幼虫のモニタリングの心機能キイロショウジョウバエ生理学的研究のための

Published: November 16, 2009 doi: 10.3791/1596

Ann S. Cooper¹, Kylah E. Rymond¹, Matthew A. Ward¹, Easter L. Bocook¹, Robin L. Cooper¹

¹Department of Biology, University of Kentucky, Lexington

Summary

我々はの幼虫に心機能を監視するためにさまざまな方法を提示

Abstract

私たちは、幼虫の心臓機能を記録するためにさまざまな方法を提示

Protocol

はじめに

昆虫と脊椎動物の両方のための心臓の機能の細胞メカニズムは、驚くほど類似しているキイロショウジョウバエ 、ヒト（ビールとBodmer、2004などの他の動物の病気の状態に責任がある遺伝子の変異を調査するために使用されている、。ペロンら、。 2009年）。現在、様々な疾患がこの扱いやすい遺伝的生物に誘導されている（ダウズら、1995;。Johnson ら、1998;。Ganetzky、2000;ビールとBodmer、2004;。Ocorr ら、2007A、B）及びその希望を持つ時間遺伝子治療で正常な機能の回復のためにテストすることができます。さらに、 ショウジョウバエでは細胞レベルでの生理的機能のモデルとして。

ショウジョウバエ心臓に対する過去の研究の多くは、胚の発達の側面（AzpiazuとFrasch 1993、Bodmer 1993、Bodmer ら 1990）を対象としている。。プレ蛹、蛹、大人のステージ（アシュトンら、2001年に発生した生理機能のいくつかの研究、彼とアドラー、2001;モリーナとクリップス、2001; Ponzielli ら、2002;。Slámaとファーカス、2005; WessellsとBodmer、2004）。しかし、蛹の段階では変態と変化するホルモンと同様に変動する様々な生体アミンの一つです。また、心臓は心筋細胞の生理学調べるときに変数を制御することが困難であることが証明できる構造転換迎えています（。Dulcis ら 2005; Johnson ら 2002;。ミラー、1997; PapaefthimiouとTheophilidis、2001）。このような循環ホルモンやペプチド（ダウズらのような配合の変数を制限するために定義された生理食塩水で浴びている間、心臓は幼虫期に筋原性であることが知られており、容易にその場で削除または残すことができます1995;。Johnson らは、1997年。 ; Dasariとクーパー、2006; Feng ら 2004）。。幼虫の心臓の筋原性の性質は、入浴の臓器に有効であるとの方向に流体を送り出す心臓の残りの部分を駆動するペースメーカーが存在するという点で哺乳類の心臓に匹敵するものです。それは、哺乳動物心臓の機能のために基本原則と病理学的効果をテストするために迅速な手段として機能するだけでなく、可能性があるので、 ショウジョウバエの幼虫の心臓の変時とイオンチャネルの性質は興味深いようなのイオン調節など、細胞生理のための比較モデルの開発を助けるペースメーカー細胞。

幼虫の心臓は、食物源または動物の本来の状態に応じて、体液中の異なる生体アミンやペプチド等に大変影響を受けやすいです（Dasariとクーパー、2006; Johnson ら 1997、2000;。ニコルズら 1999;。Zornik ら。1999）。内因性または外因性化合物が機械的に心臓に影響を与える方法アドレッシングすることは興味深い。我々は昆虫生理学や薬理学の理解を得る場合によっては他の生物へのより少ない影響を有する新規殺虫剤を開発することができます。

幼虫の神経伝達物質と心臓の変調の作用の細胞機構は、ペースメーカーの活動に貢献して調節する幼虫の心臓に存在するイオン電流とチャネルタイプの十分な理解がされていないとして、これまでに記載されていない。限り我々が気づいているように、幼虫ショウジョウバエの変調器の機械的な影響に対処するためにイオン電流を評価するために筋細胞の細胞外または細胞内記録を文書化した報告はない。

本報告書では、幼虫の心臓の心拍数および生理学的特性を記録するために様々な方法を提示する。

方法

無傷の幼虫：

無傷の鼓動幼虫の心臓を視覚化するの良い方法は、顕微鏡で直接ですが、幼虫はまだ陣痛のカウントするのに十分でなければなりません。我々は自由に動く幼虫と同様に抑制された幼虫の心拍数を監視するための開発手法。ものによっては実験的な質問一つのアプローチは、他のより適切な場合があります。
これらのアプローチは、注意が脱水を避けるために使用されている場合、長期間にわたって個々に従うために使用することができる。これらのメソッドは、食事療法に導入された薬理学的作用物質を評価したり、変異株における開発、または熱ショック遺伝子の誘導と様々な時刻を調べることができます。
"アントファーム"という言葉第一奔放方法。この手法は、幼虫の食物の薄い層だけ離間2枚のガラス板で構成されています。幼虫は、焦点の1つのプレーン内で可視化することができます。この手法はまた、幼虫の電気的活動の概日運動（クーパーとクーパー、2004）によって監視するために使用されていました。この手法は、2枚のガラス板（; 75 × 25ミリメートル、顕微鏡スライドJ.メルビンフリードのブランド）で構成されて狭く等間隔（1対1。幼虫は焦点の1つのプレーン内で可視化することができるように、幼虫の食物の薄い層（例えば、湿ったコーンミール、ルイスの修正版、1960）によって分断さ5mm）。一般的にゲル電気泳動プレートに使用するスペーサー（ミニゲルBio - Rad社、ライフサイエンス研究、ヘラクレス、CA 94547、米国では）彼らが1位、2位または3齢幼虫の蟻の農場の手順で使用するために厚さを変化させて購入することができますので、非常に効果的です。またオプションでは、所定の厚さの固体プラスチックを使用してクロール領域として使用する領域を切り出すことです。
所望の厚さのプラスチックが使用されているガラスの2つのプレートの端からクロールから幼虫を防ぐために。彼らの頭が下向きに指摘し、彼らの尾は、食品の上または食品の層で空気通路内の気門を含むとわずかに20〜45度の傾斜プラットフォームは、幼虫が、大半の時間のままになります。
この"アントファームのテクニック"にも均一な厚さの食べ物を持つ単一の平面内でのビデオ撮影が可能になります。この構成では幼虫は食べ物を通してクロールするのではなく、食べることや徐々に2次元平面内で移動しない傾向がある。それは心臓の契約しながら移動し、心臓または2つの気管の最高のコントラストのためにそれに応じて移動できるように白色光は、鏡付き顕微鏡ステージの下面から予測されている。顕微鏡（調整可能なズーム0.67から4.5まで、世界の精密機器、モデル501379）が使用されます。 2Xの基本目標とチューブ客観0.5X、0.5 cmの長方形で1センチメートルをカバーするのに十分な空間分解能と倍率を得るために使用されます。三眼マウントを介してマウントされたカメラは、（;世界の精密機器Mintron、MTV）が使用されます。周囲温度を20℃に維持する。

図1無傷の第³齢幼虫の背ビュー。心臓から添付ファイルの引き上げによる気管の運動は、心拍数を観察するために使用されます。
自由に動く動物を監視する1つは、動物の頭の上に希薄な食品の混合物を数滴を配置することができます。透過光が心管を可視化するための幼虫を通過できるので、これは、ガラス皿で行う必要があります。上述のように設定したのと同じ顕微鏡は、心臓のビートを見て、カウントを取得するために使用することができます。
別のアプローチは、スライドガラス上でダブルスティックテープを使用している（Baker ら、1999）テープに幼虫の腹側を配置することにより、ある場所に幼虫を抑制することです。幼虫をフィードすると、テープが濡れた場合は、このアプローチはうまく動作しません。ぬれた1つを得るテープを回避するにはワセリンを（幼虫のベースの周りに小さな針から注入し、テープのエッジの周り）を使用することができます。そのような場合は、ここでは、皿に動いている間、フォーカス面に幼虫を追いかけたり、することなく、時間をかけて幼虫を供給することができます。保管したいの幼虫を解放する場合、テープがしみ込ませ、それが動物にそれの密着性を失いすることができます。

いずれかが実験のために幼虫を解放に興味がない場合、1つは、スライドガラスに接着することによって動物の幼虫を抑制する恒久的な方法を使用することができます。ガラス製カバースリップに接着したまま、スーパー接着剤の方法を使用すると、動物は食べることができるとさえ湿ったソリューションでカバーされる。手順は次のとおりです。

きれいなスライドを取り、それの一端にカバースリップを配置。
カバースリップの一角で、瞬間接着剤の小さい軽打を置く。
あなたのショウジョウバエの幼虫を見つけて、試験管から取り出します。
ペトリ皿の中で幼虫を置き、余分な食物を除去するために少量の水でそれをすすいでください。
小さな組織やペーパータオルのコーナーで食べ物をリーマ満喫してください。
静かにピンセットで幼虫をピックアップして、カバースリップから反対側にスライド上に置きます。
顕微鏡下でスライドを配置し、調整しては、幼虫に適しています。幼虫は上を向いて、その後ろで、その胃に存在する必要があります。彼らの背中が気管である2つの"レースのストライプを"機能するので、幼虫の両面を区別することができます。胃は非常に微細な黒い毛で、それに沿って実行してかすかな水平方向の溝を持っています。
幼虫は間違った方法に直面している場合は、単に静かにピンセットでそれを上に反転させる正しい方法を回します。
接着剤のために特に使用されてピンセットの新しいセットは、スリップと反対側の角に配置してカバーの端にドロップから小さなDABを取ると。あなたは、接着剤の部分的な量を使用する必要がありますだけで十分なピンセットの頭をカバーする。また、彼らは接着シャットダウンにならないように、あなたのピンセットの先端を拭き取ることを確認してください。
顕微鏡下で、二重幼虫が正しい位置にまだあるか確認してください。それが上になっている場合は、手順8を参照してください。
今、幼虫を処理するために使用するピンセットで、幼虫をピックアップし、接着剤の新たなパッチにそっと置きます。黒口のフックが近くやカバースリップの端に位置し、彼らや茶色の気門がどちらも接着剤に接触されていることを確認します。
慎重にそれを平らに幼虫を押し下げて。
今幼虫が所定の位置にあることを、あなたがそれらをテストしたい物質を管理することができます。
あなたが物質を策定し、それを摂取するために幼虫の頭が小さい線量に配置するために注射器を使用する場合、これが最善実現されます。
最後に、心拍数は、1分で気門のパルス数をカウントすることによって観察することができます。

その場で ：解剖と心拍数を数える：

準備は半ば腹縦軸に沿ってスリットであり、平坦な固定。準備皿は片側に付着した磁気テープでスライドガラス（VWR）（ベストリテールアウトできるように買収）から成っていた。磁気ストリップの中央の穴は、準備が透過光で表示することができます。解剖ピン（ファイン科学ツール、WA）は曲げとペーパークリップに接着されています。ペーパークリップを簡単に代わりのフィレット準備を保持するために磁気テープに操縦されています。記録皿のこのタイプは、以前は次のリーチ腹神経索（ミュラーら、1981）から分離された神経を固定の利用のために記載されている。

解剖プレート上でそのまま3齢幼虫を置きます。気管がキューティクルによって表示されなくなるまで、その腹側に幼虫を回転させる。
無傷の幼虫で4本のピンを配置。二つのピンは、口のフックのどちら側に移動し、2つのピンは気門の両側に行く。
生理食塩水追加、および水平方向の切開をヘッドピンから短い距離を確認して、縦軸の長さがダウンして水平方向の切開を続行します。
真の心からの短い距離を切削停止。気門真の心の周りとサイドに沿ってカット。
one背側のピンを持ち上げて、キューティクルの下にそれをフック。体腔を開き、開いたままの状態を広めるためにピンを使用してください。残りのピンでこれを繰り返します。
気管や心臓のどちらかを傷つけないように注意しながら、内臓を取り除く。これは、いくつかの構造が心臓に接続されていて削除した場合、それを損傷することができることに留意されたい。これらは、いくつかの脂肪体、そして脳が含まれています。あなたが勇気を除去しながら引き伸ばされ心を見ることができる場合、その構造を削除しようとすぐに停止。

心臓は、現在公開され、実験条件への暴露の準備ができています。

図2。直接心臓を表示するには、第³齢幼虫の腹解剖。解剖後、その後ろに動物を確保すると、直接そのままでまたはCNSせずに心臓の化合物を適用するために使用されます。小さな矢印は、心臓と大動脈がtransected背脈管研究のために分離されている場所を示しています（下記参照）。 Trは、気管、SP、気門、H、ハート、AO、大動脈。

この解剖手法は、直接ショウジョウバエの幼虫の心臓（区及びSingh、1995）の薬理学的作用物質を評価するために使用されています。解剖の時間は3-6分です。製剤は、郭清後の3〜5分間HL3生理食塩水を浴びながら、リラックスして許可されます。

HL3の生理食塩水は、慎重にHRが低いpH（Badre ら、2005）での高pHと速度で遅くなるので、pH7.2でなるように制御した。区とシン（1995）心の薬理学的解析のためにpHが7.0を使用しても維持可能性を示した。これらの試験中に生理食塩水は、ビーカーに、21ゲージの針を通して、繰り返し注入する生理食塩水を介して液の撹拌によって通気残った。

HRを定量化するため、直接観測を使用することができますまたは画像は、VHSテープや画面上の再生のためのデジタルカメラに記録することができます。フォトダイオードの方法は、以前に（Dasariとクーパー、2006）に記載されています。

熱ショックへのエクスポージャー：

幼虫を解剖。
カバープレート上で解剖の準備を置きます。
熱水浴。
カバープレートの温度プローブをフロートさせることによってバスの内部の温度を確認してください。
槽内の温度が満足できる、場所の準備およびカバープレート。
時間の所望の量のために準備しておきますと終了時に削除します。

一つは、全てのヒートパルスと温度が彼らの実験に必要なものを使用することができます。

電気的ペースに心臓を駆動。

開放端に挿入し、シールシリンジを使用し、生理食塩水が（HL3）電極に飛んで、室温（21℃）を描画することにより焦点電極（直径約20ミクロン）を記入してください。その目をチェックし、マニピュレータに電極をマウントします。電子線は、電極内部に生理食塩水内にあり、刺激がオフになっています。
解剖顕微鏡でショウジョウバエの幼虫3齢幼虫の心臓解剖の準備を置き、所定の位置に固定します。準備のピンと側面との接触を避けるために慎重に、準備の生理食塩水にアース線を置きます。
必要に応じて、顕微鏡の焦点調整、心臓の上部に電極の先端を配置するためにマニピュレータを使用してください。これを実現する最良の方法は、先端を下に移動させながら電極に集中することです。
先端が位置にあると認識されると、刺激（モデルS9グラスインスツルメンツ、クインシー、マサチューセッツ州、米国）は0.5の最低の設定で1ミリ秒と電圧に、2 Hzの周波数での時間をオンにする必要があります。遅延設定は、12と14の間でなければなりません。
心臓のリズムを観察しながら、周波数は約3 Hzにオンにする必要がありますと見られる心臓のリズムが刺激によって生成されるリズムに対応するまで、電圧は徐々に増加した。通常は解剖フライ心臓は非常に刺激のリズムが本質的な率より高いとき、心臓が見られる、約2 Hzの周波数でビート、心臓は通常より速い速度で打つために見られます。電圧は、準備が使えなくなって、細胞の損傷は、高電圧で発生する可能性があるとして、約20 Vを超えてはならない。典型的には、距離と心で作成されたシールに応じて、2〜8 Vの間に心臓を刺激することができます。
最大電圧に達すると何の効果が見られない場合、極性を逆にすることができます。これがまたうまくいかない場合、プローブはより良い心臓で接続を確立するために移動する必要があります。
刺激駆動型のリズムが確立されると、リズムが頻度と期間の設定を変えることによって操作することができます。それは、4 Hz以上の周波数は、テタニーに心を置くことができる、しかし、知られてなされるべきである。種々のアルコールおよび薬理学的薬剤を添加することができると、目的のリズムが確立されると、ギャップ結合に対する影響を観察することができます。ブロックされたギャップ結合は、現在を実施していないと伝播リズムが停止します。

してくださいここをクリックしてこの図の拡大バージョンを参照すること。

電場電位を測定する。

ガラス電極はKimaxガラス（：1.5ミリメートル外径）から作られています。ガラス管は、10〜20μmの範囲の内径とパッチのヒントを生成するために引っ張られ、ファイアーポリッシュされています。
電極の内腔は、入浴媒体で満たされている。コンピュータへのライン上にアンプや録音は、細胞内記録は以下を使用するものと同じです。
"マクロパッチ"記録電極（Stühmer ら、1983）の内腔は心臓の領域の上に直接配置されます。筋線維の自発的ペーシングは、焦点電極で監視できる電場電位を生成する。
ケアは優しくルーメンを低下させ、監視される心臓の各領域にそれを上げることによって付与する必要があります。電位は、マクロパッチ電極を介して記録されます。

心拍数と監視電気的事象の直接的なカウントが可能です。これらの電位を記録しながら入浴のメディアを変更すると、また電場電位の影響ロバに実現可能です。

細胞内電位を測定します。

心臓の領域は3 M KClで埋め鋭い細胞内電極（20〜30オームの抵抗）でimpaledれる心筋細胞の膜電位を監視する。標準的なヘッドステージと細胞内記録用アンプを使用することができ、しかし、我々は（Molecular Devices社、サニーベール、カリフォルニア州、米国）モデルは2B Axonclampアンプと1 X LUヘッドステージを使用。、Dasari ら 2007;。Dasariとクーパー2006;。それは2005年、心臓の尾方端がより剛性であり、この収縮は、この地域では時間（Badre らの大部分を開始するので、ペースメーカー細胞が存在する場所であることが表示されます）。

Acknowledgments

生物学の部門でのG.のリブルフェローシップ、ケンタッキー州若手研究者と学部教育=ユリーカで提供される資金調達！事務所（ケンタッキー大）。

Materials

Dissection tools: Fine #5 tweezers and fine scissors (all obtained from Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139)
Dissecting microscope with zoom function for dissection and counting heart rate. For focal stimulation of the heart this is needed as well.
For extracellular and intracellular recordings a compound microscope with upright objectives (4 x and 20X) is used.
Standard intracellular amplifier and A/D board for on line recording to a computer. Electrical signals are recorded on line to a PowerLab/4s interface (ADInstruments, Australia). We use standard software from ADInstruments named Chart or Scope.
Chemicals: All saline chemicals are obtained from Sigma chemical company (St. Louis, MO).
For intracellular recordings we use glass capillary tubing (catalogue # 30-31-0 from FHC, Brunswick, ME, 04011, USA) and for focal macropatch recording and stimulating electrodes we use Kimax-51, Kimble Products Art. No. 34502, ID 0.8-1.1mm, length 100mm. The intracellular electrode should have a resistance of 20 to 30 mOhm. The macropatch electrode is constructed by breaking off the tip of the glass after a fine tip was made from an electrode puller. The broken off tip needs to be a clean perpendicular break about 20μM in diameter. The tip is then heat polished to about 10μM inner diameter for the focal extracellular recording. For the stimulating electrode to drive the heart we use a final tip of about 20-50 μM in diameter. The shaft of the electrode is run over a heating element to cause it to bend about 45 degrees with a gradual bend. This produces a flat or perpendicular electrode lumen over the heart tube as the angle with the micro-manipulator will produce about another 45 degrees to the preparation.

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