ניטור הלב לתפקד הזחל תסיסנית melanogaster ללימודים פיזיולוגיים

Summary

אנו מציגים דרכים שונות כדי לפקח על תפקוד הלב של הזחל

Abstract

אנו מציגים שיטות שונות כדי להקליט תפקוד הלב של הזחל

Protocol

מבוא

המנגנונים הסלולר בתפקוד הלב הן חרקים ובעלי חוליות דומות להפליא תסיסנית melanogaster נמצאים בשימוש על חקירת מוטציות גנטיות אשר אחראים מדינות המחלה בבעלי חיים אחרים, כולל בני אדם (ביר ו בודמר, 2004,.. פרון ואח', 2009). עכשיו למחלות שונות נמצאים המושרה באורגניזם זה גנטי ממושמע (לאתר את המים et al, 1995;. Johnson et al, 1998;. Ganetzky, 2000; ביר ו בודמר, 2004;. Ocorr et al, 2007a, b) ועם תקווה בריפוי גנטי זמן ניתן לבדוק עבור להחזיר תפקוד נורמלי. בנוסף תסיסנית לשמש מודל טוב עבור פונקציה פיזיולוגית ברמה התאית.

רבים מן המחקרים האחרונים על תסיסנית לב כבר ממוקד כלפי היבטים התפתחותיים בעובר (Azpiazu ו Frasch 1993, בודמר 1993, בודמר et al. 1990). מספר מחקרים של הפונקציה הפיזיולוגית התרחש בשלבים טרום גלמי, גלמי או מבוגר (אשטון et al, 2001;. הוא אדלר, 2001; מולינה ו קריפס, 2001; Ponzielli et al, 2002;. Sláma ו פרקש, 2005; Wessells ו בודמר, 2004). עם זאת בשלב גלמי הוא אחד מטמורפוזה והורמונים שינוי, כמו גם תנודות אמינים ביוגניים שונים. גם הלב עוברת שינוי מבני אשר יכול להוכיח להיות קשה לשלוט על משתנים כאשר חוקרים בפיזיולוגיה של myocytes (Dulcis et al 2005;. Johnson et al 2002;. מילר, 1997; Papaefthimiou ו Theophilidis, 2001). הלב הוא ידוע myogenic בשלב הזחל והוא יכול בקלות להסיר או שמאלה באתרו בעת היותו שטוף על ידי תמיסת מלח פיזיולוגית מוגדרת להגביל משתנים הרכבה כגון הורמונים במחזור או פפטידים (לאתר את המים et al 1995;.. Johnson et al 1997 ; Dasari וקופר, 2006; פנג et al 2004).. אופי myogenic הלב הזחל דומה ללב יונקים שיש קוצבי לב כי כונן את שאר הלב לשאוב נוזל בכיוון להיות יעיל באיברים ים. אופי chronotropic ו ionotropic הלב תסיסנית הזחל מעניין שכן הוא יכול לשמש כאמצעי מהיר לבחון עקרונות יסוד ותופעות פתולוגיות על תפקוד הלב יונקים, כמו גם לעזור לפתח מודל השוואתי עבור הפיזיולוגיה הסלולר כגון רגולציה של יונית קוצב לב תאים.

הלב הזחל הוא רגיש מאוד אמינים ופפטידים הביוגניים אשר hemolymph להשתנות בהתאם למקור מזון או מצב פנימי של החיה (Dasari וקופר, 2006; Johnson et al 1997, 2000,.. ניקולס et al 1999; Zornik ואח' . 1999). בהתייחסו כמה תרכובות אנדוגני או אקסוגני השפעה על הלב באופן מכניסטי הוא עניין. הדברה הרומן אולי עם פחות תופעות על אורגניזמים אחרים ניתן לפתח אם אנחנו להשיג הבנה טובה יותר של הפיזיולוגיה פרמקולוגיה חרקים.

המנגנון התאי של פעולה של נוירוטרנסמיטורים מאפננים לב ב הזחל לא תוארו עד כה כמו לא היתה הבנה מספקת של זרמים יוניים סוגי הערוץ הנוכחי בלב הזחל שתורמים ולהסדיר פעילות הקוצב. ככל שאנחנו יודעים, אין דיווחים המתעדים הקלטות תאית או תאיים של myocytes להעריך זרמים יוניים לכתובת תופעות מכניסטית של מאפננים של הזחל תסיסנית.

בדוח זה אנו מציגים שיטות שונות כדי לתעד את קצב הלב ואת המאפיינים הפיזיולוגיים של הלב הזחל.

שיטות

אינטקט זחלים:

1. אמצעי הדמיה טובה של לב פועם שלם הזחל הוא ישירות עם מיקרוסקופ, אולם הזחל חייב להישאר עדיין מספיק כדי לספור את הצירים. אנו שיטות פיתוח לעקוב אחר קצב הלב של נעה בחופשיות, כמו גם הזחלים הזחלים מאופקת. בהתאם לאלה גישה ניסויית שאלה אחת עשוי להיות מתאים יותר מאשר אחרים.
2. גישות אלה יכול לשמש כדי לעקוב יחיד על פרקי זמן ארוכים אם הטיפול משמש כדי למנוע התייבשות. שיטות אלה יכולים לשמש גם כדי להעריך סוכני תרופתי הציג בתזונה או לבחון בתקופות שונות בהתפתחות בקווים מוטציוני או עם אינדוקציה של גנים להלם חום.
3. השיטה רסן הראשונה שאנחנו המונח "משק הנמלה". טכניקה זו מורכבת משני לוחות זכוכית במרווחים לגזרים על ידי שכבה דקה של מזון הזחלים. הזחלים יכולים להיות דמיינו בתוך מטוס אחד להתמקד. טכניקה זו שימשה גם כדי לפקח על תנועת הפעילות החשמלית בתוך היממה הזחל (קופר קופר, 2004). טכניקה זו מורכבת משני לוחות זכוכית (שקופיות מיקרוסקופ, 75 x 25 מ"מ; ג'יי ברנד מלווין פריד) במרווחים צרים (1 ל -1.5 מ"מ) לגזרים על ידי שכבה דקה של מזון הזחלים (ארוחה, לדוגמא: תירס לח גירסה שונה של לואיס, 1960), כך הזחלים מסוגלים להיות דמיינו בתוך מטוס אחד להתמקד. מפרידי נפוץ צלחות ג'ל electrophoreses (מיני ג'ל ביו רד; לחקר מדעי החיים, הרקולס, CA 94547, ארצות הברית) לעבוד טוב מאוד שכן הם ניתן לרכוש עם עובי שונות לשימוש עם 1, 2 או 3 נמלה instar הזחלים נהלים החווה. כמו כן אופציה היא להשתמש פלסטיק מוצק של עובי נתון לחתוך את האזור שישמש חלל זחילה.
4. כדי למנוע הזחלים מן לזחול החוצה מן הקצוות של שני לוחות של זכוכית פלסטיק בעובי הרצוי משמש. מטה מעט את הפלטפורמה ב 20-45 מעלות גורם הזחלים להישאר, רוב הזמן, עם הראש כלפי מטה והצביע והזנב שלהם המכיל את spiracles לעיל מזון או בתוך מעבר האוויר בשכבת מזון.
5. זה "טכניקה Ant Farm" גם מאפשר הדמיה וידאו בתוך מטוס אחד עם אוכל של עובי אחיד. בתצורה זו הזחלים אינם נוטים לזחול לאורך כל האוכל, אלא לאכול ולעבור בהדרגה סביב המטוס 2 ד. אור לבן מוקרן מן החלק התחתון של הבמה מיקרוסקופ עם מראה, כך שניתן להעביר בהתאם עבור הניגוד הטוב של הלב או שני אשר קנה הנשימה להזיז בעוד החוזים הלב. מיקרוסקופ (זום מתכווננת 0.67-4.5; Precision כלי העולמי; דגם 501379) משמש. מטרת הבסיס 2X צינור אובייקטיבי 0.5X משמש כדי לקבל רזולוציה מרחבית מספיק ההגדלה לכסות 1cm על ידי מלבן 0.5 ס"מ. מצלמה רכוב דרך הר trinocular משמש (Mintron, MTV, כלי העולם Precision). לטמפרטורת הסביבה נשמר בטמפרטורה של 20 ° C.

   
   באיור 1. התצוגה הגב של הזחל שלם instar 3 ^rd. התנועה של קנה הנשימה עקב משיכת המצורפים מהלב משמש כדי לבחון את קצב הלב.

6. כדי לעקוב אחר בעלי החיים לנוע בחופשיות אפשר מקום כמה טיפות של תערובת מזון לדלל מעל הראש החיות. זה צריך להיעשות בכלי זכוכית כל כך את האור המועבר יכול לעבור דרך הזחלים עבור לדמיין את הצינור לב. מיקרוסקופיה אותו להקים כמתואר לעיל ניתן להשתמש כדי לראות את פעימות הלב ולקבל שחשוב.
7. גישה נוספת היא לרסן את הזחל למיקום אחד באמצעות קלטת מקל כפול בשקופית זכוכית הצבת הצד הגחוני של הזחל לקלטת (Baker et al., 1999). אולם גישה זו אינה פועלת היטב אם הקלטת נרטב כאשר להאכיל את הזחלים. כדי למנוע את הקלטת מקבל אחד רטוב יכול להשתמש וזלין (מוזרק מתוך מחט קטנה מסביב לבסיס של הזחלים ובשולי קלטת). כאן אפשר להאכיל את הזחל לאורך זמן מבלי לרדוף את הזחלים לתוך המטוס להתמקד או כאשר הוא נע על צלחת. אם אדם רוצה לשחרר את הזחלים הקלטת ניתן לחלח והוא מאבד דביקות של אותה החיה.

אם אף אחד אינו מעוניין לשחרר את הזחלים לניסויים אפשר להשתמש בשיטה קבועה של הרחקה הזחל על ידי הדבקה החיה לשקופית זכוכית. בעזרת השימוש בשיטה דבק סופר, בעל החיים יכול לאכול אפילו להיות מכוסה פתרון תוך שמירה על לחות דבק להחליק את מכסה זכוכית. הנהלים הם:

1. קח שקופיות נקי במקום להחליק לכסות בקצה אחד של זה.
2. שים טיפה קטנה של דבק מגע באחת מפינות להחליק את המכסה.
3. אתר הזחל תסיסנית שלך להסיר אותו במבחנה.
4. מניחים את הזחל בצלחת פטרי ולשטוף אותו עם כמות קטנה של מים כדי להסיר עודפי המזון.
5. משרים את reaming מזון עם הפינה של רקמה קטנה או מגבת נייר.
6. בעדינות להרים את הזחל עם פינצטה ולמקם אותו בשקופית בצד הנגדי להחליק הכיסוי שלך.
7. מניחים את השקף מתחת למיקרוסקופ ולהתאים שלך משאיל על הזחל. הזחל צריך להיות על הבטן עם הגב כלפי מעלה מול שלה. ניתן להבחין בין שני הצדדים של הזחל כי גבם תכונה שני "פסים מירוץ" המהווים את קנה הנשימה. בבטן יש חריצים אופקיים קלוש פועל לאורכו עם שערות שחורות יפה מאוד.
8. אם הזחל פונה בדרך לא נכונה, פשוט להפוך את הדרך הנכונה על ידי מרפרף בעדינות על כך עם פינצטה שלך.
9. עם קבוצה חדשה של פינצטה בשימוש במיוחד עבור דבק לקחת טיפה קטנה מירידה בסוף הכיסוי שלך להחליק ומקם אותה בפינת בקצה השני. אתה צריך להשתמש בכמות קמעה של דבק, רק מספיק כדי לכסות את ראשו של פינצטה. כמו כן, הקפד לנגב את הקצוות של פינצטה שלך, כך שהם לא הופכים עצומות בחוזקה.
10. מתחת למיקרוסקופ, בדוק כדי לוודא הזחל עדיין במקום הנכון. אם זה הפך יותר, לראות צעד שמונה.
11. עכשיו, עם פינצטה השתמשו כדי לטפל הזחל, להרים את הזחל והמקום אותו בעדינות על חלקת הטרי של דבק. ודא ווים הפה שחור ממוקמים בסמוך או בקצה להחליק את מכסה וגם הם או spiracles חום לבוא במגע עם הדבק.
12. לחץ בזהירות על הזחל לשטח זה.
13. כעת הזחל הוא במקום, אתה יכול לנהל את החומרים אשר ברצונך לבדוק אותם.
14. מטרה זו מושגת בצורה הטובה ביותר אם אתה משתמש במזרק כדי לשאוב את החומר ולשים אותו במנות קטנות על ידי ראשו של זחל שזה להבלע.
15. לבסוף, קצב הלב יכול להיות שנצפו על ידי ספירת פולסים של spiracles בתוך דקה אחת.

באתרו: Dissection והספירה קצב הלב:

ההכנות הן חריץ לאורך ציר אמצע הגחון האורך והצמיד שטוח. המנה כללה הכנה זכוכית שקופית (VWR) עם סרט מגנטי (Best רוכשת קמעונאית מחוץ לתת) דבק בצד אחד. חור במרכז רצועת המגנטי מאפשר הכנה כדי לראות עם האור המועבר. סיכות הביתור (כלים מדעיים פיין, וושינגטון) הן כפופות מודבק מהדקי נייר. הסרטונים נייר לתמרן בקלות על הסרט המגנטי להחזיק הכנה נשלף במקום. סוג זה של הקלטה צלחת תוארה בעבר עבור ניצול מצמיד הגרעינים שבודדו חוט עלוקה הגחון העצב (Muller et al., 1981).

1. המקום ללא פגע הזחל 3 instar בצלחת לנתיחה. סובב הזחל בצד הגחון שלה עד הנשימה אינן גלויות דרך לציפורן.
2. מקום ארבע סיכות ב הזחל ללא פגע. שתי סיכות לצאת משני צדי ווים הפה, שתי סיכות לצאת משני צדי spiracles.
3. מוסיפים מלח, ולעשות חתך אופקי במרחק קטן מן סיכות ראש, ולאחר מכן להמשיך עם חתך אופקי לאורכו של ציר האורך.
4. עצור חיתוך מרחק קצר מן הלב האמיתי. חותכים סביב הלב האמיתי לצד spiracles.
5. להרים את אחד הפינים הגב ומחבר אותו מתחת לציפורן. השתמש סיכה כדי לפתוח את חלל הגוף להפיץ אותו פתוח. חזור על פעולה זו עם הפינים הנותרים.
6. הסר את האומץ, נזהר לא לפגוע או קנה הנשימה או הלב. יצוין כי חלק מבני המחוברים ללב עלולה לגרום נזק אם יוסר. אלה כוללים מספר גופים שומן, לבין המוח. אם אתה יכול לראות את הלב להיות מתוח תוך הסרת אומץ, להפסיק לאלתר מנסה להסיר את המבנה.

הלב הוא חשוף עכשיו ומוכן חשיפה תנאי הניסוי.

איור 2. לנתיחה הגחון של 3 ^rd instar כדי לראות את הלב ישירות. הצמדת של החיה על גבו לאחר דיסקציה משמש ישירות להחיל את תרכובות על הלב עם או בלי מערכת העצבים המרכזית ללא פגע. החץ הקטן מציין היכן הלב ואבי העורקים מופרדים עבור transected מחקרים כלי הגבי (ראה להלן). Tr, קנה הנשימה, Sp, Spiracles; ח, לב; AO, אבי העורקים.

טכניקה זו לנתיחה שימש ישירות להעריך סוכני תרופתי על הלב של הזחלים תסיסנית (גו ו סינג, 1995). בפעם לנתיחה הוא 3-6 דקות. ההכנה מותר להירגע בזמן טובל מלוחים HL3 3-5 דקות לאחר דיסקציה.

מלוחים HL3 נשלט בתשומת להיות ב-pH 7.2 מאז HR מאט ב-pH גבוה מזרז ב-pH נמוך (Badre et al. 2005). גו ו סינג (1995) השתמשו pH 7.0 לניתוח תרופתי הלב גם הראה יכולת הקיום נשמר. במהלך ניסויים אלה מלוחים נשאר סודה על ידי תסיסה של פתרון באמצעות הזרקת מלוחים שוב ושוב, באמצעות מחט 21-מד, לתוך מבחנה.

כדי לכמת HR או תצפיות ישירות ניתן להשתמש או את התמונות ניתן להקליט על קלטות VHS או מצלמה דיגיטלית עבור השמעה על גבי מסך. שיטה photodiode כבר בעבר תיאר (Dasari ואת קופר, 2006).

חשיפה הלם החום:

1. לנתח הזחל.
2. מניחים על צלחת הכנה גזור לכסות.
3. מחממים מים באמבטיה.
4. בדוק בתוך הטמפרטורה של אמבט צף על ידי בדיקה הטמפרטורה על צלחת לכסות.
5. כאשר הטמפרטורה היא מקום משביע רצון, הכנה צלחת לכסות באמבטיה.
6. השאירו הכנה בסכום הרצוי של זמן להסיר בסיום.

אפשר להשתמש בכל מה הדופק חום בטמפרטורה הנדרשת לניסויים שלהם.

חשמלית כונן את הלב לקצב:

1. מלאו אלקטרודה מוקד (כ 20 מיקרון בקוטר) באמצעות מזרק הוכנס וחתום על קצה פתוח הציור בטמפרטורת החדר (21 ° C) לעוף מלוחים (HL3) אל האלקטרודה. הר אלקטרודה לתוך מניפולטור, כי בדיקת החוט הדואר נמצא מלוחים בתוך האלקטרודה ואת ממריץ כבוי.
2. מניחים 3 הזחל תסיסנית instar לב הזחל הכנה גזור על המיקרוסקופ לנתח ומאובטח אותו במקום. מניחים את חוט הארקה לתוך מלוחים של ההכנה, זהיר, כדי למנוע מגע עם סיכות בצידי ההכנה.
3. השתמש מניפולטור עמדת קצה האלקטרודה על החלק העליון של הלב, כדי להתאים את המיקוד של המיקרוסקופ כנדרש. הדרך הטובה ביותר להשיג זאת היא להתמקד האלקטרודה תוך העתקת מטה קצה.
4. כאשר קצה נתפסת להיות בעמדה, ממריץ (S9 דגם מכשירים גראס, קווינסי, מסצ'וסטס, ארה"ב) צריך להיות מופעל בתדירות ב 2 הרץ, משך ב 0.5-1 ms מתח על ההגדרה הנמוכה ביותר. הגדרת עיכוב צריך להיות בין 12 ל 14.
5. בעוד התבוננות בקצב הלב, תדירות יש פנה הרץ כ 3 מתח גדל לאט עד קצב של הלב לראות מתאים לקצב המיוצר על ידי ממריץ. בדרך כלל הלב לטוס גזור פועם בתדר של כ 2 הרץ, כך שכאשר קצב גירוי גבוה משיעור הפנימית, הלב יהיה לראות, הלב יראו להכות בקצב מהיר מהרגיל. מתח לא צריך לעלות כ 20 V כמו נזק לתאים יכול להתרחש במתח גבוה, מה שהופך את ההכנה תועלת. בדרך כלל, אפשר לעורר את לב בין 2 ל 8 V, בהתאם למרחק חותם שנוצר על הלב.
6. אם המתח המרבי ואת כל השפעה נתפסת, הקוטביות יכול להיות הפוך. אם גם זה לא עובד, החללית צריכה להיות עברה ליצור חיבור טוב יותר על הלב.
7. לאחר קצב מונע גירוי הוא הוקם, הקצב ניתן להשפיע על ידי שינוי תדר והגדרות משך. זה צריך להיעשות ידוע, עם זאת, בתדרים מעל 4 הרץ יכול לשים את הלב לתוך tetany. כהלים שונים סוכני תרופתי ניתן להוסיף והשפעתם על צמתים הפער ניתן לראות פעם את הקצב הרצוי הוא הוקם. צמתים הפער חסומים לא לקיים את הקצב הנוכחי מופצות תיפסק.
   
   
   אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות זו.

מדידת פוטנציאלים בתחום:

1. אלקטרודות זכוכית עשויים זכוכית Kimax (קוטר חיצוני: 1.5 מ"מ). צינור הזכוכית הוא משך אש מלוטש לייצר טיפים תיקון בקטרים ​​הנעים בתוך 10-20 מיקרומטר.
2. לומן של האלקטרודה מלא המדיום ים. מגבר הקלטה על הקו למחשב זהה לזה המשמש להלן ההקלטות תאיים.
3. לומן של האלקטרודה הקלטת 'מאקרו תיקון "(Stühmer et al. 1983) ממוקם ישירות מעל אזור של הלב. צעדה ספונטנית של סיבי השריר לייצר פוטנציאל שדה ניתן לנטר עם אלקטרודה המוקד.
4. הטיפול צריך להינתן על ידי מעדנות את לומן ולהעלות אותו על כל אזור של הלב להיות במעקב. פוטנציאלים נרשמות באמצעות אלקטרודה המאקרו תיקון.

ספירה ישירה של קצב הלב ואירועים חשמל ניטור אפשרי. לשנות את התקשורת הרחצה בעת ההקלטה אלה הפוטנציאלים הוא גם אפשרי להעריך את ההשפעות על הפוטנציאלים השדה.

מדידת פוטנציאלים תאיים:

כדי לבדוק את פוטנציאל הטרנסממברני של myocytes אזור של הלב משופדת עם אלקטרודה חד תאיים (20-30 התנגדות mOhm) מלא 3M KCl. בשלב ראש סטנדרטיים מגבר הקלטה תאיים ניתן להשתמש, אך השתמשנו במודל Axonclamp 2B (התקנים מולקולריים, בסאניווייל, קליפורניה, ארה"ב) מגבר ו 1 X שלב LU הראש. נראה כי קצה הזנב של הלב הוא נוקשה יותר וכאן התאים קוצב מתגוררים מאז התכווצות יוזם באזור זה רוב הזמן (Badre et al, 2005;. Dasari וקופר 2006; Dasari et al, 2007. ).

Materials

Dissection tools: Fine #5 tweezers and fine scissors (all obtained from Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139) Dissecting microscope with zoom function for dissection and counting heart rate. For focal stimulation of the heart this is needed as well. For extracellular and intracellular recordings a compound microscope with upright objectives (4 x and 20X) is used. Standard intracellular amplifier and A/D board for on line recording to a computer. Electrical signals are recorded on line to a PowerLab/4s interface (ADInstruments, Australia). We use standard software from ADInstruments named Chart or Scope. Chemicals: All saline chemicals are obtained from Sigma chemical company (St. Louis, MO). For intracellular recordings we use glass capillary tubing (catalogue # 30-31-0 from FHC, Brunswick, ME, 04011, USA) and for focal macropatch recording and stimulating electrodes we use Kimax-51, Kimble Products Art. No. 34502, ID 0.8-1.1mm, length 100mm. The intracellular electrode should have a resistance of 20 to 30 mOhm. The macropatch electrode is constructed by breaking off the tip of the glass after a fine tip was made from an electrode puller. The broken off tip needs to be a clean perpendicular break about 20μM in diameter. The tip is then heat polished to about 10μM inner diameter for the focal extracellular recording. For the stimulating electrode to drive the heart we use a final tip of about 20-50 μM in diameter. The shaft of the electrode is run over a heating element to cause it to bend about 45 degrees with a gradual bend. This produces a flat or perpendicular electrode lumen over the heart tube as the angle with the micro-manipulator will produce about another 45 degrees to the preparation.