहे, एक 21 गेज सुई के माध्यम से एक बीकर में.

या तो प्रत्यक्ष टिप्पणियों या इस्तेमाल किया जा सकता है छवियों वीएचएस एक स्क्रीन पर या प्लेबैक के लिए एक डिजिटल कैमरा टेप पर दर्ज कर सकते हैं मानव संसाधन यों. एक photodiode विधि पहले वर्णित किया गया है (दासारि और कूपर, 2006).

गर्मी झटका एक्सपोजर:

1. लार्वा काटना.
2. कवर प्लेट पर dissected तैयारी रखें.
3. हीट पानी स्नान.
4. एक कवर की थाली पर एक तापमान जांच तैरते द्वारा स्नान के तापमान के अंदर की जाँच करें.
5. जब तापमान संतोषजनक, जगह तैयार करने और स्नान में कवर की थाली है.
6. समय की एक वांछित राशि के लिए तैयारी में छोड़ दो और जब समाप्त हटायें.

एक का उपयोग कर सकते हैं जो हर गर्मी नाड़ी और तापमान उनके प्रयोग के लिए आवश्यक है.

विद्युत गति से दिल ड्राइव:

1. एक सिरिंज का उपयोग कर डाला और खुले अंत पर बंद और कमरे के तापमान (21 डिग्री सेल्सियस) ड्राइंग इलेक्ट्रोड में खारा (HL3) मक्खी द्वारा एक फोकल इलेक्ट्रोड (व्यास में लगभग 20 microns) भरें. जोड़तोड़ में इलेक्ट्रोड पर्वत, कि वें की जाँचई तार इलेक्ट्रोड के अंदर खारा में है और उत्तेजक औधधि बंद कर दिया है.
2. विदारक माइक्रोस्कोप पर एक ड्रोसोफिला लार्वा 3 instar लार्वा दिल dissected तैयारी प्लेस और यह जगह में सुरक्षित हैं . तैयारी के खारा, और पिन की तैयारी के पक्षों के साथ संपर्क से बचने के लिए सावधान में ग्राउंडिंग तार प्लेस.
3. जोड़तोड़ का प्रयोग दिल के शीर्ष पर इलेक्ट्रोड की नोक की स्थिति, माइक्रोस्कोप के ध्यान केंद्रित का समायोजन के रूप में की जरूरत है. इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए सबसे अच्छा तरीका इलेक्ट्रोड पर ध्यान केंद्रित करते हुए टिप नीचे की ओर चलती है.
4. जब टिप करने की स्थिति में माना जाता है, उत्तेजक औधधि (मॉडल S9 घास उपकरण, Quincy, मैसाचुसेट्स, संयुक्त राज्य अमेरिका) आवृत्ति के साथ चालू किया जाना चाहिए 2 हर्ट्ज पर, अवधि पर 0.5 1 एमएस और सबसे कम सेटिंग पर वोल्टेज. देरी सेटिंग 12 और 14 के बीच होना चाहिए.
5. जबकि दिल ताल देख, आवृत्ति लगभग 3 हर्ट्ज बदल जाना चाहिए और वोल्टेज धीरे धीरे वृद्धि हुई है जब तक दिल ताल देखा उत्तेजक द्वारा उत्पादित ताल से मेल खाती है. आम तौर पर dissected मक्खी दिल लगभग 2 हर्ट्ज की एक आवृत्ति पर धड़क रहा है, इसलिए जब उत्तेजित ताल आंतरिक दर से अधिक है, दिल में देखा जाएगा, दिल को सामान्य की तुलना में एक तेज दर से हरा देखा जाएगा. वोल्ट कोशिका क्षति उच्च voltages पर होते हैं, तैयारी बेकार बना सकते हैं के रूप में लगभग 20 वी पार नहीं करना चाहिए. आमतौर पर, एक दूरी और दिल पर बनाया मुहर पर निर्भर करता है 2 और 8 वी के बीच दिल, को प्रोत्साहित कर सकते हैं.
6. यदि अधिकतम वोल्टेज तक पहुँच है और कोई प्रभाव नहीं देखा है, polarity उलट हो सकता है. यदि यह भी काम नहीं करता है, जांच करने के लिए बेहतर दिल पर एक कनेक्शन स्थापित करने के लिए स्थानांतरित किया जाना चाहिए.
7. एक बार एक उत्तेजना संचालित ताल की स्थापना की है, ताल आवृत्ति और अवधि सेटिंग्स अलग से चालाकी से किया जा सकता है. यह ज्ञात किया जा चाहिए, तथापि, कि 4 हर्ट्ज से ऊपर आवृत्तियों tetany में दिल रख सकते हैं. विभिन्न alcohols और औषधीय एजेंटों और जोड़ा जा सकता है अंतराल जंक्शनों पर उनके प्रभाव एक बार इच्छित ताल की स्थापना की है देखा जा सकता है. अवरोधित अंतराल जंक्शनों चालू नहीं आचरण और प्रचार ताल संघर्ष करेंगे.
   
   
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क्षेत्र क्षमता उपाय:

1. ग्लास इलेक्ट्रोड Kimax ग्लास (बाहरी व्यास: 1.5 मिमी) से बना रहे हैं. शीशे की नली खींच लिया और आग - पॉलिश के अंदर 10 से 20 सुक्ष्ममापी को लेकर diameters के साथ पैच सुझावों का उत्पादन.
2. इलेक्ट्रोड के लुमेन स्नान मध्यम से भरा है. एम्पलीफायर और एक कंप्यूटर करने के लिए लाइन पर रिकॉर्डिंग नीचे रिकॉर्डिंग के लिए intracellular इस्तेमाल किया है कि के रूप में ही है.
3. एक 'मैक्रो - पैच' रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के लुमेन (Stühmer एट अल., 1983) सीधे दिल के एक क्षेत्र में रखा गया है. मांसपेशी फाइबर की सहज पेसिंग एक क्षेत्र संभावित है कि फोकल इलेक्ट्रोड के साथ नजर रखी जा सकता है उपज.
4. देखभाल करने के लिए धीरे कम लुमेन और यह नजर रखी जा दिल के प्रत्येक क्षेत्र में स्थापना द्वारा दिए जाने की जरूरत है. क्षमता एक मैक्रो - पैच इलेक्ट्रोड के माध्यम से दर्ज कर रहे हैं.

दिल की दर और निगरानी बिजली घटनाओं की प्रत्यक्ष गिनती संभव है. स्नान मीडिया बदलकर जबकि इन क्षमता रिकॉर्डिंग भी गधे क्षेत्र की क्षमता पर प्रभाव संभव है.

Intracellular क्षमता उपाय:

Myocytes दिल के एक क्षेत्र तेज intracellular (20 से 30 mOhm प्रतिरोध) इलेक्ट्रोड एम 3 KCl के साथ भर के साथ impaled है transmembrane क्षमता की निगरानी करने के लिए. Intracellular रिकॉर्डिंग के लिए एक मानक सिर मंच और प्रवर्धक इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन हम एक मॉडल का इस्तेमाल किया 2B Axonclamp (आण्विक डिवाइसेज, Sunnyvale, CA, संयुक्त राज्य अमरीका) एम्पलीफायर और 1 एक्स लू सिर मंच. ऐसा प्रतीत होता है कि दिल की दुम का अंत और अधिक कठोर है और यह है कि जहां पेसमेकर कोशिकाओं रहते है के बाद से संकुचन इस क्षेत्र में समय के बहुमत (Badre एट अल, 2005 शुरू, दासारि और 2006 कूपर, दासारि एट अल, 2007 . ).

Materials

Dissection tools: Fine #5 tweezers and fine scissors (all obtained from Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139) Dissecting microscope with zoom function for dissection and counting heart rate. For focal stimulation of the heart this is needed as well. For extracellular and intracellular recordings a compound microscope with upright objectives (4 x and 20X) is used. Standard intracellular amplifier and A/D board for on line recording to a computer. Electrical signals are recorded on line to a PowerLab/4s interface (ADInstruments, Australia). We use standard software from ADInstruments named Chart or Scope. Chemicals: All saline chemicals are obtained from Sigma chemical company (St. Louis, MO). For intracellular recordings we use glass capillary tubing (catalogue # 30-31-0 from FHC, Brunswick, ME, 04011, USA) and for focal macropatch recording and stimulating electrodes we use Kimax-51, Kimble Products Art. No. 34502, ID 0.8-1.1mm, length 100mm. The intracellular electrode should have a resistance of 20 to 30 mOhm. The macropatch electrode is constructed by breaking off the tip of the glass after a fine tip was made from an electrode puller. The broken off tip needs to be a clean perpendicular break about 20μM in diameter. The tip is then heat polished to about 10μM inner diameter for the focal extracellular recording. For the stimulating electrode to drive the heart we use a final tip of about 20-50 μM in diameter. The shaft of the electrode is run over a heating element to cause it to bend about 45 degrees with a gradual bend. This produces a flat or perpendicular electrode lumen over the heart tube as the angle with the micro-manipulator will produce about another 45 degrees to the preparation.