Övervakning av hjärtfunktion i Larvernas Drosophila melanogaster För fysiologiska studier

Summary

Vi presenterar olika sätt att kontrollera hjärtfunktionen hos larven av

Abstract

Vi presenterar olika metoder för att spela in hjärtfunktion i larvernas

Protocol

INLEDNING

Den cellulära mekanismer i funktion i hjärtat för både insekter och ryggradsdjur är förvånansvärt likartade Drosophila melanogaster används för att undersöka genmutationer som är ansvariga för sjukdomstillstånd i andra djur inklusive människor (Bier och Bodmer, 2004;.. Peron et al, 2009). Nu olika sjukdomar håller på att induceras i denna lätthanterlig genetiska organism (pendla et al, 1995;. Johnson et al, 1998;. Ganetzky, 2000; Ocorr et al, 2007a, b; Bier och Bodmer, 2004.) Och med förhoppningen att i tid genterapi kan testas för att återfå normal funktion. Dessutom Drosophila tjäna som en bra modell för fysiologisk funktion på cellnivå.

Många av de tidigare studier på Drosophila hjärtat har riktats mot utvecklingsmässiga aspekter i embryot (Azpiazu och Frasch 1993, Bodmer 1993, Bodmer et al. 1990). Ett fåtal studier av fysiologisk funktion inträffade före PUPP-, PUPP-eller vuxna stadier (Ashton et al, 2001;. Han och Adler, 2001; Molina och Cripps, 2001; Ponzielli et al, 2002;. Slama och Farkas, 2005; Wessells och Bodmer, 2004). Men puppstadium är en av metamorfos och förändrade hormoner samt varierande olika biogena aminer. Även hjärtat genomgår strukturomvandling som kan visa sig vara svårt att kontrollera för variabler vid utredning fysiologi myocyter (Dulcis et al 2005;. Johnson et al 2002;. Miller, 1997; Papaefthimiou och Theophilidis, 2001). Hjärtat är känd för att vara myogenic i larvstadiet och kan lätt tas bort eller lämnas kvar på platsen samtidigt som badade med en viss fysiologisk koksaltlösning för att begränsa kompoundering variabler såsom cirkulerande hormoner eller peptider (pendla et al 1995;.. Johnson et al 1997 , Dasari och Cooper, 2006; Feng et al 2004).. Den myogenic typ av larver hjärtat är jämförbar med däggdjur hjärtat i att det finns pacemaker som driver resten av hjärtat att pumpa vätska i en riktning att vara effektiv i att bada organ. Den kronotrop och ionotropic art Drosophila larver hjärtat är intressant då den kan tjäna som en snabb sätt att testa grundläggande principer och patologiska effekter för däggdjur hjärtfunktion samt hjälpa till att utveckla en jämförande modell för cellulär fysiologi såsom joniska reglering av pacemaker celler.

Den larver hjärta är mycket känsliga för biogena aminer och peptider som varierar i hemolymph beroende på föda eller inneboende tillstånd av djuret (Dasari och Cooper, 2006; Johnson et al 1997, 2000;.. Nichols et al 1999; Zornik et al . 1999). Som handlar om hur endogena eller exogena substanser påverkar hjärtat mekaniskt är av intresse. Möjligen roman insekticider med mindre effekter på andra organismer kan utvecklas om vi får en bättre förståelse av insekter fysiologi och farmakologi.

Det cellulära verkningsmekanismen för de neurotransmittorer och hjärt-modulatorer i larv har inte beskrivits hittills eftersom det inte har tillräcklig förståelse för de jonströmmar och typer kanal som finns i larvernas hjärtat som bidrar och reglerar pacemaker aktivitet. Så vitt vi vet, det finns inga rapporter dokumenterar extracellulära eller intracellulär inspelningar av myocyter att bedöma jonströmmar att ta itu med mekanistiska effekter av modulatorer i larver Drosophila.

I denna rapport presenterar vi olika metoder för att mäta puls och fysiologiska egenskaper larver hjärtat.

METODER

Intakt larver:

1. Ett bra sätt att visualisera en intakt slå larver hjärta är direkt med ett mikroskop, men måste larven fortfarande tillräckligt för att räknas av sammandragningar. Vi utveckla metoder för att övervaka hjärtfrekvens i fritt rörliga larver samt återhållen larver. Beroende på de experimentella fråga en strategi skulle kunna vara mer lämpade än andra.
2. Dessa metoder kan användas för att följa en individ under lång tid om vården används för att undvika uttorkning. Dessa metoder kan också användas för att bedöma läkemedel som man introduceras i kosten eller för att undersöka olika tillfällen under utveckling i mutationsstatus linjer eller med induktion av gener värme chock.
3. Den första ohämmad metod vi kallar "Ant Farm". Denna teknik består av två glasplattor placerade sönder av ett tunt lager av larver mat. Larverna kan synliggöras i ett plan av fokus. Denna teknik användes också för att övervaka av elektriska aktiviteten dygnsrytm rörelse i larv (Cooper och Cooper, 2004). Denna teknik består av två glasplattor (objektglas, 75 x 25 mm, J. Melvin Freed Brand) snävt placerade (1 till 1.5 mm) sönder av ett tunt lager av larver livsmedel (t.ex. fuktiga majsmjöl, en modifierad version av Lewis, 1960) så att larver kunna visualiseras på ett plan av fokus. Distanser som vanligen används för gel electrophoreses plattor (mini gel Bio-Rad, biovetenskaplig forskning, Hercules, CA 94.547, USA) fungerar mycket bra eftersom de kan köpas med varierande tjocklek för användning med 1, 2 eller 3: e INSTAR larver Ant Farm förfaranden. Också ett alternativ är att använda en solid plast av en viss tjocklek och skär ut den region som ska användas som krypande utrymme.
4. För att förhindra att larver från kryper ut från kanterna på två plattor av glaset en plast i önskad tjocklek används. Något att luta plattformen vid 20 till 45 grader gör att larverna att förbli, pekade majoriteten av tiden, med huvudet nedåt och deras svans som innehåller spiracles ovan maten eller inom en luftpassage i maten lager.
5. Denna "Ant Farm Technique" låter också video bildhantering inom ett och samma plan med mat av enhetlig tjocklek. I denna konfiguration larver brukar inte krypa under hela maten, men istället för att äta och gradvis flytta runt i 2D-plan. Vitt ljus projiceras från undersidan av mikroskop scenen med en spegel så att den kan flyttas därför för bästa kontrast i hjärtat eller de två luftstrupen som rör sig medan hjärta kontrakt. Ett mikroskop (justerbar zooma från 0,67 till 4,5, World precisionsinstrument, modell 501.379) används. En 2X bas objektiv och rör målet 0,5 x används för att få tillräcklig rumslig upplösning och förstoring för att täcka en 1 cm med 0,5 cm rektangel. En monterad kamera via en Trinokulärt fäste används (Mintron, MTV, World precisionsinstrument). Den omgivande temperaturen hålls vid 20 ° C.

   
   Figur 1. Ryggfenan bild av en intakt 3: ^e INSTAR larv. Förflyttning av luftstrupen på grund av att dra av bilagor från hjärtat används för att observera pulsen.

6. För att övervaka fritt rörliga djur kan man placera några droppar av en utspädd mat blandningen över djuren huvudet. Detta bör göras i en glasskål så att ljus kan passera genom larverna för visualisering hjärtat röret. Samma mikroskopi inrättas enligt ovan kan användas för att titta på hjärtslag och få räknas.
7. Ett annat tillvägagångssätt är att begränsa larven till en plats genom att använda dubbel tejp på en glasplatta och placera den ventrala sidan av larven till bandet (Baker et al., 1999). Men denna metod fungerar inte om bandet blir blöt när du matar larverna. För att undvika att bandet att bli blöt man kan använda vaselin (injiceras av en liten nål runt basen av larverna och kring bandet kanten). Här kan man mata larv över tiden utan att behöva jaga larver i fokus planet eller när den rör sig på ett fat. Om man vill frigöra larverna bandet kan fuktas och tappar det sin vidhäftning till djuret.

Om man inte är intresserad av att befria larverna för experiment kan man använda permanent metod för besöksförbud larven genom limning djuret till en glasskiva. Med hjälp av superlim metod, kan djuret äta och även att ingå i en fuktig lösning medan resterande anslutit sig till skyddsglaset halka. Förfarandena är:

1. Ta en ren bild och lägg ett täckglas i ena änden av den.
2. Sätt en liten klick superlim på ena hörnet av omslaget halka.
3. Leta reda på Drosophila larv och ta bort den från provröret.
4. Placera larven i en petriskål och skölj den med en liten mängd vatten för att avlägsna eventuella matrester.
5. Sug upp brotschning mat med hörnet av en liten vävnad eller pappershandduk.
6. Försiktigt plocka upp larv med pincett och placera den på bilden på den motsatta änden från ditt täckglas.
7. Placera objektglaset i mikroskop och justera din lånar på larven. Larven bör ligga på magen med ryggen uppåt. Du kan skilja mellan de två sidorna av larven eftersom ryggen har två "racing stripes" som är luftstrupen. Magen har svaga horisontella spår längs den med mycket fina svarta hår.
8. Om larven är vänd åt fel sätt, helt enkelt vända på rätt sätt genom att försiktigt vrida den över med pincett.
9. Med en ny uppsättning av pincett som används specifikt för lim ta en liten klick från drop i slutet av ditt täckglas och placera den i hörnet av den andra änden. Du bör använda en bråkdel mängd lim, bara tillräckligt för att täcka huvudet av pincett. Se också till att du torka bort ändarna av din pincett så att de inte blir limmade igen.
10. Under mikroskop, dubbel kontrollera att larven är fortfarande i rätt läge. Om den har vält, se steg åtta.
11. Nu, med pincett används för att hantera larv, plocka upp larven ochplacera den försiktigt på nytt plåster av lim. Kontrollera att den svarta munnen krokarna ligger nära eller på kanten av locket glida och varken de eller den bruna spiracles kommer i kontakt med limmet.
12. Tryck försiktigt ner på larven att platta ut den.
13. Nu när larven är på plats kan du administrera de ämnen som du vill testa dem.
14. Detta sker bäst om du använder en spruta för att dra upp ämnet och placera den i små doser av larven huvud för att den ska förtäras.
15. Slutligen kan hjärtfrekvens följas genom att räkna antalet pulser i spiracles på en minut.

In situ: Dissection och räkna hjärtfrekvens:

Förberedelserna skärs upp längs mitten av ventrala längsgående axel och nålas platt. Beredningen maträtt bestod av en glasskiva (VWR) med magnetband (Bästa Köpen detaljhandel out-låt) följs åt sidan. Ett hål i mitten av magnetremsan kan preparatet ses med ljus. Analysera stift (Fin vetenskapliga verktyg, WA) är böjda och limmade till gem. Den gem är lättmanövrerad på magnetband att hålla filead förberedelser på plats. Denna typ av inspelning maträtt har tidigare beskrivits för utnyttjande av fastlåsning ganglier isolerade från akterliket ventrala nerv sladd (Muller et al., 1981).

1. Placera intakt 3:e INSTAR larv på dissekering tallrik. Rotera larv på ventrala sidan tills luftstrupen är inte längre syns genom nagelbanden.
2. Placera fyra stift i intakt larven. Två stift går på vardera sidan av munnen krokar och två pinnar gå på båda sidor av spiracles.
3. Tillsätt salt, och gör ett horisontellt snitt en liten bit från huvudet stiften, fortsätt sedan med ett horisontellt snitt ner längden på den längsgående axeln.
4. Sluta skära en liten bit från det sanna hjärtat. Skär runt hjärtat och längs sidan spiracles.
5. Lyft en rygg-pin och haka fast den under nagelbanden. Använd stiftet för att öppna kroppens hålrum och öppnade den. Upprepa detta med de återstående stiften.
6. Ta bort tarmar, var försiktig så du inte skadar vare sig luftstrupen eller hjärtat. Det bör noteras att vissa strukturer är kopplade till hjärtat och kan skada den om bort. Dessa inkluderar flera feta kropp och hjärna. Om du kan se hjärtat som utsträckta samtidigt tar bort tarmar, omedelbart sluta att försöka ta bort denna struktur.

Hjärtat är nu utsatta och klar för exponering för experimentella förhållanden.

Figur 2. På magen dissekering av en 3: ^e INSTAR att visa hjärtat direkt. Fastlåsning av djuret på rygg efter dissektion används för att direkt tillämpa föreningar på hjärtat med eller utan CNS intakt. Liten pil visar var hjärtat och stora kroppspulsådern är separerade för transected rygg fartyg studier (se nedan). Tr, luftstrupe, SP, spiracles, H, hjärta, AO, aorta.

Denna dissektion Tekniken har använts för att direkt bedöma farmakologiska agenter på hjärtat i Drosophila larver (GU och Singh, 1995). Den dissektion tiden är 3-6 min. Beredningen är tillåtet att koppla av medan badade i HL3 saltlösning i 3-5 minuter efter dissekering.

Den HL3 saltlösning var noga för att vara vid pH 7,2 eftersom HR-bromsar vid höga pH och snabbar upp vid lägre pH (Badre et al., 2005). Gu och Singh (1995) används pH 7,0 för farmakologisk analys av hjärtat och visade också underhållas livskraft. Vid dessa försök koksaltlösning förblev kolsyrat genom agitation lösning genom upprepade injicera saltlösning, genom en 21-gauge kanyl, i en bägare.

För att kvantifiera HR antingen direkta observationer kan användas eller bilder kan spelas in på VHS-band eller en digitalkamera för uppspelning på en skärm. En fotodiod metod har tidigare beskrivits (Dasari och Cooper, 2006).

Exponering för värme chock:

1. Dissekera larv.
2. Placera dissekerade preparatet på täckplåten.
3. Värm vattenbad.
4. Kontrollera temperaturen inne i badet med flytande en temperaturgivare på en täckplåt.
5. När temperaturen är tillfredsställande, placera beredning och täckplåt i Bath.
6. Låt beredning i en önskad tid och ta bort när du är klar.

Man kan använda vad varje värme puls och temperatur som krävs för deras experiment.

Elektriskt köra hjärtat till takten:

1. Fyll en samlingspunkt elektrod (ca 20 mikrometer i diameter) med hjälp av en spruta in och förseglas på den öppna änden och dra i rumstemperatur (21 ° C) flyga koksaltlösning (HL3) i elektroden. Montera elektroden i manipulatorn, kontrollera att ee tråd i saltlösning inuti elektroden och stimulatorn stängs av.
2. Placera en Drosophila larv 3:e INSTAR larver hjärta dissekerat preparatet på dissekera mikroskop och säkra den på plats. Lägg jordledaren i saltlösning av preparatet, noga med att undvika kontakt med stiften och sidor av preparatet.
3. Använd roboten till positionen spetsen på elektroden på toppen av hjärtat, justerar fokus för mikroskop som behövs. Det bästa sättet att uppnå detta är att fokusera på elektroden när du flyttar spetsen nedåt.
4. När spetsen uppfattas vara i position, bör stimulatorn (modell S9 Grass Instrument, Quincy, Massachusetts, USA) slås på med den frekvens vid 2 Hz, längd på 0,5 till 1 ms och spänning på den lägsta inställningen. Fördröjningen inställning bör vara mellan 12 och 14.
5. Samtidigt observerar hjärtats rytm, skall frekvensen vändas till cirka 3 Hz och spänningen sakta ökas tills hjärtats rytm sett motsvarar den rytm som produceras av stimulatorn. Normalt dissekerade flyga hjärtat slår med en frekvens på cirka 2 Hz, så när stimuleras rytm är högre än den inneboende takt kommer hjärtat att se, kommer hjärtat att se att slå snabbare än normalt. Spänning bör inte överstiga ca 20 V som cellskador kan uppstå vid höga spänningar, vilket gör preparatet värdelös. Vanligtvis kan man stimulera hjärtat mellan 2 och 8 V, beroende på avstånd och tätningen som skapas på hjärtat.
6. Om max spänning är uppnådd och ingen effekt ses, kan polariteten vändas. Om detta inte heller fungerar bör sonden flyttas till bättre upprätta en anslutning på hjärtat.
7. När en stimulering driven rytm är etablerad, kan rytmen manipuleras genom att variera frekvensen och inställningar varaktighet. Det bör dock känt att frekvenser över 4 Hz kan sätta hjärtat i tetani. Olika alkoholer och farmakologiska medel göras och deras inverkan på gap-junctions kan observeras när den önskade rytmen är etablerad. Blockerade gap-junctions gör inte en aktuell och propagerade rytm kommer att upphöra.
   
   
   Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Mät fältet potentialer:

1. Glas elektroder tillverkade av Kimax glas (ytterdiameter: 1,5 mm). Glasröret dras och brand-polerade för att producera patch tips med innerdiametrar från 10 till 20 mikrometer.
2. Lumen i elektroden är fylld med bad-mediet. Förstärkaren och inspelning på nätet till en dator är det samma som används nedan för den intracellulära inspelningar.
3. Lumen i en "makro-patch" inspelning elektrod (Stühmer et al., 1983) är placerad direkt över en region i hjärtat. Den spontana stimuleringen av muskelfibrerna producera ett fält potential som kan övervakas med fokus elektroden.
4. Försiktighet måste ges genom att försiktigt sänka lumen och höja den över varje region av hjärtat som skall övervakas. Möjligheterna registreras via ett makro-patch elektrod.

Direkt räkning av hjärtfrekvens och övervaka elektriska händelser är möjligt. Ändring av bad medierna under inspelning dessa potentialer är också möjligt att bedöma effekterna på fältet potential.

Mät intracellulär potential:

För att övervaka transmembrana potential i myocyter en region i hjärtat är spetsad med skarpa intracellulära elektrod (20 till 30 mOhm motstånd) fylld med 3 M KCl. En standard huvud scen och förstärkare för intracellulär registrering kan användas, men vi använt en modell Axonclamp 2B (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) förstärkare och en X LU huvudet skede. Det verkar som om caudal slutet av hjärtat är styvare och det är där pacemakern cellerna bor sedan sammandragning invigda i denna region majoriteten av tiden (Badre et al, 2005;. Dasari och Cooper 2006; Dasari et al, 2007. ).

Materials

Dissection tools: Fine #5 tweezers and fine scissors (all obtained from Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139) Dissecting microscope with zoom function for dissection and counting heart rate. For focal stimulation of the heart this is needed as well. For extracellular and intracellular recordings a compound microscope with upright objectives (4 x and 20X) is used. Standard intracellular amplifier and A/D board for on line recording to a computer. Electrical signals are recorded on line to a PowerLab/4s interface (ADInstruments, Australia). We use standard software from ADInstruments named Chart or Scope. Chemicals: All saline chemicals are obtained from Sigma chemical company (St. Louis, MO). For intracellular recordings we use glass capillary tubing (catalogue # 30-31-0 from FHC, Brunswick, ME, 04011, USA) and for focal macropatch recording and stimulating electrodes we use Kimax-51, Kimble Products Art. No. 34502, ID 0.8-1.1mm, length 100mm. The intracellular electrode should have a resistance of 20 to 30 mOhm. The macropatch electrode is constructed by breaking off the tip of the glass after a fine tip was made from an electrode puller. The broken off tip needs to be a clean perpendicular break about 20μM in diameter. The tip is then heat polished to about 10μM inner diameter for the focal extracellular recording. For the stimulating electrode to drive the heart we use a final tip of about 20-50 μM in diameter. The shaft of the electrode is run over a heating element to cause it to bend about 45 degrees with a gradual bend. This produces a flat or perpendicular electrode lumen over the heart tube as the angle with the micro-manipulator will produce about another 45 degrees to the preparation.