在幼虫的监测心脏功能果蝇生理研究

Summary

我们目前各种方法来监测心脏功能，在幼虫

Abstract

我们目前各种方法记录在幼虫心脏功能

Protocol

引言

在昆虫和脊椎动物的心脏功能的细胞机制都惊人地相似 ，果蝇正在调查是在其他动物疾病（包括人类）的国家（比尔和博德默，2004年负责的基因突变 ， 。庇隆等， 2009年）。现在的各种疾病正在引起这个听话的基因生物体（东视等 ，1995;约翰逊等人，1998年; Ganetzky，2000;比尔和博德默，2004年;。Ocorr等人，2007年，B）与希望在基因治疗时间可以重新获得正常功能测试。此外果蝇作为一个好的模型在细胞水平上的生理功能。

许多过去的研究对果蝇心脏已经面向在胚胎发育方面的问题（1993年Azpiazu和Frasch，博德默1993年，博德默等 ，1990 ）。在预蛹，蛹或成人阶段（阿什顿等人 ，2001年，他和阿德勒，2001年，莫利纳和克里普斯，2001年; Ponzielli 等 ，2002; Sláma和法尔卡什，2005年发生的几个生理功能研究; Wessells和博德默，2004年）。然而，蛹期是变态和激素以及波动的各种生物胺之一。心也经历结构性转型，这可以被证明是困难的心肌细胞的生理（枣等人进行调查时，为控制变量2005年，约翰逊等人2002年，米勒，1997年; Papaefthimiou和Theophilidis ，2001年）。已知的核心是要在幼虫阶段生肌，可以很容易地被删除或留在原地 ，而受到限制，如循环激素或肽（道斯等人1995年的复合变量定义的生理盐水沐浴; 约翰逊等人1997年Dasari和库珀，2006年丰等 2004）。幼虫心脏生肌性质与哺乳动物的心脏有心脏起搏器的驱动心脏泵在流体方向洗澡机关有效的休息。 果蝇幼虫心脏变时和离子型性质的利益，因为它可以作为一个迅速的手段哺乳动物心脏功能测试的基本原则和病理的影响，以及帮助制定一个比较模式，如离子调节的细胞生理学起搏细胞。

幼虫的心是很容易在血淋巴因食物来源或动物的内在状态（Dasari和库珀，2006年，约翰逊等人1997年，2000年。尼科尔斯等1999年; Zornik等生物胺和肽1999年）。内源性或外源性化合物如何影响心脏机械的兴趣。如果我们获得了更好地了解昆虫生理学和药理学，减少对其他生物的影响可能是新颖的杀虫剂，可开发。

幼虫心脏的神经递质和调制器的作用的细胞机制尚未描述的日期尚未有足够的了解的离子流和幼虫的心，有助于调节起搏器活动的通道类型。据我们所知，没有报告，记录心肌细胞外或细胞内的录音，以评估离子电流来解决的果蝇幼虫的调制器的机械影响。

在这份报告中，我们提出各种方法来记录心率和幼虫心脏生理特性。

方法

完整的幼虫：

1. 一个可视化的一个完整的幼虫心脏跳动的好手段是直接用显微镜;然而，幼虫仍必须保持足够的计数宫缩。我们发展的办法监测心率，在自由移动的幼虫，以及内敛的幼虫。根据实验问题上的一种方法可能比其他更合适的。
2. 这些方法可用于跟踪长时间，个人护理，以避免脱水。这些方法也可以用来评估在饮食上推出的药理代理人或突变线的发展，或与热休克基因的诱导研究不同时期。
3. 第一奔放的方法，我们称之为“蚂蚁农场”。这项技术由两片玻璃间隔一层薄薄的幼虫的食物除了板。能够可视化的​​一个重点平面内的幼虫。这种技术也被用来监测电活动，在幼虫昼夜运动（Cooper和Cooper，2004）。这项技术包括两个玻璃板（显微镜玻片上，75 x 25毫米; J.梅尔文释放的品牌），狭义的间隔（1对1。5毫米）除了一层薄薄的幼虫的食物（如潮湿的玉米粉，刘易斯，1960年修改后的版本），这样的幼虫能够可视化的​​一个重点平面内。凝胶电泳板常用的垫片（迷你凝胶Bio - Rad公司;生命科学研究，大力士，CA 94547，美国）很好地工作，因为它们可以购买不同厚度为1，第2或第3龄幼虫的蚂蚁农场程序使用。也是一种选择是使用一个给定的厚度的固体塑料和切出该地区使用的爬行空间。
4. 为了防止从两个玻璃的板所需厚度的塑料用于边缘爬出来的幼虫。稍微倾斜的平台，在20至45度，导致幼虫保持，大部分时间，他们的头部，指出向下，尾部含有上述食品或在食品层内的空气通过的气孔。
5. 这种“蚂蚁农场技术”还允许与厚度均匀的单一食品平面内的视频影像。在此配置中的幼虫往往不抓取整个食品，而是吃，并逐步在二维平面上左右移动。预计从镜显微镜阶段底部的白色光，以便它可以被移到相应心脏或两个气管而心脏收缩移动最好的对比度。显微镜（可调变焦0.67至4.5;世界精密仪器;型号501379）。一个2X的基本目标和管目标0.5X是用来获得足够的空间分辨率和放大倍率，覆盖0.5厘米的矩形，一个1cm。使用一个安装摄像头是通过一个三目挂载（敏通，MTV;世界精密仪器）。环境温度保持在20 ° C。

   
   图1。一个完整的^第三龄幼虫的背视图。气管的运动，由于拉动发自内心的附件是用来观察心率。

6. 要监视自由活动的动物，可以将几滴稀的食物混合比动物头。这项工作应在一个玻璃盘，使透射光可以通过可视化心管的幼虫。设立上文所述相同的显微镜可用于观看心脏跳动，并取得计数。
7. 另一种方法是限制使用双节棍在玻片上的磁带和配售幼虫腹磁带（Baker等，1999），幼虫到一个位置。但是这种方法并不能很好的工作，如果磁带弄湿喂养幼虫。为了避免弄湿之一的磁带，可以使用凡士林（小针注射围绕基地的幼虫和周围的磁带边缘）。在这里，人们可以随着时间的推移，而不必追成焦点平面的幼虫或虽然这是一盘移动幼虫饲料。如果一个人希望自由幼虫的磁带，可以湿润，失去它的附着力动物。

如果没有兴趣释放幼虫的实验，人们可以使用的永久的方法抑制动物的幼虫通过粘合载玻片。用超级胶水方法，动物可以吃，甚至可以在潮湿的解决方案覆盖，而其余坚持以玻璃盖玻片。的程序是：

1. 取一干净的幻灯片，并将其放置在它的一端盖玻片。
2. 小民建联的强力胶把盖玻片的一个角落。
3. 找到您的果蝇幼虫，从试管中取出。
4. 放置在培养皿中的幼虫和冲洗一个少量的水，以消除任何多余的食物。
5. 沉浸扩孔用一个小的组织或纸巾的一角食物。
6. 用镊子轻轻地拿起幼虫和它从您的盖玻片上，另一端放置在幻灯片上。
7. 放置在显微镜下的幻灯片，并调整您的贷款幼虫。幼虫应在其背面朝上的胃。您可以分清双方的幼虫，因为他们的备份功能“赛车条纹”，这是气管。胃有淡淡的横向凹槽，沿着它的运行很细的黑毛。
8. 如果幼虫正面临着不正确的方法，只需打开您的镊子轻轻翻转它的正确途径。
9. 有了一个新的镊子一套专门用于胶水从在你的封面年底下降一个小民建联滑，并放置在另一端的角落。您应该使用的胶水小幅量;足以涵盖镊子头。另外，确保你擦去你的镊子的两端，使他们不成为​​粘关闭。
10. 在显微镜下，仔细检查，以确保幼虫仍然是在正确的位置。如果它翻了过来，见第八步。
11. 现在，用于处理幼虫镊子，拿起幼虫把它轻轻地放在新鲜的胶修补。确保黑嘴挂钩靠近或在盖玻片边缘，既不他们或褐色气孔与胶水接触。
12. 小心按下幼虫向下压平。
13. 现在，幼虫在地方，你可以管理要测试他们的物质。
14. 这是最好的，如果你使用注射器制订的实质和幼虫的头部在小剂量的摄取。
15. 最后，心率计数脉冲的气孔在一分钟内可以观察到。

在原地 ：解剖和计数心率：

筹备工作是缝沿中腹的纵轴和牵制持平。准备菜包括玻片（VWR）磁带（百思买零售出来，让）坚持一方。在磁条中心孔允许准备与透射光观察。解剖针（精细的科学工具，WA）是弯曲和粘回形针。回形针很容易被操纵的磁带上，举行的地方鱼片的准备。这种类型录音盘先前已利用寄希望于从水蛭腹神经索（Muller 等 ，1981）分离出神经节。

1. 完整的第三龄幼虫放在夹层板。腹侧旋转的幼虫，直到气管不再通过角质层可见。
2. 将四个完整的幼虫引脚。有两个引脚口钩两侧，两个引脚上的气孔两侧。
3. 加入生理盐水，做一个横向切开一个小的距离头管脚，然后继续向下纵轴长的水平切口。
4. 从真正的心脏停止切割短距离。割开真实的心和沿一侧的气孔。
5. 抬起一条背针和钩下方角质层。使用PIN打开体腔和传播打开它。其余引脚重复。
6. 取出内脏，注意不要损伤气管或心脏。应该指出，一些建筑物被附加到心，如果去掉可能会损坏它。这些措施包括几个脂肪体，脑。如果你可以看到被删除的胆量，而拉长的心，立即停止试图删除该结构。

现在的核心是暴露和暴露实验条件的准备。

图^2，3路龄的腹夹层直接查看心。动物在它的后面钉解剖后用来直接适用于中枢神经系统或不完整的，对心脏的化合物。小箭头表示心脏和主动脉横断背血管研究（见下文）分隔。 TR，气管; SP，气孔，H心; AO，主动脉。

这夹层技术已被用于直接评估对果蝇幼虫的心脏（谷和辛格，1995年）的药理剂。清扫时间为3-6分钟。放松，而在HL3解剖后的3-5分钟的盐水沐浴的准备工作。

HL3生理盐水进行了仔细的控制，在pH值7.2，因为HR减慢在高pH值和速度在较低的pH值（Badre等，2005 ）。顾和Singh（1995）用于心脏的药理分析pH值7.0，也表明保持生存能力。在这些试验中，生理盐水保持曝气搅拌的解决方案，通过反复注射生理盐水，通过21号针，到一个烧杯中。

要量化人力资源可用于直接观察或图像可以被记录在VHS录像带，或在屏幕上进行播放的数码相机。一个光电二极管的方法以前曾描述（Dasari和库珀，2006）。

暴露在热休克：

1. 解剖幼虫。
2. 广场解剖盖板上的准备。
3. 热水浴。
4. 检查浴缸内浮动盖板上一个温度探测器温度。
5. 当温度是令人满意的，在洗澡的地方编制和覆盖板。
6. 留在编制所需的时间量，并在完成时删除。

人们可以利用其试验所需的每一个热脉冲和温度。

心电驱动的步伐：

1. 填补一个协调中心电极（直径约20微米），使用注射器插入开口端密封，并绘制在室温（21℃），飞入生理盐水（HL3）电极。的机械臂安装到电极，检查日发送线是在生理盐水内的电极和刺激是关闭的。
2. 放置在解剖镜下一个果蝇幼虫3龄幼虫心脏解剖的准备，并确保到位。放入生理盐水的准备，谨慎地避免接触的准备与引脚和双方的接地线。
3. 使用机械手到心脏的顶部电极尖端位置，需要调整显微镜的焦点。实现这一目标的最佳方式是电极上的重点，同时针尖向下移动。
4. 当针尖被认为是在位置，应该打开的刺激（型号S9草仪器，美国，马萨诸塞州，昆西）在2赫兹频率，持续时间在0.5到1毫秒的电压的最低设置。延迟设置应介于12和14。
5. 同时观察心脏的节奏，频率应转向约3 Hz的电压缓慢上升，直到看到心脏的节奏对应的刺激所产生的节奏。解剖飞心跳通常在大约2赫兹的频率，所以当刺激的节奏高于内禀增长率将会看到，心​​，心会被视为击败更快的速度比正常。电压应不超过约20个细胞的损伤，可发生在高电压，准备无用V。通常情况下，可以刺激2和1.8 V之间的心，这取决于距离和对心脏创建的印章。
6. 如果达到最大电压，被认为是没有效果，可以逆转的极性。如果这也不起作用时，探头应提出更好地树立对心脏的连接。
7. 一旦建立一个刺激驱动的节奏，节奏可以操纵不同的频率和持续时间设置。应该知道，不过，4赫兹以上的频率可以把手足抽搐的心。可以添加各种醇类及药理制剂和缝隙连接的影响，可以观察到，一旦建立所需的节奏。封锁的缝隙连接不进行电流和传播的节奏将停止。
   
   
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测量场电位：

1. 玻璃电极是由玻璃Kimax（外径：1.5毫米）。玻璃管拉火抛光生产内径从10到20微米的补丁提示。
2. 电极内腔充满了沐浴液。放大器和线到电脑上的记录是用于细胞内的录音低于相同。
3. 管腔一个“宏观补丁”的记录电极（Stühmer等 ，1983）是直接放在心脏地区。自发的肌纤维起搏产生一个领域的潜力，可与中心电极监测。
4. 需要注意的是轻轻地降低流明，提高它在每个心要监视的地区的。通过宏观补丁电极记录的潜力。

直接计数心率和电气事件监测是可能的。改变洗浴的媒体，而录音这些潜力，也是可行的驴场电位的影响。

测量细胞内的潜力：

要监视的一个尖锐的细胞内电极（20至30毫欧电阻）与3米氯化钾填补刺穿心脏地区的心肌细胞跨膜电位。可以使用一个标准的头阶段，细胞内记录放大器;然而，我们采用的一种模式Axonclamp 2B（分子器件，美国加利福尼亚州的桑尼维尔市，美国）放大器和1个LU头阶段。看来，心的尾部到底是更严格的，这是起搏细胞自收缩在本地区启动的时间（Badre等 ，2005年的大部分; 2006年Dasari和库珀; Dasari等人，2007年。 ）。

Materials

Dissection tools: Fine #5 tweezers and fine scissors (all obtained from Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139) Dissecting microscope with zoom function for dissection and counting heart rate. For focal stimulation of the heart this is needed as well. For extracellular and intracellular recordings a compound microscope with upright objectives (4 x and 20X) is used. Standard intracellular amplifier and A/D board for on line recording to a computer. Electrical signals are recorded on line to a PowerLab/4s interface (ADInstruments, Australia). We use standard software from ADInstruments named Chart or Scope. Chemicals: All saline chemicals are obtained from Sigma chemical company (St. Louis, MO). For intracellular recordings we use glass capillary tubing (catalogue # 30-31-0 from FHC, Brunswick, ME, 04011, USA) and for focal macropatch recording and stimulating electrodes we use Kimax-51, Kimble Products Art. No. 34502, ID 0.8-1.1mm, length 100mm. The intracellular electrode should have a resistance of 20 to 30 mOhm. The macropatch electrode is constructed by breaking off the tip of the glass after a fine tip was made from an electrode puller. The broken off tip needs to be a clean perpendicular break about 20μM in diameter. The tip is then heat polished to about 10μM inner diameter for the focal extracellular recording. For the stimulating electrode to drive the heart we use a final tip of about 20-50 μM in diameter. The shaft of the electrode is run over a heating element to cause it to bend about 45 degrees with a gradual bend. This produces a flat or perpendicular electrode lumen over the heart tube as the angle with the micro-manipulator will produce about another 45 degrees to the preparation.