Surveillance de la fonction cardiaque chez les larves Drosophila melanogaster Pour les études physiologiques

Summary

Nous présentons différentes manières de surveiller la fonction cardiaque chez la larve de

Abstract

Nous présentons différentes méthodes pour enregistrer la fonction cardiaque chez la larve

Protocol

INTRODUCTION

Les mécanismes cellulaires de la fonction du cœur à la fois pour les insectes et les vertébrés sont étonnamment similaires Drosophila melanogaster sont utilisées pour étudier les mutations génétiques qui sont responsables de pathologies chez d'autres animaux y compris les humains (Bier et Bodmer, 2004;.. Peron et al, 2009). Maintenant diverses maladies sont induites dans cet organisme docile génétique (Dowse et al, 1995;. Johnson et al, 1998;. Ganetzky, 2000; Bier et Bodmer, 2004;. Ocorr et al, 2007a, b) et avec l'espoir que en thérapie génique du temps peuvent être testés pour retrouver des fonctions normales. En plus de la drosophile servir un bon modèle pour la fonction physiologique à un niveau cellulaire.

Beaucoup d'études antérieures sur la drosophile coeur ont été ciblés vers les aspects de développement de l'embryon (Azpiazu et Frasch 1993, Bodmer 1993, Bodmer et al. 1990). Un peu d'études sur les fonctions physiologiques survenus dans les stades pré-nymphe, nymphe ou adulte (Ashton et al, 2001;. Lui et Adler, 2001; Molina et Cripps, 2001; Ponzielli et al, 2002;. Slama et Farkas, 2005; Wessells et Bodmer, 2004). Toutefois, le stade de pupe est l'une des métamorphoses et des hormones de change ainsi que fluctuant diverses amines biogènes. Aussi le cœur est une transformation structurelle qui peut se révéler difficile à contrôler pour des variables lorsqu'ils enquêtent sur ​​la physiologie des myocytes (Dulcis et al 2005;. Johnson et al, 2002;. Miller, 1997; Papaefthimiou et Theophilidis, 2001). Le cœur est connu pour être myogène dans le stade larvaire et peut facilement être enlevé ou laissé en place tout en étant baignée par une solution saline physiologique défini pour limiter variables combinées telles que les hormones circulantes ou des peptides (Dowse et al 1995;.. Johnson et al 1997 ; Dasari et Cooper, 2006; Feng et al 2004).. La nature myogène du cœur larvaire est comparable à celle du cœur chez les mammifères en ce qu'il ya stimulateurs qui animent le reste du coeur à pomper le liquide dans une direction pour être efficace dans les organes de bain. La nature chronotrope et inotrope du cœur Drosophile larvaire est d'intérêt car elle pourrait servir comme un moyen rapide de tester les principes fondamentaux et les effets pathologiques pour la fonction cardiaque chez les mammifères ainsi que d'une aide pour développer un modèle comparatif pour la physiologie cellulaire tels que la régulation ionique de cellules pacemaker.

Le cœur des larves est très sensible à des amines biogènes et des peptides qui peuvent varier dans l'hémolymphe fonction source de nourriture ou de l'état intrinsèque de l'animal (Dasari et Cooper, 2006; Johnson et al 1997, 2000;.. Nichols et al 1999; Zornik et al . 1999). S'adressant comment les composés endogènes ou exogènes influencent le coeur de façon mécaniste est d'un intérêt. Insecticides éventuellement roman avec moins d'effets sur d'autres organismes peuvent être développés si nous gagnons une meilleure compréhension de la physiologie des insectes et la pharmacologie.

Le mécanisme cellulaire de l'action des neurotransmetteurs et modulateurs cardiaque chez la larve n'ont pas été décrites à ce jour car il n'a pas été une compréhension suffisante des courants ioniques et les types de canaux présents dans le cœur des larves qui contribuent et réguler l'activité pacemaker. Autant que nous sachions, il n'ya pas de rapports documentant les enregistrements extracellulaires ou intracellulaires des myocytes d'évaluer les courants ioniques pour contrer les effets mécaniste de modulateurs de larves de drosophile.

Dans ce rapport, nous présentons différentes méthodes pour enregistrer le rythme cardiaque et les propriétés physiologiques du cœur larvaire.

MÉTHODES

Larves intactes:

1. Un bon moyen de visualiser un cœur qui bat intacte larvaire est directement avec un microscope, mais la larve doit rester encore assez de compter des contractions. Nous les méthodes de développement pour surveiller le rythme cardiaque en se déplaçant librement larves ainsi que des larves retenu. Selon celles approche expérimentale à une question pourrait être plus appropriée que les autres.
2. Ces approches pourraient être utilisés pour suivre un individu sur de longues périodes de temps si les soins sont utilisés pour éviter la déshydratation. Ces méthodes peuvent aussi être utilisés pour évaluer les agents pharmacologiques introduits dans l'alimentation ou pour examiner divers moments dans le développement de lignes de mutation ou à l'induction de gènes de choc thermique.
3. La méthode effrénée d'abord nous terme de la «fourmilière». Cette technique est constitué de deux plaques de verre séparées par une fine couche de nourriture des larves. Les larves sont capables d'être visualisées au sein d'un plan de mise au point. Cette technique a également été utilisé pour surveiller l'activité électrique par le mouvement circadien larve (Cooper et Cooper, 2004). Cette technique est constitué de deux plaques de verre (lames de microscope; 75 x 25 mm; J. Melvin Freed Marque) espacées de justesse (1 à 1.5 mm) séparés par une fine couche de la nourriture des larves (par exemple la farine de maïs humide, une version modifiée de Lewis, 1960) afin que les larves sont capables d'être visualisées au sein d'un plan de mise au point. Entretoises couramment utilisée pour les plaques d'électrophorèse sur gel (mini gel Bio-Rad; Life Science Research, Hercules, CA 94547, USA) fonctionnent très bien, car ils peuvent être achetés avec une épaisseur variable pour une utilisation avec 1ère, 2ème ou 3ème stade des procédures larves de fourmis ferme. Également une option est d'utiliser un plastique solide d'une épaisseur donnée et découpez la région à utiliser comme espace de ramper.
4. Pour empêcher les larves de ramper hors des bords des deux plaques de verre d'un plastique de l'épaisseur désirée est utilisée. Inclinant légèrement la plate-forme de 20 à 45 degrés provoque la larve de rester, la plupart du temps, avec leur tête pointée vers le bas et leur queue contenant les stigmates au-dessus de la nourriture ou dans un passage de l'air dans la couche alimentaire.
5. Cette "technique Ant Farm" permet également d'imagerie vidéo dans un seul plan de la nourriture d'une épaisseur uniforme. Dans cette configuration, les larves ont tendance à ne pas ramper à travers la nourriture, mais au lieu de manger et se déplacer graduellement autour du plan en 2D. La lumière blanche est projetée à partir du dessous de la platine du microscope avec un miroir afin qu'il puisse être déplacé en conséquence pour le meilleur contraste du cœur ou de la trachée a deux qui se déplacer tout le cœur se contracte. Un microscope (zoom réglable de 0,67 à 4,5; Instrument de précision du monde; Modèle 501 379) est utilisé. Un objectif de base 2X et le tube de l'objectif 0.5X est utilisé pour obtenir une résolution suffisante spatiale et un grossissement de couvrir un rectangle de 1 cm par 0,5 cm. Une caméra montée dans une monture trinoculaire est utilisé (Mintron, MTV, instruments de précision du monde). La température ambiante est maintenue à 20 ° C.

   
   Figure 1. Vue dorsale d'une larve intacte 3 ^e stade larvaire. Le mouvement de la trachée dû à la traction des pièces jointes à partir du cœur est utilisée pour observer le rythme cardiaque.

6. Pour surveiller l'animal se déplaçant librement, on peut placer quelques gouttes d'un mélange de nourriture diluée sur la tête des animaux. Cela devrait être fait dans un plat en verre pour la lumière transmise peut passer à travers les larves pour visualiser le tube cardiaque. La microscopie mêmes mis en place comme décrit ci-dessus peut être utilisé pour regarder le battement de coeur et d'obtenir des points.
7. Une autre approche consiste à retenir la larve d'un emplacement en utilisant adhésif double sur une lame de verre et en plaçant la face ventrale de la larve de la bande (Baker et al., 1999). Toutefois, cette approche ne fonctionne pas bien si la bande est mouillé lorsque l'alimentation de la larve. Afin d'éviter le ruban en obtenir un humide peut utiliser de vaseline (injecté sur une petite aiguille autour de la base de la larve et autour du bord de bande). Ici, on peut nourrir la larve au cours du temps sans avoir à chasser les larves dans le plan focal ou pendant qu'il se déplace sur un plat. Si l'on veut libérer les larves de la bande peut être humidifié et il perd son adhérence à l'animal.

Si on ne s'intéresse pas à libérer les larves d'expérimentation, on pourrait utiliser la méthode permanente de restreindre la larve par collage de l'animal à une lame de verre. Avec l'utilisation de la méthode de la super glue, l'animal peut manger et même être couverts dans une solution humides, tout en restant adhéré à la lamelle de verre. Les procédures sont les suivantes:

1. Prenez une lame propre et placer une lamelle à une extrémité de celui-ci.
2. Mettre une noisette de colle dans un coin de la lamelle.
3. Localisez votre larve de drosophile et de le retirer du tube à essai.
4. Placer la larve dans une boîte de Pétri et le rincer avec une petite quantité d'eau pour enlever tout excès de nourriture.
5. Imprégnez-vous de la nourriture alésage avec le coin d'un tissu de petites ou de serviette en papier.
6. Doucement ramasser larves avec des pincettes et placez-le sur votre diapositive à l'autre extrémité de votre lamelle.
7. Placer la lame sous le microscope et ajuster votre prête sur la larve. La larve doit être sur le ventre avec la hausse son dos face. Vous pouvez distinguer les deux côtés de la larve, car leur dos en vedette deux "Racing Stripes" qui sont la trachée. L'estomac a faibles rainures horizontales longeant c'est très fine avec des poils noirs.
8. Si la larve est confronté à la manière incorrecte, il suffit de tourner le droit chemin par la douceur qu'elle retournement plus avec votre pince à épiler.
9. Avec un nouvel ensemble de pinces utilisées spécifiquement pour la colle de prendre une petite tape dans le menu déroulant à la fin de votre lamelle et la placer à l'angle de l'extrémité opposée. Vous devez utiliser un montant très légèrement de colle; juste assez pour couvrir la tête de la pince à épiler. Aussi, assurez-vous essuyer les extrémités de votre pince à épiler afin qu'ils ne deviennent pas collés fermés.
10. Sous le microscope, une double vérification pour s'assurer que la larve est toujours dans la bonne position. Si elle a tourné plus, voir l'étape huit.
11. Maintenant, avec l'aide des pinces utilisées pour gérer la larve, ramasser les larves etle placer délicatement sur le patch frais de colle. Assurez-vous que les crochets bouche noire sont situées à proximité ou au bord de la lamelle et que ni eux ni les stigmates bruns entrent en contact avec la colle.
12. Appuyez doucement sur la larve à l'aplatir.
13. Maintenant que la larve est en place, vous pouvez administrer les substances que vous souhaitez les tester.
14. Ce mieux est accompli si vous utilisez une seringue pour élaborer le contenu et le placer dans de petites doses par tête de la larve pour qu'elle ingère.
15. Enfin, la fréquence cardiaque peut être observée en comptant le nombre d'impulsions du spiracles en une minute.

In situ: Dissection et le comptage de la fréquence cardiaque:

Les préparations sont fente le long de l'axe médio-ventrale longitudinales et épinglé à plat. Le plat préparation a consisté d'une lame de verre (VWR) avec bande magnétique (Meilleurs achats de détail hors-louer) ont adhéré à un côté. Un trou dans le centre de la bande magnétique permet la préparation pour être vu avec la lumière transmise. Dissection broches (Beaux-outils scientifiques, WA) sont pliés et collés à trombones. Les trombones sont facile à manœuvrer sur la bande magnétique de tenir la préparation de filets en place. Ce type de plat d'enregistrement a été décrit précédemment pour l'utilisation de l'épinglage ganglions isolés de la moelle nerveuse ventrale de sangsue (Muller et al., 1981).

1. Placer au 3ème stade larvaire intacte sur la plaque de dissection. Tournez sur la larve de sa face ventrale jusqu'à la trachée ne sont plus visibles à travers la cuticule.
2. Placez quatre épingles dans la larve intacte. Deux broches aller sur chaque côté de la bouche, les crochets, et deux épingles vont de chaque côté de l'stigmates.
3. Ajouter salée, et faites une incision horizontale sur une petite distance de la tête de broches, puis continuer avec une incision horizontale sur toute la longueur de l'axe longitudinal.
4. Arrêtez de coupe sur une courte distance du cœur vrai. Couper autour du coeur vrai et le long du côté des stigmates.
5. Soulever une broche dorsale et l'accrocher au-dessous de la cuticule. Utiliser l'épingle pour ouvrir la cavité abdominale et la propagation de l'ouvrir. Répétez cette opération avec les quilles restantes.
6. Retirer les tripes, en faisant attention à ne pas endommager soit la trachée ou du coeur. Il faut noter que certaines structures sont attachés au coeur et peut l'endommager si elle est expulsée. Il s'agit notamment de plusieurs corps gras, et le cerveau. Si vous pouvez voir le coeur étant étirée tout en retirant les entrailles, arrêtez immédiatement d'essayer de retirer de cette structure.

Le cœur est maintenant exposée et prête pour l'exposition aux conditions expérimentales.

Figure 2. Dissection ventrale d'une 3 ^ème stade pour voir directement le cœur. L'épinglage de l'animal sur son dos après une dissection est utilisé pour appliquer directement les composés sur le cœur, avec ou sans le SNC intact. Petite flèche indique l'endroit où le cœur et l'aorte sont séparés pour des études sectionné vaisseau dorsal (voir ci-dessous). Tr, trachée; Sp, stigmates, H Cœur; AO, de l'aorte.

Cette technique de dissection a été utilisé pour évaluer directement les agents pharmacologiques sur le cœur des larves de drosophile (Gu et Singh, 1995). Le temps de dissection est de 3-6 min. La préparation est permis de se détendre tout baigné dans une solution saline HL3 pendant 3-5 min après dissection.

La solution saline HL3 a été soigneusement contrôlée pour être à pH 7,2, depuis RH ralentit à pH élevé et des vitesses allant au pH inférieur (Badre et al., 2005). Gu et Singh (1995) ont utilisé un pH de 7,0 pour l'analyse pharmacologique du cœur et a également montré la viabilité maintenue. Pendant ces essais, la saline est resté aérée par agitation de la solution saline par injection répétitive, à travers une aiguille de calibre 21, dans un bécher.

Pour quantifier RH soit des observations directes peuvent être utilisés ou les images peuvent être enregistrées sur des cassettes VHS ou un appareil photo numérique pour la lecture sur un écran. Une méthode photodiode a été décrit précédemment (Dasari et Cooper, 2006).

L'exposition à un choc thermique:

1. Disséquer larve.
2. Placer la préparation disséqués sur plaque de couverture.
3. Bain d'eau de la chaleur.
4. Vérifiez la température intérieure de bain en flottant une sonde de température sur une plaque de couverture.
5. Lorsque la température est satisfaisante, du lieu de préparation et couvercle de bain.
6. Laisser la préparation dans une quantité désirée de temps et de retirer une fois terminé.

On peut utiliser ce que chaque impulsion de chaleur et de température nécessaires à leur expérimentation.

Électrique d'entraînement du cœur au rythme de:

1. Remplir une électrode de contact (environ 20 microns de diamètre) en utilisant une seringue insérée et scellée sur l'extrémité ouverte et le dessin de la température ambiante (21 ° C) volent saline (HL3) dans l'électrode. Monter l'électrode dans le manipulateur, en vérifiant que ee fils est dans la solution saline à l'intérieur de l'électrode et le stimulateur est éteint.
2. Placer la préparation d'une larve de drosophile au 3ème stade larvaire coeur disséqué sur le microscope à dissection et le fixer en place. Placez le fil de terre dans la saline de la préparation, attentif à éviter le contact avec les broches et les côtés de la préparation.
3. Utilisez le manipulateur à la position de l'extrémité de l'électrode sur la partie supérieure du cœur, en ajustant la mise au point du microscope, au besoin. La meilleure façon d'y parvenir est de se concentrer sur l'électrode tout en se déplaçant vers le bas bout.
4. Lorsque la pointe est perçu comme étant en position, le stimulateur (Instruments Grass modèle S9, Quincy, Massachusetts, USA) doit être allumé avec la fréquence à 2 Hz, durée de 0,5 à 1 ms et la tension sur le réglage le plus bas. Le réglage du retard doit être comprise entre 12 et 14.
5. Tout en observant le rythme cardiaque, la fréquence devrait être tourné à environ 3 Hz et la tension a augmenté lentement jusqu'en rythme cardiaque correspond à vu le rythme produit par le stimulateur. Normalement, le coeur volent disséqué bat à une fréquence d'environ 2 Hz, alors quand le rythme stimulé est plus élevé que le taux intrinsèque, le cœur va le voir, le coeur sera vu à battre à un rythme plus rapide que la normale. Tension ne devrait pas dépasser environ 20 V en tant que dommages cellulaires peuvent survenir à des tensions élevées, ce qui rend la préparation inutile. Typiquement, on peut stimuler le cœur entre 2 et 8 V, selon la distance et le sceau créé sur le cœur.
6. Si la tension maximale est atteinte et aucun effet n'est vu, la polarité peut être inversée. Si cela ne fonctionne pas non plus, la sonde doit être déplacée afin de mieux établir une connexion sur le cœur.
7. Une fois qu'un rythme de stimulation entraînée est établie, le rythme peut être manipulé en faisant varier la fréquence et les paramètres de durée. Il devrait être connu, cependant, que les fréquences supérieures à 4 Hz peut mettre le cœur dans la tétanie. Divers alcools et des agents pharmacologiques peuvent être ajoutés et leur effet sur les jonctions communicantes peuvent être observés une fois le rythme souhaité est établie. Jonctions bloqués ne conduisent pas le courant et le rythme propagé cessera.
   
   
   S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Mesure potentiels de champ:

1. Électrodes de verre sont fabriqués à partir de Kimax verre (diamètre extérieur: 1,5 mm). Le tube de verre est tiré et polie au feu pour produire des conseils de patch avec des diamètres intérieurs allant de 10 à 20 um.
2. La lumière de l'électrode est remplie avec le milieu de bain. L'amplificateur et l'enregistrement en ligne à un ordinateur est la même que celle utilisée ci-dessous pour les enregistrements intracellulaires.
3. La lumière de l'électrode de l'enregistrement d'un «macro-patch» (Stühmer et al., 1983) est placé directement sur ​​une région du cœur. Le rythme spontané des fibres musculaires de produire un potentiel de champs qui peuvent être surveillés avec l'électrode de contact.
4. Les soins doivent être donnés par un léger abaissement de la lumière et de l'élever sur chaque région du cœur d'être surveillés. Les potentiels sont enregistrés grâce à une électrode de macro-patch.

Comptage direct de la fréquence cardiaque et le suivi des événements électriques sont possibles. Modifier les médias se baigner pendant l'enregistrement de ces potentiels est également possible d'évaluer les effets potentiels sur le terrain.

Mesure des potentiels intracellulaires:

Pour surveiller les potentiels transmembranaires des myocytes une région du cœur est empalé avec électrode intracellulaire forte (20 à 30 de résistance mOhm) remplie avec 3 M de KCl. Une étape tête standard et d'un amplificateur pour l'enregistrement intracellulaire peut être utilisé, mais nous avons utilisé un modèle Axonclamp 2B (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) amplificateur et une tête de stade X LU. Il semble que l'extrémité caudale du cœur est plus rigide et c'est là que les cellules pacemaker résident depuis la contraction initiés dans cette région, la plupart du temps (Badre et al, 2005;. Dasari et Cooper 2006; Dasari et al, 2007. ).

Materials

Dissection tools: Fine #5 tweezers and fine scissors (all obtained from Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139) Dissecting microscope with zoom function for dissection and counting heart rate. For focal stimulation of the heart this is needed as well. For extracellular and intracellular recordings a compound microscope with upright objectives (4 x and 20X) is used. Standard intracellular amplifier and A/D board for on line recording to a computer. Electrical signals are recorded on line to a PowerLab/4s interface (ADInstruments, Australia). We use standard software from ADInstruments named Chart or Scope. Chemicals: All saline chemicals are obtained from Sigma chemical company (St. Louis, MO). For intracellular recordings we use glass capillary tubing (catalogue # 30-31-0 from FHC, Brunswick, ME, 04011, USA) and for focal macropatch recording and stimulating electrodes we use Kimax-51, Kimble Products Art. No. 34502, ID 0.8-1.1mm, length 100mm. The intracellular electrode should have a resistance of 20 to 30 mOhm. The macropatch electrode is constructed by breaking off the tip of the glass after a fine tip was made from an electrode puller. The broken off tip needs to be a clean perpendicular break about 20μM in diameter. The tip is then heat polished to about 10μM inner diameter for the focal extracellular recording. For the stimulating electrode to drive the heart we use a final tip of about 20-50 μM in diameter. The shaft of the electrode is run over a heating element to cause it to bend about 45 degrees with a gradual bend. This produces a flat or perpendicular electrode lumen over the heart tube as the angle with the micro-manipulator will produce about another 45 degrees to the preparation.