Função de monitorização cardíaca em larval Drosophila melanogaster Para estudos fisiológicos

Summary

Apresentamos várias maneiras de monitorar a função cardíaca na larva de

Abstract

Apresentamos vários métodos para gravar a função cardíaca no larval

Protocol

INTRODUÇÃO

Os mecanismos celulares na função do coração para os insetos e vertebrados são surpreendentemente similares Drosophila melanogaster estão sendo utilizados para a investigação de mutações genéticas que são responsáveis ​​por estados de doença em outros animais, incluindo seres humanos (Bier e Bodmer, 2004;.. Peron et al, 2009). Agora várias doenças estão sendo induzidas por esse organismo tractable genética (Dowse et al, 1995;. Johnson et al, 1998;. Ganetzky, 2000; Bier e Bodmer, 2004;. Ocorr et al, 2007a, b) e com a esperança de que na terapia de gene tempo pode ser testado para recuperar a função normal. Além disso Drosophila servir como um bom modelo para função fisiológica em um nível celular.

Muitos dos estudos anteriores sobre a Drosophila coração têm sido direcionados para aspectos do desenvolvimento do embrião (Azpiazu e Frasch 1993, Bodmer 1993, Bodmer et al. 1990). Alguns estudos de uma função fisiológica ocorreu nas fases de pré-pupa, pupa ou adulto (Ashton et al, 2001;. Ele e Adler, 2001; Molina e Cripps, 2001; Ponzielli et al, 2002;. Sláma e Farkas, 2005; Wessells e Bodmer, 2004). No entanto, a fase de pupa é uma das metamorfoses e hormônios mudando, assim como vários flutuante aminas biogênicas. Também o coração está sofrendo uma transformação estrutural que pode provar ser difícil de controlar para as variáveis ​​quando se investiga a fisiologia dos miócitos (Dulcis et al 2005;. Johnson et al 2002;. Miller, 1997; Papaefthimiou e Theophilidis, 2001). O coração é conhecido por ser miogênica na fase larval e pode ser facilmente removido ou deixados no local enquanto era banhado por uma solução salina fisiológica definida para limitar as variáveis ​​de composição, tais como hormônios circulantes ou peptídeos (Dowse et al 1995;.. Johnson et al 1997 ; Dasari e Cooper, 2006; Feng et al 2004).. A natureza miogênica do coração larval é comparável ao coração de mamíferos em que há pacemakers que impulsionam o resto do coração para bombear o líquido em uma direção para ser eficaz em órgãos de banho. A natureza cronotrópica e ionotrópicos do coração larval Drosophila é de interesse uma vez que poderia servir como um meio rápido de testar os princípios fundamentais e efeitos patológicos para a função do coração de mamíferos, bem como uma ajuda para desenvolver um modelo comparativo para a fisiologia celular, como a regulação iônica do células pacemaker.

O coração larval é muito suscetível a aminas biogênicas e peptídeos que variam na hemolinfa dependendo da fonte de alimentos ou estado intrínseco do animal (Dasari e Cooper, 2006; Johnson et al 1997, 2000;.. Nichols et al 1999; Zornik et al . 1999). Abordando como compostos endógenos ou exógenos influenciar o coração mecanicamente é de interesse. Inseticidas possivelmente romance com menos efeitos sobre outros organismos podem ser desenvolvidas se obter uma melhor compreensão da fisiologia de insetos e farmacologia.

O mecanismo celular de ação dos neurotransmissores e moduladores cardíaca em larva não foram descritas até à data, não houve suficiente compreensão das correntes iônicas e tipos de canais presentes no coração larval que contribuem e regulamentar a atividade pacemaker. Tanto quanto sabemos, não há relatos documentando gravações extracelular ou intracelular de miócitos para avaliar correntes iônicas para enfrentar os efeitos mecanicista de moduladores em larval Drosophila.

Neste relatório, apresentamos vários métodos para registro da freqüência cardíaca e as propriedades fisiológicas do coração larval.

MÉTODOS

Larvas intactas:

1. Um bom meio de visualizar um coração batendo intacta larval é diretamente com um microscópio, no entanto, a larva deve permanecer ainda o suficiente para contar das contrações. Nós métodos de desenvolvimento para monitor de freqüência cardíaca em se movimentar livremente larvas, bem como larvas contido. Dependendo entes uma abordagem experimental pergunta poderia ser mais adequado do que outros.
2. Estas abordagens poderiam ser usados ​​para acompanhar o indivíduo durante longos períodos de tempo se o cuidado é usado para evitar a desidratação. Estes métodos também podem ser usados ​​para avaliar agentes farmacológicos introduzido na dieta ou para analisar vários momentos no desenvolvimento de linhas de mutação ou com a indução de genes de choque térmico.
3. O método irrestrito primeiro termo que o "Ant Farm". Esta técnica consiste em duas placas de vidro espaçadas por uma fina camada de alimento das larvas. As larvas são capazes de ser visualizado dentro de um plano de foco. Esta técnica também foi usada para monitorar a atividade elétrica pelo movimento circadiano em larva (Cooper e Cooper, 2004). Esta técnica consiste em duas placas de vidro (lâminas de microscópio; 75 x 25 mm; J. Melvin Marca Freed) estreitamente espaçadas (1 a 1.5 mm) separados por uma fina camada de larvas de alimentos (por exemplo, farinha de milho úmido uma versão modificada do Lewis, 1960), para que as larvas são capazes de ser visualizado dentro de um plano de foco. Espaçadores comumente usado para placas de gel de eletroforese (mini gel Bio-Rad, Life Science Research, Hercules, CA 94547, EUA) funcionam muito bem, uma vez que podem ser comprados com espessura variável para uso com 1, 2 ou 3 larvas procedimentos fazenda de formigas. Também uma opção é usar um plástico sólido de uma dada espessura e cortar a região a ser usado como espaço de rastreamento.
4. Para evitar que as larvas de rastejando para fora das bordas de duas placas de vidro de plástico da espessura desejada é usado. Ligeiramente inclinando a plataforma de 20 a 45 graus causa a larvas de permanecer, a maior parte do tempo, com a cabeça apontada para baixo e sua cauda contendo os espiráculos acima o alimento ou dentro de uma passagem de ar na camada de alimentos.
5. Este "Técnica Ant Farm", também permite que imagens de vídeo dentro de um único avião com alimentos de espessura uniforme. Nesta configuração as larvas tendem a não rastrear todo o alimento, mas ao invés de comer e passar gradual em torno do plano 2D. A luz branca é projetado a partir da parte de baixo do estágio do microscópio com um espelho para que ele possa ser movido em conformidade, para o melhor contraste do coração ou da traquéia dois que se movem enquanto o coração se contrai. Um microscópio (zoom ajustável 0,67-4,5; Instrumento de precisão Mundial; Modelo 501379) é usado. Um objetivo básico 2X e 0.5X tubo objetivo é usado para obter resolução suficiente espacial e ampliação para cobrir um retângulo de um centímetro por 0,5 cm. Uma câmera montada através de uma montagem trinocular é usado (Mintron, MTV; Mundial instrumento de precisão). A temperatura ambiente é mantida a 20 ° C.

   
   Figura 1. Vista dorsal de um 3 ^º intacta larva instar. O movimento da traquéia devido a puxar dos anexos do coração é usada para observar a freqüência cardíaca.

6. Para monitorar o animal se movimentar livremente um pode colocar algumas gotas de uma mistura de alimentos diluir sobre a cabeça dos animais. Isto deve ser feito em um prato de vidro para que a luz transmitida pode passar através das larvas para a visualização do tubo de coração. A microscopia mesmo configurado como descrito acima pode ser usado para assistir a batida do coração e obter conta.
7. Outra abordagem é coibir a larva para um local usando fita dupla pau numa lâmina de vidro e colocar o lado ventral da larva para a fita (Baker et al., 1999). No entanto, esta abordagem não funciona bem se a fita for molhado ao alimentar as larvas. Para evitar a fita recebendo uma molhada pode usar vaselina (injetados a partir de uma pequena agulha em torno da base das larvas e ao redor da borda da fita). Aqui se pode alimentar larva ao longo do tempo sem ter que perseguir as larvas para o plano de foco ou enquanto ele está se movendo em um prato. Se alguém deseja libertar as larvas a fita pode ser umedecido e ele perde é adesividade ao animal.

Se alguém não está interessado em libertar as larvas para a experimentação pode-se usar o método permanente de restringir a larva colando o animal a uma lâmina de vidro. Com o uso de super cola método, o animal pode comer e até mesmo ser coberto por uma solução úmida, permanecendo aderido à lamínula de vidro. Os procedimentos são:

1. Dê uma lâmina limpa e coloque uma lamínula em uma extremidade do mesmo.
2. Coloque uma pequena bagatela de super cola em um dos cantos da lamínula.
3. Localize sua larva Drosophila e removê-lo do tubo de ensaio.
4. Coloque a larva em uma placa de Petri e lave-o com uma pequena quantidade de água para remover qualquer alimento em excesso.
5. Absorva fresagem alimentos com o canto de um tecido ou papel toalha pequena.
6. Gentilmente pegar larva com uma pinça e colocá-lo no seu slide na extremidade oposta do seu lamínula.
7. Coloque o slide sob o microscópio e ajustar seu empresta a larva. A larva deve estar em seu estômago para cima com a sua volta a enfrentar. Você pode distinguir entre os dois lados da larva, porque as costas com dois "Racing Stripes", que são a traquéia. O estômago tem fraco ranhuras horizontais correndo ao longo dela com muito finos pêlos pretos.
8. Se a larva está enfrentando a maneira errada, basta rodar o caminho certo suavemente invertê-lo com suas pinças.
9. Com um novo conjunto de pinças utilizadas especificamente para cola tomar um dab pequeno da queda no final de sua tampa de deslizamento e colocá-lo no canto do lado oposto. Você deve usar uma quantidade fracionada de cola, apenas o suficiente para cobrir a cabeça da pinça. Além disso, certifique-se de limpar as extremidades de seu pinças para que não fiquem colados fechada.
10. Sob o microscópio, verifique para ter certeza de que a larva ainda está na posição correta. Se ele tiver virado, consulte a etapa oito.
11. Agora, com a pinça usada para lidar com larva, pegar a larva ecolocá-lo suavemente sobre a mancha fresca de cola. Certifique-se os ganchos boca negra estão localizados perto ou na borda da lamínula e nem eles ou dos espiráculos castanho entrar em contato com a cola.
12. Cuidadosamente pressione a larva para achatar-se.
13. Agora que a larva está no lugar, você pode administrar as substâncias que você deseja testá-los.
14. Este é o melhor feito se você usar uma seringa para elaborar o conteúdo e colocá-lo em pequenas doses por cabeça da larva para que ele ingerir.
15. Finalmente, a freqüência cardíaca pode ser observado através da contagem do número de pulsos do espiráculos em um minuto.

In situ: Dissecção e contando freqüência cardíaca:

Os preparativos são cortadas ao longo do eixo longitudinal ventral e preso plana. O prato preparação consistiu em uma lâmina de vidro (VWR) com fita magnética (Best Buys varejo out-let) aderiram a um dos lados. Um buraco no centro da tira magnética permite a preparação para ser visto com luz transmitida. Pinos de dissecação (Fine Ferramentas Científico, WA) são dobradas e coladas para clipes de papel. Os clipes de papel são facilmente manobrado na fita magnética para manter a preparação em filetes no lugar. Este tipo de prato a gravação tenha sido previamente descritas para utilização de pinagem gânglios isolados do cordão nervoso ventral leech (Muller et al., 1981).

1. Lugar intacto 3 larva instar na placa de dissecação. Girar larva em seu lado ventral da traquéia até já não são visíveis através da cutícula.
2. Coloque quatro pinos na larva intacta. Dois pinos de ir em ambos os lados dos ganchos, boca e dois pinos de ir em ambos os lados da espiráculos.
3. Adicionar soro fisiológico, e fazer uma incisão horizontal de uma pequena distância dos pinos de cabeça, em seguida, continuar com uma incisão horizontal ao longo do comprimento do eixo longitudinal.
4. Parar de cortar a uma curta distância do coração verdadeiro. Cortar em torno do coração verdadeiro e ao lado dos espiráculos.
5. Levante um pino dorsal e ligá-lo debaixo da cutícula. Use o pino para abrir a cavidade do corpo e espalhá-lo aberto. Repita este procedimento com os pinos restantes.
6. Retire as tripas, tendo o cuidado para não danificar tanto a traquéia ou coração. Deve-se notar que algumas estruturas estão ligados ao coração e pode danificá-lo se for removido. Estes incluem vários órgãos de gordura, e do cérebro. Se você pode ver o coração ser esticado ao remover a coragem, pare imediatamente de tentar remover essa estrutura.

O coração agora está exposto e pronto para a exposição às condições experimentais.

Figura 2. Dissecção Ventral de um 3 ^º instar para ver o coração diretamente. Pinagem do animal em suas costas após a dissecção é usado para aplicar diretamente os compostos sobre o coração, com ou sem o SNC intacto. Pequena seta indica onde o coração ea aorta são separados para transeccionados estudos vaso dorsal (ver abaixo). Tr, Traquéia, Sp, espiráculos; H, Coração; AO, Aorta.

Esta técnica de dissecação tem sido usado para avaliar diretamente agentes farmacológicos sobre o coração de larvas de Drosophila (Gu e Singh, 1995). O tempo de dissecção é de 3-6 min. A preparação é permitido relaxar enquanto banhada em HL3 salina por 3-5 min após a dissecção.

A solução salina HL3 foi cuidadosamente controlada para ser a pH 7,2 HR desde diminui em pH elevado e acelera a baixo pH (Badre et al., 2005). Gu e Singh (1995) pH 7,0 utilizado para a análise farmacológica do coração e também mostrou a viabilidade mantida. Durante essas experiências, a solução salina aerada permaneceu por agitação de solução salina através repetidamente injetáveis, através de uma agulha calibre 21, para um copo.

Para quantificar HR ou observações diretas podem ser usados ​​ou as imagens podem ser gravadas em fitas VHS ou uma câmera digital para reprodução em uma tela. Um método fotodiodo tem sido descrita (Dasari e Cooper, 2006).

Exposição a choque térmico:

1. Dissecar larva.
2. Coloque a preparação dissecados na chapa de cobertura.
3. Banho de água de calor.
4. Verifique a temperatura dentro do banho, flutuando uma sonda de temperatura em uma placa de cobertura.
5. Quando a temperatura é a preparação lugar satisfatório, e placa de cobertura em banho.
6. Deixe em preparação para um período de tempo desejado e retire quando terminar.

Pode-se usar o que cada pulso de calor e temperatura necessários para a sua experimentação.

Eletricamente dirigir o coração ao ritmo:

1. Preencher um eletrodo focal (cerca de 20 mícrons de diâmetro), usando uma seringa inserido e selado na extremidade aberta e chamando a temperatura ambiente (21 ° C) voam salina (HL3) para o eletrodo. Monte o eletrodo para o manipulador, verificando se thfio e está na solução salina no interior do eletrodo eo estimulador é desligado.
2. Coloque uma larva Drosophila terceiro instar larval coração preparação dissecados no microscópio de dissecação e fixá-lo no lugar. Coloque o fio de aterramento para a solução salina da preparação cuidadosa, para evitar o contato com os pinos e as laterais da preparação.
3. Use o manipulador para posicionar a ponta do eletrodo para o topo do coração, ajustando o foco do microscópio, conforme necessário. A melhor maneira de conseguir isso é se concentrar no eletrodo enquanto se move para baixo da ponta.
4. Quando a ponta é percebida para a posição, o estimulador (Instruments modelo S9 Grass, Quincy, Massachusetts, EUA) deve ser ligado com a freqüência de 2 Hz, duração com 0,5 a 1 ms e tensão na configuração mais baixa. A configuração do atraso deve ser entre 12 e 14.
5. Ao observar o ritmo cardíaco, a freqüência deve ser voltado para cerca de 3 Hz ea voltagem aumentada lentamente até que o ritmo do coração visto corresponde ao ritmo produzido pelo estimulador. Normalmente, o coração voar dissecados batidas em uma freqüência de, aproximadamente, 2 Hz, portanto, quando o ritmo estimulada é maior que a taxa intrínseca, o coração será visto, o coração será visto a bater em um ritmo mais rápido que o normal. Tensão não deve ultrapassar cerca de 20 V como dano celular pode ocorrer com tensões elevadas, tornando a preparação inútil. Tipicamente, pode-se estimular o coração entre 2 e 8 V, dependendo da distância e criou o selo sobre o coração.
6. Se a tensão máxima é atingida e nenhum efeito é visto, a polaridade pode ser invertida. Se isso também não funcionar, a sonda deve ser movido para melhor estabelecer uma conexão para o coração.
7. Uma vez que um ritmo de estimulação driven é estabelecida, o ritmo pode ser manipulada pela variação da freqüência e configurações de duração. Deve ser dado a conhecer, no entanto, que as freqüências acima de 4 Hz pode colocar o coração em tetania. Vários álcoois e agentes farmacológicos podem ser adicionados e seus efeitos sobre junções podem ser observados uma vez que o ritmo desejado é estabelecido. Junções bloqueados não conduzir uma corrente eo ritmo propagada cessará.
   
   
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Medir potenciais de campo:

1. Eletrodos de vidro são feitas a partir Kimax de vidro (diâmetro externo: 1,5 mm). O tubo de vidro é puxado e fogo-polido para produzir dicas patch com diâmetros que variam dentro de 1-20 mM.
2. O lúmen do eletrodo é preenchido com o meio de banho. O amplificador e gravação on-line a um computador é o mesmo que é utilizado abaixo para as gravações intracelular.
3. Lúmen do eletrodo um "macro-patch" de gravação (Stühmer et al., 1983) é colocado diretamente sobre uma região do coração. O ritmo espontâneo das fibras musculares produzem um potencial de campo que podem ser monitoradas com o eletrodo focal.
4. Cuidado deve ser dado com cuidado diminuição do lúmen e elevá-la sobre cada região do coração a ser monitorado. Os potenciais são gravados através de um eletrodo de macro-patch.

Contagem direta da frequência cardíaca ea monitorização de eventos elétrica é possível. Alterando os meios de comunicação de banho, enquanto o registro destes potenciais também é viável para avaliar os efeitos sobre os potenciais de campo.

Medir potenciais intracelulares:

Para monitorar os potenciais transmembrana dos miócitos uma região do coração é empalado com eletrodo intracelular afiado (20-30 resistência mOhm) cheia com 3 M KCl. A fase de cabeça padrão e amplificador para a gravação intracelular pode ser usada, no entanto usamos um modelo Axonclamp 2B (dispositivos Molecular, Sunnyvale, CA, EUA), amplificador e um estágio de X cabeça LU. Parece que a extremidade caudal do coração é mais rígida e é aí que residem as células marcapasso desde contração inicia nesta região a maior parte do tempo (Badre et al, 2005;. Dasari e Cooper 2006; Dasari et al, 2007. ).

Materials

Dissection tools: Fine #5 tweezers and fine scissors (all obtained from Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139) Dissecting microscope with zoom function for dissection and counting heart rate. For focal stimulation of the heart this is needed as well. For extracellular and intracellular recordings a compound microscope with upright objectives (4 x and 20X) is used. Standard intracellular amplifier and A/D board for on line recording to a computer. Electrical signals are recorded on line to a PowerLab/4s interface (ADInstruments, Australia). We use standard software from ADInstruments named Chart or Scope. Chemicals: All saline chemicals are obtained from Sigma chemical company (St. Louis, MO). For intracellular recordings we use glass capillary tubing (catalogue # 30-31-0 from FHC, Brunswick, ME, 04011, USA) and for focal macropatch recording and stimulating electrodes we use Kimax-51, Kimble Products Art. No. 34502, ID 0.8-1.1mm, length 100mm. The intracellular electrode should have a resistance of 20 to 30 mOhm. The macropatch electrode is constructed by breaking off the tip of the glass after a fine tip was made from an electrode puller. The broken off tip needs to be a clean perpendicular break about 20μM in diameter. The tip is then heat polished to about 10μM inner diameter for the focal extracellular recording. For the stimulating electrode to drive the heart we use a final tip of about 20-50 μM in diameter. The shaft of the electrode is run over a heating element to cause it to bend about 45 degrees with a gradual bend. This produces a flat or perpendicular electrode lumen over the heart tube as the angle with the micro-manipulator will produce about another 45 degrees to the preparation.