رصد وظيفة القلب في اليرقات ذبابة الفاكهة السوداء البطن للدراسات فسيولوجية

Summary

نقدم وسائل مختلفة لمراقبة وظيفة القلب في يرقة

Abstract

نقدم أساليب مختلفة لتسجيل وظيفة القلب في اليرقات

Protocol

مقدمة

الآليات الخلوية في وظيفة القلب لكل من الحشرات والفقاريات تشبه دهشة تستخدم ذبابة الفاكهة السوداء البطن للتحقيق طفرات الجينات المسؤولة عن المرض في الدول الحيوانات الأخرى بما في ذلك البشر (بيير وبودمر ، 2004 ؛. بيرون وآخرون ، 2009). ويجري الآن مختلف الأمراض التي يسببها في هذا الحي الوراثية لين العريكة (Dowse وآخرون ، 1995 ؛. جونسون وآخرون ، 1998 ؛. Ganetzky ، 2000 ؛ بيير وبودمر ، 2004 ؛. Ocorr وآخرون ، 2007a ، ب) وعلى أمل أن العلاج الجيني يمكن في وقت يتم اختبارها لاستعادة وظيفة عادية. بالإضافة ذبابة الفاكهة نموذجا جيدا للظيفة فسيولوجية على المستوى الخلوي.

وقد تم استهداف العديد من الدراسات السابقة على القلب ذبابة الفاكهة نحو الجوانب التنموية في جنين (Azpiazu وFrasch 1993 ، بودمر 1993 ، بودمير وآخرون 1990). عدد قليل من الدراسات وظيفة فسيولوجية وقعت في مراحل ما قبل العذراء ، العذراء أو الكبار (أشتون وآخرون ، 2001 ؛ هو وأدلر ، 2001 ؛ مولينا وكريبس ، 2001 ؛ Ponzielli وآخرون ، 2002 ؛. سلامه وفاركاس ، 2005 ؛ Wessells وبودمر ، 2004). إلا أن مرحلة العذراء هي واحدة من المسخ والهرمونات المتغيرة فضلا عن تذبذب الأمينات الاحيائية المختلفة. كما قلب يمر التحول الهيكلي الذي يمكن أن يكون من الصعب السيطرة على المتغيرات عند التحقيق في علم وظائف الأعضاء من myocytes (الحلو وآخرون 2005 ؛. جونسون وآخرون 2002 ؛ ميلر ، 1997 ؛ Papaefthimiou وTheophilidis ، 2001). ومن المعروف أن القلب عضلي في مرحلة اليرقات ، ويمكن بسهولة يمكن إزالتها أو اليسار في الموقع في حين يجري اغتسل من الماء المالح قبل الفسيولوجية المحددة للحد من تفاقم المتغيرات مثل الهرمونات أو الببتيدات (Dowse وآخرون 1995 ؛. جونسون وآخرون 1997 ؛ Dasari وكوبر ، 2006 ؛ فنغ وآخرون 2004). طبيعة مولدة للعضل القلب اليرقات مشابه لقلب الثدييات في أن هناك منظمات ضربات القلب التي تدفع بقية القلب على ضخ السوائل في اتجاه أن تكون فعالة في الهيئات الاستحمام. طبيعة ومؤثر على الميقاتية ionotropic القلب يرقات ذبابة الفاكهة هو من مصلحة لأنها يمكن أن تكون بمثابة وسيلة سريعة لاختبار المبادئ الأساسية والآثار المرضية لعمل القلب الثدييات فضلا عن المساعدة على تطوير نموذج للمقارنة الفيزيولوجيا الخلوية مثل تنظيم الأيونية من ناظمة الخلايا.

قلب اليرقات هو عرضة للغاية لالأمينات الاحيائية والببتيدات التي تختلف في الدملمف تبعا لمصدر الغذاء أو دولة لا يتجزأ من هذا الحيوان (Dasari وكوبر ، 2006 ؛ جونسون وآخرون 1997 ، 2000 ؛. نيكولز وآخرون 1999 ؛ Zornik وآخرون 1999). كيفية معالجة مركبات داخلية أم خارجية تؤثر على القلب ميكانيكيا هو المصالح. ويمكن تطوير المبيدات الحشرية رواية ربما مع عدد أقل من الآثار على الكائنات الحية الأخرى إذا أردنا الحصول على فهم أفضل لفسيولوجيا الحشرات والصيدلة.

لم تكن آلية عمل الخلايا العصبية والقلبية وجهري في اليرقة صفها حتى الآن كما لم يكن هناك فهم كاف للتيارات وأنواع القناة الأيونية الموجودة في قلب اليرقات التي تسهم في تنظيم النشاط وتنظيم ضربات القلب. بقدر ما نحن ندرك أنه لا توجد تقارير توثق تسجيلات خارج الخلية أو الخلايا من myocytes لتقييم التيارات الأيونية لمعالجة الآثار الميكانيكية للجهري في ذبابة الفاكهة اليرقات.

في هذا التقرير نعرض الأساليب المختلفة لتسجيل معدل ضربات القلب والخصائص الفيزيولوجية للقلب اليرقات.

طرق

يرقات سليمة :

1. وسيلة جيدة لتصور قلب ينبض سليمة اليرقات غير مباشرة مع المجهر ، ولكن يجب أن اليرقة لا تزال كافية لعدد من الانقباضات. علينا تطوير أساليب لرصد معدل ضربات القلب في التحرك بحرية اليرقات وكذلك يرقات قيدا. تبعا لتلك التجارب قد نهج سؤال واحد يكون أكثر ملاءمة من غيرها.
2. ويمكن استخدام هذه الأساليب لمتابعة الفرد على مدى فترات طويلة من الزمن إذا تم استخدام الرعاية لتجنب الجفاف. ويمكن أيضا أن تكون هذه الأساليب المستخدمة لتقييم وكلاء الدوائية التي أدخلت في النظام الغذائي أو لفحص أوقات مختلفة في التنمية في خطوط طفرية أو تحريض جينات صدمة الحرارة.
3. الأسلوب المقيد علينا أولا مصطلح "مزرعة النملة". هذا الأسلوب يتكون من ألواح الزجاج اثنين متباعدة عن بعضها بطبقة رقيقة من المواد الغذائية اليرقات. اليرقات هي قادرة على أن تصور داخل طائرة واحدة من التركيز. كما تم استخدام هذه التقنية لرصد النشاط الكهربائي من قبل الحركة الإيقاعية في اليرقة (كوبر وكوبر ، 2004). هذا الأسلوب يتكون من ألواح الزجاج اثنين (الشرائح المجهر ، و 75 × 25 مم ؛ J. الماركة فريد ملفين) متباعدة بصعوبة (1 إلى 1.5 ملم) وبصرف النظر عن طريق طبقة رقيقة من اليرقات الغذائية (مثل الذرة وجبة واحد في رطبة نسخة معدلة من لويس ، 1960) بحيث تكون قادرة على يرقات يمكن تصور داخل طائرة واحدة من التركيز. الفواصل المستخدمة عادة لوحات استخدام الاستشراد هلام (جل مصغرة بيو راد ؛ أبحاث العلوم الحياتية ، هرقل ، CA 94547 ، الولايات المتحدة) تعمل بشكل جيد للغاية حيث يمكن شراؤها مع اختلاف سماكة للاستخدام مع 1 ، 2 أو 3 يرقات النمل إجراءات مزرعة طور مرحلي. أيضا خيار هو استخدام البلاستيك الصلبة نظرا لسماكة وقطع المنطقة لاستخدام الفضاء الزحف.
4. لمنع اليرقات من الزحف إلى الخروج من حواف الصفائح اثنين من الزجاج يستخدم البلاستيك للسمك المطلوب. وأشار معظم الوقت ، مع إمالة الرأس قليلا المنصة من 20 إلى 45 درجة تسبب اليرقات في البقاء أو الهبوط والتي تحتوي على ذيلها spiracles أعلاه الطعام أو داخل ممر الهواء في طبقة الغذاء.
5. هذا "مزرعة النمل تقنية" يسمح أيضا للتصوير بالفيديو داخل طائرة واحدة مع الطعام من سمك موحد. في هذا التكوين اليرقات لا يميلون إلى الزحف عبر الغذاء ، ولكن بدلا من ذلك لتناول الطعام والانتقال التدريجي نحو 2D في الطائرة. ومن المتوقع أن الضوء الأبيض من الجانب السفلي للمرحلة المجهر مع مرآة بحيث يمكن نقله وفقا لأفضل النقيض من القلب أو القصبة الهوائية اللذين عقدا في حين أن تحرك القلب. ويستخدم مجهر (النموذجي 501379 التكبير تعديل ،67-4،5 ؛ ؛ العالم آلات دقيقة). الهدف هو استخدام قاعدة 2X وأنبوب الهدف 0.5X للحصول على ما يكفي من القرار المكانية والتكبير لتغطية 1cm بواسطة المستطيل 0.5 سم. وتستخدم كاميرا محمولة من خلال تحميل trinocular (Mintron ، MTV ، البنك آلات دقيقة). المحافظة على درجة الحرارة المحيطة 20 درجة مئوية.

   
   الشكل 1. الظهرية نظرا لحالها 3 يرقة طور مرحلي ^{الثالثة.} وتستخدم حركة القصبة الهوائية بسبب الانسحاب من المرفقات من القلب لمراقبة معدل ضربات القلب.

6. لمراقبة الحيوانات تتحرك بحرية مكان واحد يمكن أن بضع قطرات من مزيج مخفف الغذاء على رأس الحيوان. وينبغي أن يتم ذلك في طبق زجاج ضوء ذلك يمكن أن تنتقل عن طريق تمرير اليرقات لتصور أنبوب القلب. يمكن استخدام نفس المجهري إعداد كما هو موضح أعلاه لمشاهدة ضربات القلب ، والحصول على التهم الموجهة إليه.
7. نهج آخر هو لكبح اليرقة إلى مكان واحد باستخدام عصا الشريط المزدوج على شريحة زجاجية ووضع الجانب البطنية من يرقة إلى الشريط (بيكر وآخرون ، 1999). بيد أن هذا النهج لا تعمل بشكل جيد إذا كان الشريط تحصل على الرطب عند تغذية اليرقات. ويمكن لتجنب الحصول على واحد الشريط الرطب استخدام الفازلين (حقن من إبرة صغيرة حول قاعدة اليرقات وحول حافة الشريط). هنا يمكن للمرء أن تغذية يرقات بمرور الوقت دون الحاجة لملاحقة اليرقات في الطائرة أو التركيز في الوقت الذي تتحرك على طبق. يمكن إذا كان أحد يرغب في أن تكون حرة اليرقات الشريط مبلل ويفقد صوقية انها لهذا الحيوان.

إذا ليست مهتمة واحد في تحرير اليرقات عن التجريب يمكن للمرء استخدام أسلوب دائم التضييق على اليرقة بواسطة لصق الحيوان إلى شريحة زجاجية. مع استخدام أسلوب الغراء عظمى ، لا يمكن للحيوان يأكل وحتى تكون مشمولة في حل رطبة في حين تبقى انضمت إلى زلة تغطية الزجاج. الإجراءات هي :

1. تأخذ شريحة نظيفة ومكان زلة تغطية في نهاية واحدة منها.
2. وضع الداب صغيرة من superglue في زاوية واحدة من انزلاق الغطاء.
3. يرقة ذبابة الفاكهة تحديد موقع وإزالته من أنبوب اختبار.
4. مكان اليرقة في طبق بتري وشطفه مع كمية صغيرة من الماء لإزالة أي نوع من الطعام الزائد.
5. امتصاص المواد الغذائية مع التوسيع زاوية صغيرة أو الأنسجة منشفة ورقية.
6. اختيار برفق مع ملاقط اليرقة ووضعه على الشريحة على الطرف المقابل من زلة تغطية الخاص بك.
7. ضع الشريحة تحت المجهر وضبط الخاص يضفي على يرقة. وينبغي أن تكون اليرقة على بطنه مع صعودا والخمسين التي تواجه الوراء. يمكنك التمييز بين جانبى اليرقة بسبب ظهورهم ميزة اثنين "المشارب سباقات" التي هي القصبة الهوائية. المعدة وأخاديد أفقية على طول خافت مع شعر أسود ناعم جدا.
8. إذا اليرقة تواجه الطريقة غير صحيحة ، قم ببساطة على الطريق الصحيح من خلال التقليب برفق أكثر مع ملاقط الخاص.
9. مع مجموعة جديدة من ملاقط تستخدم خصيصا لاتخاذ الغراء الداب صغيرة من الهبوط في نهاية الغطاء الخاص زلة ووضعه في زاوية من الطرف المقابل. يجب استخدام كمية من الغراء فركأيشنلي ؛ يكفي لتغطية الرأس من ملاقط. أيضا ، تأكد من تمحو نهايات ملاقط الخاص بحيث لا تصبح لصقها مغلقة.
10. تحت المجهر ، ومضاعفة التحقق للتأكد من اليرقة لا يزال في الموضع الصحيح. إذا كان لديه سلم ، راجع الخطوة ثمانية.
11. الآن ، مع ملاقط تستخدم للتعامل مع يرقة ، والتقاط اليرقة ووضعها برفق على التصحيح جديدة من الغراء. تأكد تقع بالقرب من خطاطيف سوداء الفم أو على حافة الانزلاق الغطاء وليس لديهم أو spiracles البني تأتي في اتصال مع الغراء.
12. اضغط بعناية إلى الأسفل على يرقة لتتسطح بها.
13. الآن أن يرقة في مكان ، يمكنك إدارة المواد التي ترغب في اختبارها.
14. هو أفضل إنجاز هذا إذا كنت تستخدم المحاقن لوضع مضمون ووضعه في جرعات صغيرة من رأس اليرقة لأنها لاستيعاب.
15. أخيرا ، يمكن ملاحظة أن معدل ضربات القلب عن طريق حساب عدد النبضات من spiracles في دقيقة واحدة.

في الموقع : تشريح والفرز معدل ضربات القلب :

ان التحضيرات شق على طول المحور الطولي منتصف بطني ودبس المسطحة. وتألفت لإعداد طبق شريحة زجاجية (VWR) مع الشريط المغناطيسي (بايز أفضل من ترك التجزئة) انضمت إلى جانب واحد. ثقب في وسط الشريط المغناطيسي يسمح ليتم عرضه مع إعداد الضوء المرسل. ويعكف دبابيس تشريح (أدوات العلمية الجميلة ، WA) ولصقها على لقطات ورقة. وناور بسهولة القصاصات الورقية على الشريط المغناطيسي لاجراء إعداد شرائح في المكان. وقد طبق هذا النوع من تسجيل الموصوفة سابقا للاستفادة من تعلق العقد العصبية معزولة عن علقة الحبل البطني (مولر وآخرون ، 1981).

1. مكان سليمة اليرقة 3 طور مرحلي على لوحة التشريح. تدوير اليرقة على جانبها بطني حتى القصبة الهوائية لم تعد مرئية من خلال بشرة.
2. قبل أربعة دبابيس في يرقة سليمة. انتقل اثنين من المسامير على جانبي الفم السنانير ، واثنين من دبابيس يذهب على أي جانب من spiracles.
3. إضافة المالحة ، وجعل شق أفقي على بعد مسافة صغيرة من دبابيس الرأس ، ثم يستمر مع شق أفقي أسفل على طول المحور الطولي.
4. وقف قطع مسافة قصيرة من القلب الحقيقي. خفض حول القلب الحقيقي وجنبا الى جنب مع spiracles.
5. رفع one دبوس الظهرية وربط ذلك تحت بشرة. استخدام دبوس لفتح تجويف الجسم وانتشاره المفتوحة. كرر هذا الأمر مع دبابيس المتبقية.
6. إزالة الشجاعة ، والحرص على عدم الاضرار إما القصبة الهوائية أو القلب. وتجدر الإشارة إلى أن بعض الهياكل هي التي تعلق على القلب ويمكن أن تلحق الضرر لو تمت إزالته. وتشمل هذه الهيئات الدهون عديدة ، والدماغ. إذا كنت تستطيع رؤية القلب مشدودا أثناء إزالة الشجاعة ، ووقف على الفور في محاولة لإزالة هذا الهيكل.

يتعرض الآن للقلب وعلى استعداد للتعرض لظروف تجريبية.

الشكل 2. تشريح بطني من طور مرحلي ^{الثالثة} 3 لعرض القلب مباشرة. تعلق الحيوان على ظهره بعد تشريح يستخدم مباشرة لتطبيق هذه المركبات على القلب مع أو بدون الجهاز العصبي المركزي سليمة. سهم صغير يشير إلى حيث يتم فصل القلب والشريان الأبهر مقطوع لدراسات سفينة الظهرية (أنظر أدناه). آر والقصبة الهوائية ، SP ، Spiracles ؛ H ، القلب ، AO ، الأورطى.

وقد استخدمت هذه التقنية لتقييم التشريح وكلاء الدوائية مباشرة في القلب من يرقات ذبابة الفاكهة (قو وسينغ ، 1995). الوقت هو تشريح 3-6 دقيقة. ولا يسمح للإعداد للاسترخاء بينما تستحم في HL3 المالحة لمدة 3-5 دقيقة بعد تشريح.

وتمت السيطرة بعناية المالحة HL3 أن تكون على درجة حموضة 7.2 الموارد البشرية منذ تباطؤ في درجة الحموضة عالية وبسرعة تصل إلى أدنى درجة الحموضة (بدر وآخرون ، 2005). وتستخدم غو سينغ (1995) 7.0 درجة الحموضة للتحليل الدوائي للقلب وكذلك أظهرت جدوى الاحتفاظ بها. خلال هذه التجارب لا تزال في المياه المالحة الهوائية بواسطة تسخين المياه المالحة حل عن طريق الحقن بشكل متكرر ، من خلال إبرة عيار 21 ، في دورق.

لتحديد الموارد البشرية يمكن أن تستخدم إما مباشرة أو ملاحظات يمكن تسجيلها على الصور على أشرطة VHS أو كاميرا رقمية للقراءة على الشاشة. وهناك طريقة الضوئي قد سبق ووصف (Dasari وكوبر ، 2006).

التعرض لصدمة الحرارة :

1. تشريح اليرقة.
2. إعداد مكان تشريح على لوحة الغلاف.
3. حرارة مياه الاستحمام.
4. الاختيار داخل درجة حرارة الحمام التي تطفو فيها مسبار الحرارة على لوحة الغلاف.
5. عندما تكون درجة الحرارة مرضية ، وإعداد مكان لوحة الغلاف في الحمام.
6. إجازة في التحضير لفترة من الوقت المطلوب ، وإزالة عند الانتهاء.

يمكن للمرء استخدام كل ما نبض الحرارة ودرجة الحرارة المطلوبة لإجراء التجارب الخاصة بهم.

محرك كهربائي للقلب وتيرة :

1. ملء الوصل الكهربائي (حوالي 20 ميكرون في القطر) باستخدام حقنة ومختومة إدراجها في نهاية مفتوحة والرسم على درجة حرارة الغرفة (21 درجة مئوية) يطير المالحة (HL3) إلى القطب. جبل القطب في تتلاعب ، والتحقق من أن اله السلك هو في المياه المالحة داخل القطب وتحولت قبالة مشجعا.
2. يرقة ذبابة الفاكهة مكان القلب 3 اليرقات طور مرحلي إعداد تشريح على مجهر تشريح وثبته في مكانه. سلك التأريض مكان في المياه المالحة لإعداد والحرص على تجنب الاتصال مع دبابيس وجوانب الإعداد.
3. استخدام مناور لموقف غيض من القطب على الجزء العلوي من القلب ، وضبط تركيز المجهر حسب الحاجة. أفضل طريقة لتحقيق ذلك هي التركيز على القطب بينما تتحرك لأسفل الحافة.
4. عندما ينظر إلى الطرف ليكون في موقف ، ينبغي أن تحول مشجعا (صكوك نموذجية غراس S9 ، كوينسي ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة) على وتيرة مع 2 في هرتز ، في مدة 0،5-1 مللي والجهد على أدنى الإعداد. يجب أن يكون الإعداد تأخير ما بين 12 و 14.
5. مع مراعاة إيقاع القلب ، ينبغي أن تتحول إلى وتيرة ما يقرب من 3 هرتز وزيادة الجهد ببطء حتى إيقاع القلب المشاهدة يتوافق مع الإيقاع التي تنتجها مشجعا. عادة تشريح القلب يطير يدق في تواتر ما يقرب من 2 هرتز ، وذلك عندما إيقاع حفز هو أعلى من معدل الذاتية ، وسوف ينظر إلى القلب ، سوف ينظر إلى القلب ينبض بمعدل أسرع من المعتاد. وينبغي أن لا يتجاوز الجهد نحو 20 الخامس وتلف الخلايا يمكن أن تحدث في الفولتية العالية ، مما يجعل من إعداد عديمة الفائدة. عادة ، يمكن للمرء أن تحفز القلب ما بين 2 و 8 V ، اعتمادا على المسافة وختم إنشاؤها على القلب.
6. إذا تم التوصل إلى أقصى قدر من الجهد ، ويعتبر أي تأثير ، يمكن عكس القطبية. إذا كان هذا أيضا لا يعمل ، يجب أن يتم نقل التحقيق الى إقامة أفضل اتصال على القلب.
7. بمجرد إنشاء إيقاع التحفيز مدفوعة ، يمكن التلاعب بها من خلال تغيير إيقاع وتيرة وضبط المدة. ينبغي أن يكون ومعروفة ، مع ذلك ، أن الترددات فوق 4 هرتز يمكن وضع القلب في تكزز. يمكن إضافة الكحولات المختلفة وكلاء الدوائية ويمكن ملاحظة تأثيرها على تقاطعات الفجوة مرة يتم تأسيس الإيقاع المطلوب. سدت الفجوة التقاطعات لا تجري حاليا وإيقاع نشر سيتوقف.
   
   
   الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من هذا الرقم.

قياس امكانات الحقل :

1. أقطاب كهربائية مصنوعة من الزجاج زجاج Kimax (القطر الخارجي : 1.5 ملم). يتم سحب الأنبوب والزجاج المصقول النار لانتاج نصائح التصحيح داخل بأقطار تتراوح بين 10 و 20 ميكرون.
2. يملأ تجويف القطب المتوسطة مع الاستحمام. مكبر للصوت وتسجيل على الانترنت لجهاز كمبيوتر هو نفسه الذي استعمل أدناه للحصول على تسجيلات داخل الخلايا.
3. لمعة من القطب تسجيل 'الكلي التصحيح" (Stühmer وآخرون ، 1983) وضعت مباشرة فوق منطقة القلب. وسرعة عفوية من ألياف العضلات إنتاج حقل المحتملة التي يمكن رصدها مع القطب التنسيق.
4. الرعاية يجب إعطاء عن طريق خفض بلطف لمعة ورفعه فوق كل منطقة من القلب ليتم رصدها. وتسجل من خلال الامكانات الكهربائي الكلي التصحيح.

العد المباشر من معدل ضربات القلب ورصد الأحداث الكهربائية هو ممكن. تغيير وسائل الإعلام الاستحمام في حين تم تسجيل هذه الإمكانيات أيضا الممكنة لتقويم التأثيرات على امكانات الحقل.

قياس إمكانات الخلايا :

لرصد الامكانات عبر الغشاء من myocytes هو مخوزق منطقة القلب الكهربائي داخل الخلايا حادة (20-30 المقاومة mOhm) مليئة بوكل م 3. ويمكن استخدام معيار المرحلة الرأس ومكبر للصوت لتسجيل داخل الخلايا ، ولكن كنا نموذجا Axonclamp 2B (الأجهزة الجزيئية ، سانيفيل ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) و 1 مكبر للصوت رئيس LU المرحلة العاشرة. يبدو أن نهاية الذيلية للقلب هي أكثر تصلبا وهذا هو المكان الذي يقيم خلايا تنظيم ضربات القلب منذ الانكماش يبدأ في هذه المنطقة غالبية من الوقت (بدر وآخرون ، 2005 ؛. Dasari وكوبر 2006 ؛ Dasari وآخرون ، 2007. ).

Materials

Dissection tools: Fine #5 tweezers and fine scissors (all obtained from Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139) Dissecting microscope with zoom function for dissection and counting heart rate. For focal stimulation of the heart this is needed as well. For extracellular and intracellular recordings a compound microscope with upright objectives (4 x and 20X) is used. Standard intracellular amplifier and A/D board for on line recording to a computer. Electrical signals are recorded on line to a PowerLab/4s interface (ADInstruments, Australia). We use standard software from ADInstruments named Chart or Scope. Chemicals: All saline chemicals are obtained from Sigma chemical company (St. Louis, MO). For intracellular recordings we use glass capillary tubing (catalogue # 30-31-0 from FHC, Brunswick, ME, 04011, USA) and for focal macropatch recording and stimulating electrodes we use Kimax-51, Kimble Products Art. No. 34502, ID 0.8-1.1mm, length 100mm. The intracellular electrode should have a resistance of 20 to 30 mOhm. The macropatch electrode is constructed by breaking off the tip of the glass after a fine tip was made from an electrode puller. The broken off tip needs to be a clean perpendicular break about 20μM in diameter. The tip is then heat polished to about 10μM inner diameter for the focal extracellular recording. For the stimulating electrode to drive the heart we use a final tip of about 20-50 μM in diameter. The shaft of the electrode is run over a heating element to cause it to bend about 45 degrees with a gradual bend. This produces a flat or perpendicular electrode lumen over the heart tube as the angle with the micro-manipulator will produce about another 45 degrees to the preparation.