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Biology

Überwachung Herzfunktion Larven Drosophila melanogaster Für physiologische Untersuchungen

doi: 10.3791/1596 Published: November 16, 2009

Summary

Wir präsentieren verschiedene Wege, um die Herzfunktion in der Larve des Monitors

Abstract

Wir präsentieren verschiedene Methoden, um die Herzfunktion in der Larven-Rekord

Protocol

EINFÜHRUNG

Die zellulären Mechanismen in der Funktion des Herzens sowohl für Insekten und Wirbeltiere sind verblüffend ähnlich Drosophila melanogaster zu werden für die Untersuchung von Gen-Mutationen, die für Erkrankungen in anderen Tieren einschließlich des Menschen (Bier und Bodmer, 2004 verwendet werden;.. Peron et al, 2009). Jetzt verschiedenen Krankheiten werden in diesem gefügig genetische Organismus induziert (.; Johnson et al, 1998;. Ganetzky, 2000; Dowse et al, 1995 Bier und Bodmer, 2004;. Ocorr et al, 2007a, b) und mit der Hoffnung, dass in der Zeit der Gentherapie kann wieder der normale Funktion getestet werden. Darüber hinaus Drosophila als ein gutes Modell für die physiologische Funktion auf zellulärer Ebene zu dienen.

Viele der früheren Studien an Drosophila Herzen haben auf entwicklungspsychologische Aspekte in den Embryo (Azpiazu und Frasch 1993, Bodmer 1993, Bodmer et al. 1990) ins Visier genommen. . Er und Adler, 2001;; Molina und Cripps, 2001; Ponzielli et al, 2002;. Sláma und Farkas, 2005 Ein paar Studien über physiologische Funktion in der Pre-Puppen, Puppen oder adulte Stadien (Ashton et al, 2001 eingetreten ist; Wessells und Bodmer, 2004). Doch das Puppenstadium ist eine Metamorphose und Veränderung Hormone sowie schwankende verschiedenen biogenen Aminen. Auch das Herz ist im Strukturwandel Transformation, die als schwierig erweisen, um Variablen zu kontrollieren, wenn die Untersuchung der Physiologie der Myozyten können (Dulcis et al 2005;. Johnson et al 2002;. Miller, 1997; Papaefthimiou und Theophilidis, 2001). Das Herz ist bekannt, dass sie im Larvenstadium myogene und können leicht entfernt werden, oder links in situ, während durch eine definierte physiologische Kochsalzlösung zum Compoundieren Variablen wie zirkulierende Hormone oder Peptide (Dowse et al 1995 zu begrenzen gebadet werden;.. Johnson et al 1997 ; Dasari und Cooper, 2006; Feng et al 2004).. Die myogene Natur der Larven Herz ist vergleichbar mit der Säugetier-Herz in, dass es Herzschrittmachern, dass der Rest des Herzens, Flüssigkeit in eine Richtung Pumpe wirksam zu sein in Baden Organe zu fahren. Die chronotropen und ionotropen Art der Drosophila Larve Herz ist von Interesse, da sie als schnelles Mittel könnten dazu dienen, die grundlegenden Prinzipien und pathologischen Effekte für Säugetier-Herz-Funktion Test sowie eine helfende, eine vergleichende Modell für Zellphysiologie wie ionische Regulierung der Entwicklung Schrittmacher-Zellen.

Die Larven Herz ist sehr anfällig für biogene Amine und Peptide, die in der Hämolymphe je nach Nahrungsquelle oder intrinsische Zustand des Tieres (Dasari und Cooper, 2006; Johnson et al 1997, 2000;.. Nichols et al 1999; Zornik et al . 1999). Addressing wie endogener oder exogener Verbindungen des Herzens beeinflussen mechanistisch von Interesse ist. Möglicherweise neue Insektizide mit weniger Auswirkungen auf andere Organismen entwickelt, wenn wir ein besseres Verständnis der Insekten Physiologie und Pharmakologie zu gewinnen.

Die zellulären Wirkmechanismus der Neurotransmitter und Herz-Modulatoren in Larve noch nicht beschrieben worden, um Datum, da es nicht genügend Verständnis für die Ionenströme und Kanal-Typen in der Larven-Herz, und einen Beitrag zu regulieren Schrittmacher-Aktivität wurden. Soweit wir wissen, gibt es keine Berichte dokumentieren extrazelluläre oder intrazelluläre Aufnahme von Myozyten zu Ionenströme zu beurteilen, die mechanistische Effekte von Modulatoren in larvalen Drosophila-Adresse.

In diesem Bericht präsentieren wir verschiedene Methoden, um die Herzfrequenz und physiologischen Eigenschaften der Larven Herzen aufzunehmen.

METHODEN

Intact Larven:

  1. Ein gutes Mittel, um das Bild eines intakten schlagen Larven Herz ist direkt mit einem Mikroskop, aber die Larve muss immer noch genug, um die Wehen zu zählen. Wir Entwicklungsmethoden, um die Herzfrequenz in frei beweglichen Larven als auch zurückhaltende Larven zu überwachen. Je nach denen experimentelle Frage ein Ansatz könnte besser geeignet sein als andere.
  2. Diese Ansätze könnten verwendet werden, um eine individuelle über längere Zeit zu folgen, wenn Sorgfalt verwendet wird, um eine Dehydratation zu vermeiden. Diese Methoden können auch verwendet werden, um pharmakologische Wirkstoffe in der Nahrung eingeführt beurteilen oder zu verschiedenen Zeitpunkten in der Entwicklung in Mutations-Linien oder mit der Induktion von Hitzeschock-Gene zu untersuchen.
  3. Die erste Methode, die wir hemmungslos Begriff der "Ant Farm". Diese Technik besteht aus zwei Glasplatten abgesehen von einer dünnen Schicht von Larven Nahrung verteilt. Die Larven sind in der Lage, innerhalb eines Fokusebene visualisiert. Diese Technik wurde auch verwendet, um durch elektrische Aktivität zirkadianen Bewegung in Larve (Cooper und Cooper, 2004) zu überwachen. Diese Technik besteht aus zwei Glasplatten (Objektträger, 75 x 25 mm; J. Melvin Freed Brand) eng beieinander (1 bis 1.5 mm) getrennt durch eine dünne Schicht von Larven Nahrung (zB feuchte Maismehl-eine modifizierte Version von Lewis, 1960), so dass die Larven in der Lage, innerhalb eines Fokusebene sichtbar sind. Abstandhalter häufig für Gelelektrophoresen Platten verwendet (Mini-Gel Bio-Rad, Life Science Research, Hercules, CA 94547, USA) arbeiten sehr gut, da sie mit unterschiedlicher Dicke für den Einsatz mit 1., 2. oder 3. Larvenstadium Ameisenfarm Verfahren erworben werden kann. Auch eine Möglichkeit ist, einen festen Kunststoff einer bestimmten Dicke zu verwenden und schneiden Sie die Region, die als Kriechen Raumnutzung.
  4. Um zu verhindern, Larven kriechen aus den Rändern der beiden Platten des Glases ein Kunststoff in der gewünschten Dicke verwendet wird. Leicht Kippen der Plattform auf 20 bis 45 Grad bewirkt, dass die Larven zu bleiben, wies die Mehrheit der Zeit, mit dem Kopf nach unten und den Schwanz mit den Luftlöcher oberhalb der Nahrung oder in einem Luftkanal in der Lebensmittel-Schicht.
  5. Diese "Ant Farm Technique" ermöglicht auch Video-Imaging in einer Ebene mit der Nahrung von gleichmäßiger Dicke. In dieser Konfiguration die Larven meist nicht in der gesamten Lebensmittelkette zu kriechen, sondern um zu essen und schrittweise zu bewegen in der 2D-Ebene. Weißes Licht ist von der Unterseite des Mikroskoptisches mit einem Spiegel projiziert, so dass es entsprechend für den besten Kontrast des Herzens oder die beiden Luftröhre, die während sich das Herz zusammenzieht bewegen bewegt werden. Ein Mikroskop (einstellbar zoom 0,67 bis 4,5; World Precision Instruments, Modell 501379) verwendet wird. A 2X Basis objektiver und Rohr Ziel 0.5X wird verwendet, um genügend räumliche Auflösung und Vergrößerung Verstärkung auf einen 1cm um 0,5 cm Rechteck Deckung. Eine montierte Kamera über einen trinokularen Halterung verwendet wird (Mintron, MTV, World Precision Instruments). Die Umgebungstemperatur ist bei 20 ° C gehalten

    Abbildung 1
    Abbildung 1. Dorsalansicht einer intakten 3 rd instar Larve. Die Bewegung der Luftröhre durch Ziehen der Anhänge von Herz wird verwendet, um die Herzfrequenz zu beobachten.

  6. Zur Überwachung der frei beweglichen Tier kann man ein paar Tropfen einer verdünnten Futtermischung über die Tiere den Kopf. Dies sollte in einer Glasschale getan werden, damit das übertragene Licht durch die Larven zur Visualisierung des Herzens Röhre passieren kann. Das gleiche Mikroskopie wie oben beschrieben eingestellt werden verwendet, um den Herzschlag zu beobachten und zu erhalten zählt.
  7. Ein weiterer Ansatz ist die Larve an einem Ort abzuhalten, indem Sie doppelt Klebeband auf einem Objektträger aus Glas und Platzierung der Bauchseite der Larve auf das Band (Baker et al., 1999). Doch dieser Ansatz funktioniert nicht gut, wenn das Band nass bei der Fütterung der Larven. Um zu vermeiden, das Band nass kann man benutzen Vaseline (aus einer kleinen Nadel um die Basis der Larven und rund um die Bandkante injiziert). Hier kann man Larve im Laufe der Zeit füttern, ohne dass die Larven in der Fokusebene Chase oder während sie auf einen Teller in Bewegung ist. Will man die Larven frei, die Band kann befeuchtet werden, und es verliert es Haftfähigkeit für das Tier.

Wenn man sich nicht befreien sich die Larven zum Experimentieren interessieren könnte man die endgültige Methode der Eindämmung der Larve durch Verkleben des Tieres auf ein Glasplättchen. Bei Verwendung von Sekundenkleber-Methode, kann das Tier zu essen und sogar in einem feuchten Lösung abgedeckt werden, während haften bleibt dem Deckglas. Die Verfahren sind:

  1. Nehmen Sie ein sauberes Bild und platzieren Sie ein Deckglas an einem Ende davon.
  2. Setzen Sie einen kleinen Klecks Sekundenkleber an einer Ecke des Deckglases.
  3. Suchen Sie Ihre Drosophila Larve und entfernen Sie sie aus dem Reagenzglas.
  4. Legen Sie die Larve in eine Petrischale und spülen Sie ihn mit einer kleinen Menge von Wasser, um überschüssiges Essen zu entfernen.
  5. Genießen Sie Reiben Essen mit der Ecke eines kleinen Gewebe-oder Papiertuch.
  6. Gently abholen Larve mit einer Pinzette und legen Sie es auf Ihrer Folie am gegenüberliegenden Ende vom Deckglas.
  7. Legen Sie den Objektträger unter dem Mikroskop und passen Sie Ihre verleiht auf der Larve. Die Larve sollte auf dem Bauch mit dem Rücken nach oben zeigen. Sie können zwischen den beiden Seiten der Larve zu unterscheiden, weil ihre Rücken zwei "Racing Stripes", die die Trachea Funktion. Der Magen hat schwache horizontale Rillen entlang mit sehr feinen schwarzen Haaren.
  8. Wenn die Larve ist mit Blick auf den falschen Weg, drehen Sie einfach den richtigen Weg durch leichtes Kippen darüber mit Ihrem Pinzette.
  9. Mit einer neuen Reihe von Pinzette speziell für Klebstoff, der verwendet einen kleinen Klecks aus der Dropdown am Ende Ihrer Deckglas und legen Sie sie an der Ecke der gegenüberliegenden Seite. Sie sollten eine geringfügig Leimmenge, gerade genug, um den Kopf der Pinzette zu decken. Stellen Sie außerdem sicher, dass Sie wischen den Enden der Pinzette, damit sie nicht zu tun zugeklebt.
  10. Unter dem Mikroskop überprüfen, um sicherzustellen, dass die Larve ist noch in der richtigen Position. Wenn es ausgeschaltet wurde über finden Sie in Schritt acht.
  11. Jetzt, mit der Pinzette zur Larve Griff, holen die Larven undlegen Sie sie sanft auf den frischen Fleck kleben. Achten Sie darauf, die schwarze Mundhaken in der Nähe oder am Rand des Deckglases befinden und weder sie selbst oder die braunen Luftlöcher in Kontakt mit dem Kleber kommen.
  12. Drücken Sie vorsichtig nach unten auf die Larve zu verflachen.
  13. Jetzt, wo die Larve in Kraft ist, können Sie verwalten die Stoffe, die Sie wünschen, um sie zu testen.
  14. Dies geschieht am besten, wenn Sie eine Spritze zur Ausarbeitung des Stoffes und legen Sie es in kleinen Dosen durch die Larve den Kopf für sie einnehmen zu verwenden.
  15. Schließlich kann die Herzfrequenz durch Zählen der Anzahl der Impulse des Luftlöcher in 1 Minute beobachtet werden.

In situ: Dissection und Zählen Herzfrequenz:

Die Vorbereitungen laufen Schlitz entlang der Mitte der ventralen Längsachse und merken sich flach. Die Vorbereitung Gericht bestand aus einem Glasträger (VWR) mit Magnetband (Best Buys Einzelhandel out-let) eingehalten zu einer Seite. Ein Loch in der Mitte der Magnetstreifen ermöglicht die Herstellung mit Durchlicht betrachtet werden. Dissecting Pins (Fine Scientific Tools, WA) sind gebogen und geklebt, um Büroklammern. Die Büroklammern sind leicht auf dem Magnetband manövriert, die filetiert Vorbereitung in Position zu halten. Diese Art der Aufzeichnung Gericht zuvor für die Nutzung der Pinning Ganglien aus dem Blutegel Bauchmark (Muller et al., 1981) isoliert beschrieben.

  1. Legen Sie intakten dritten Larvenstadium Larve auf Dissektion Platte. Drehen Larve auf ihrer Bauchseite, bis die Luftröhre nicht mehr durch die Kutikula sichtbar.
  2. Legen Sie vier Stifte in die intakte Larve. Zwei Stifte gehen auf beiden Seiten des Mundes Haken und zwei Stifte auf beiden Seiten der Luftlöcher zu gehen.
  3. Add Kochsalzlösung, und machen ein horizontaler Schnitt einen kleinen Abstand vom Kopf Pins, dann mit einem horizontalen Schnitt über die gesamte Länge der Längsachse weiter.
  4. Stoppen Sie schneiden nicht weit von den wahren Kern. Cut um das wahre Herz und an der Seite der Luftlöcher.
  5. Heben Sie eine dorsale Pin und haken Sie es unter der Nagelhaut. Verwenden Sie den Stift in die Leibeshöhle öffnen und breitete sie zu öffnen. Wiederholen Sie diesen mit der restlichen Pins.
  6. Entfernen Sie den Mut, darauf achten, daß entweder die Luftröhre oder Herzschäden. Es wird darauf hingewiesen, dass einige Strukturen des Herzens angebracht sind und diese schädigen können, wenn sie entfernt werden. Dazu gehören mehrere Fettkörper, und das Gehirn. Wenn Sie das Herz gestreckt, während das Entfernen der Eingeweide sehen können, sofort zu stoppen versuchen, diese Struktur zu entfernen.

Das Herz ist nun frei und bereit für die Exposition gegenüber experimentellen Bedingungen.

Abbildung 2
Abbildung 2. Ventral Sektion eines 3 rd instar das Herz direkt anzeigen lassen. Pinning des Tieres auf dem Rücken nach der Sektion wird verwendet, um direkt die Verbindungen auf dem Herzen, mit oder ohne ZNS intakt. Kleiner Pfeil zeigt an, wo das Herz und die Aorta durchtrennt für Rückengefäß Studien getrennt sind (siehe unten). Tr, Trachea, Sp, Luftlöcher, H Herz, AO, Aorta.

Diese Dissektionstechnik wurde genutzt, um direkt zu bewerten pharmakologische Wirkstoffe auf das Herz des Drosophila-Larven (Gu und Singh, 1995). Die Dissektion beträgt 3-6 min. Die Zubereitung ist erlaubt, zu entspannen, während in HL3 Kochsalzlösung für 3-5 min nach der Sektion gebadet.

Die HL3 Kochsalzlösung wurde sorgfältig kontrolliert, um bei pH 7,2, da HR verlangsamt bei hohen pH-Wert und beschleunigt bei niedrigeren pH-Wert (Badre et al., 2005). Gu und Singh (1995) verwendet pH-Wert 7,0 für die pharmakologische Analyse von Herz und zeigte auch gepflegt Lebensfähigkeit. Bei diesen Versuchen ist die Saline blieb belüftet durch Schütteln der Lösung durch wiederholtes Injizieren von Kochsalzlösung, durch eine 21-Gauge-Nadel, in ein Becherglas.

Zur Quantifizierung HR entweder direkte Beobachtungen verwendet werden kann oder die Bilder können auf VHS-Kassetten oder eine digitale Kamera für die Wiedergabe auf einem Bildschirm aufgezeichnet werden. Eine Photodiode Methode hat bereits beschrieben (Dasari und Cooper, 2006).

Die Exposition gegenüber Hitzeschock:

  1. Dissect Larve.
  2. Legen Sie seziert Vorbereitung auf Abdeckplatte.
  3. Hitze Wasserbad.
  4. Prüfen Sie die Temperatur im Inneren des Bades durch schwimmende einen Temperaturfühler auf einer Abdeckplatte.
  5. Wenn die Temperatur befriedigend, Platz Vorbereitung und Abdeckplatte in Bad.
  6. Lassen Vorbereitung in eine gewünschte Menge an Zeit und zu entfernen, wenn Sie fertig.

Man kann verwenden, was jede Wärme Puls und Temperatur für ihre Experimente erforderlich.

Elektrisch fahren Herzen Schritt:

  1. Füllen Sie eine zentrale Elektrode (ca. 20 Mikrometer im Durchmesser) mit einer Spritze gesteckt und am offenen Ende verschlossen und Zeichnung der Raumtemperatur (21 ° C) fliegen Kochsalzlösung (HL3) in die Elektrode. Montieren Sie die Elektrode in den Manipulator, Überprüfung, dass the Draht wird in der Saline in der Elektrode und der Stimulator ausgeschaltet wird.
  2. Legen Sie eine Drosophila Larve 3. Larvenstadium Larven Herz seziert Vorbereitung auf die Präpariermikroskop und sichern Sie ihn. Legen Sie das Erdungskabel in die Saline von der Vorbereitung, die sorgfältige, den Kontakt mit den Stiften und den Seiten des Präparates zu vermeiden.
  3. Verwenden Sie den Manipulator an der Spitze der Elektrode auf der Oberseite des Herzens Lage, Einstellen des Fokus des Mikroskops, wie gebraucht. Der beste Weg, dies zu erreichen, ist auf der Elektrode Fokus während der Bewegung die Spitze nach unten.
  4. Wenn die Spitze wahrgenommen wird, in der Lage sein, sollte der Stimulator (Modell S9 Grass Instruments, Quincy, Massachusetts, USA) auf der Frequenz von 2 Hz gedreht, Dauer bei 0,5 bis 1 ms und Spannung auf die niedrigste Einstellung. Die Delay-Einstellung sollte zwischen 12 und 14 sein.
  5. Unter Beobachtung des Herzrhythmus, sollte die Frequenz auf etwa 3 Hz eingeschaltet und die Spannung langsam erhöht, bis der Herzrhythmus gesehen entspricht dem Rhythmus der Stimulator erzeugt. Normalerweise wird der sezierten fliegen Herz mit einer Frequenz von ca. 2 Hz Beats, so dass, wenn der stimulierten Rhythmus höher als die intrinsische Rate ist, das Herz zu sehen sein wird, wird das Herz zu sehen, um mit einer schnelleren Rate als normal schlagen. Die Spannung sollte nicht zu übertreffen etwa 20 V als Zell-Schäden können bei hohen Spannungen auftreten, so dass die Vorbereitung nutzlos. In der Regel kann man stimulieren das Herz zwischen 2 und 8 V, je nach Entfernung und das Siegel auf dem Herzen geschaffen.
  6. Falls die maximale Spannung erreicht ist und keine Wirkung zu sehen ist, kann die Polarität vertauscht werden. Wenn auch dies nicht funktioniert, sollte die Sonde bewegt, besser eine Verbindung auf dem Herzen.
  7. Sobald eine Stimulation angetrieben Rhythmus aufgebaut ist, kann der Rhythmus durch Variieren der Frequenz und der Dauer manipuliert werden. Es sollte bekannt sein, aber, dass Frequenzen oberhalb von 4 Hz kann das Herz in die Tetanie gebracht. Verschiedene Alkohole und pharmakologische Wirkstoffe hinzugefügt werden kann und ihre Wirkung auf Gap Junctions zu beobachten, wenn die gewünschte Rhythmus festgestellt werden. Blockierte Gap Junctions nicht einen Strom führen und die propagierte Rhythmus einzustellen.
    Abbildung 3

    Abbildung 4 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild zu sehen.

Messen Feldpotentiale:

  1. Glas Elektroden sind aus Kimax Glas (1,5 mm Außendurchmesser) hergestellt. Das Glasrohr gezogen und feuerpolierte to patch Tipps mit Innen-Durchmessern von 10 bis 20 um hergestellt.
  2. Das Lumen der Elektrode ist mit dem Bade Medium gefüllt ist. Der Verstärker und Aufzeichnung on line an einen Computer ist die gleiche wie die unten für die intrazelluläre Aufnahme genutzt werden.
  3. Das Lumen eines "Makro-patch" Aufnahme-Elektrode (Stühmer et al., 1983) wird direkt über einen Bereich der Herz gelegt. Die spontane Stimulation der Muskelfasern erzeugen ein Feld Potenzial, mit dem Schwerpunkt Elektrode überwacht werden kann.
  4. Pflege muss durch leichtes Absenken der Lumen und erhöhen sie über jeden Bereich des Herzens zu überwachenden gegeben werden. Die Potentiale sind durch ein Makro-Patch-Elektrode aufgezeichnet.

Direkte Zählung der Herzfrequenz und Überwachung von elektrischen Veranstaltungen ist möglich. Das Ändern der baden Medien während der Aufzeichnung dieser Potentiale ist auch möglich, zur Beurteilung der Auswirkungen auf das Feld Potenziale.

Messen intrazellulären Potentialen:

Um das transmembrane Potential der Myozyten eine Region des Herzens mit scharfen intrazellulären Elektrode (20 bis 30 mOhm Widerstand) mit 3 M KCl gefüllt aufgespießt zu überwachen. Ein Standard-Kopf Bühne und Verstärker für die intrazelluläre Aufnahme kann verwendet werden, allerdings benutzten wir ein Modell Axonclamp 2B (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) Verstärker und 1 X LU Kopf der Bühne. Es scheint, dass das kaudale Ende des Herzens mehr starr ist und das ist, wo der Schrittmacher-Zellen befinden, da Kontraktion initiiert in dieser Region die Mehrheit der Zeit (Badre et al, 2005;. Dasari und Cooper 2006; Dasari et al, 2007. ).

Acknowledgments

Förderung durch das G. Ribble Fellowships in der Abteilung für Biologie, das Kentucky Young Researchers und Undergraduate Education-Eureka zur Verfügung gestellt! Office (Univ. of KY).

Materials

  1. Dissection tools: Fine #5 tweezers and fine scissors (all obtained from Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139)
  2. Dissecting microscope with zoom function for dissection and counting heart rate. For focal stimulation of the heart this is needed as well.
  3. For extracellular and intracellular recordings a compound microscope with upright objectives (4 x and 20X) is used.
    Standard intracellular amplifier and A/D board for on line recording to a computer. Electrical signals are recorded on line to a PowerLab/4s interface (ADInstruments, Australia). We use standard software from ADInstruments named Chart or Scope.
  4. Chemicals: All saline chemicals are obtained from Sigma chemical company (St. Louis, MO).
  5. For intracellular recordings we use glass capillary tubing (catalogue # 30-31-0 from FHC, Brunswick, ME, 04011, USA) and for focal macropatch recording and stimulating electrodes we use Kimax-51, Kimble Products Art. No. 34502, ID 0.8-1.1mm, length 100mm. The intracellular electrode should have a resistance of 20 to 30 mOhm. The macropatch electrode is constructed by breaking off the tip of the glass after a fine tip was made from an electrode puller. The broken off tip needs to be a clean perpendicular break about 20μM in diameter. The tip is then heat polished to about 10μM inner diameter for the focal extracellular recording. For the stimulating electrode to drive the heart we use a final tip of about 20-50 μM in diameter. The shaft of the electrode is run over a heating element to cause it to bend about 45 degrees with a gradual bend. This produces a flat or perpendicular electrode lumen over the heart tube as the angle with the micro-manipulator will produce about another 45 degrees to the preparation.

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References

  1. Ashton, K., Wagoner, A. P., Carrillo, R., Gibson, G. Quantitative trait loci for the monoamine-related traits heart rate and headless behavior in Drosophila melanogaster. Genetics. 157, 283-294 (2001).
  2. Azpiazu, N., Frasch, M. Tinman and Bagpipe: Two homeo box genes that determine cell fates in the dorsal mesoderm of Drosophila. Genes & Development. 7, 1325-1340 (1993).
  3. Badre, N. H., Martin, M. E., Cooper, R. L. The physiological and behavioral effects of carbon dioxide on Drosophila melanogaster larvae. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 140, 363-376 (2005).
  4. Baker, J. D., McNabb, S. L., Truman, J. W. The hormonal coordination of behavior and physiology at adult ecdysis in Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 202, 3037-3048 (1999).
  5. Bier, E., Bodmer, R. Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene. 342, 1-11 (2004).
  6. Bodmer, R. The gene tinman is required for specification of the heart and visceral muscles in Drosophila. Development. 118, 719-729 (1993).
  7. Bodmer, R., Jan, L. Y., Jan, Y. N. A new homeobox-containing gene, msh-2, is transiently expressed early during mesoderm formation of Drosophila. Development. 110, 661-669 (1990).
  8. Cooper, A. S., Cooper, R. L. Monitoring activity of Drosophila larvae: Impedance & video microscopy measures. Drosophila Information Service. 87, 85-87 (2004).
  9. Dasari, S., Cooper, R. L. Direct influence of serotonin on the larval heart of Drosophila melanogaster. J. Comp. Physiol. B. 176, 349-357 (2006).
  10. Dasari, S., Viele, K., Turner, A. C., Cooper, R. L. Influence of p-CPA and MDMA on physiology, development and behavior in Drosophila melanogaster. European J. Neurosci. 26, 424-438 (2007).
  11. Dowse, H., Ringo, J., Power, J., Johnson, E., Kinney, K., White, L. A congenital heart defect in Drosophila caused by an action-potential mutation. J. Neurogenetics. 10, 153-168 (1995).
  12. Dulcis, D., Levine, R. B. Glutamatergic innervation of the heart initiates retrograde contractions in adult Drosophila melanogaster. J. Neurosci. 25, 271-280 (2005).
  13. Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J. Neurogenetics. 18, 377-402 (2004).
  14. Ganetzky, B. Genetic analysis of ion channel dysfunction in Drosophila. Kidney International. 3, 766-771 (2000).
  15. GG, G. u Pharmacological analysis of heartbeat in. Drosophila. J. Neurobiol. 28, 269-280 (1995).
  16. He, B., Adler, P. N. Cellular mechanisms in the development of the Drosophila arista. Mechanisms of Development. 104, 69-78 (2001).
  17. Johnson, E., Ringo, J., Dowse, H. Modulation of Drosophila heartbeat by neurotransmitters. J. Comp. Physiol. B. 167, 89-97 (1997).
  18. Johnson, E., Ringo, J., Bray, N., Dowse, H. Genetic and pharmacological identification of ion channels central to the Drosophila cardiac pacemaker. J. Neurogenetics. 12, 1-24 (1998).
  19. Johnson, E., Ringo, J., Dowse, H. Native and heterologous neuropeptides are cardioactive in Drosophila melanogaster. J. Insect Physiol. 1, 1229-1236 (2000).
  20. Johnson, E., Sherry, T., Ringo, J., Dowse, H. Modulation of the cardiac pacemaker of Drosophila: cellular mechanisms. J. Comp. Physiol. B, Biochem., Systemic, Environmental Physiol. 172, 227-236 (2002).
  21. Lewis, E. B. A new standard food medium. Drosophila Inform. Serv. 34, 117-117 (1960).
  22. Miller, T. A. Control of circulation in insects. General Pharmacol. 29, 23-38 (1997).
  23. Molina, M. R., Cripps, R. M. Ostia, the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells. Mechanisms of Development. 118, 51-59 (2001).
  24. Muller, K. J., Nicholls, J. G., Stent, G. S. Neurobiology of the Leech. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York. 254-254 (1981).
  25. Nichols, R., Kaminski, S., Walling, E., Zornik, E. Regulating the activity of a cardioacceleratory peptide. Peptides. 20, 1153-1158 (1999).
  26. Ocorr, K., Akasaka, T., Bodmer, R. Age-related cardiac disease model of Drosophila. Mechanisms of Ageing and Development. 128, 112-116 (2007a).
  27. Ocorr, K. A., Crawley, T., Gibson, G., Bodmer, R. Genetic variation for cardiac dysfunction in Drosophila. PLoS ONE. 2, e601-e601 (2007).
  28. Papaefthmiou, C., Theophilidis, G. An in vitro method for recording the electrical activity of the isolated heart of the adult Drosophila melanogaster. In Vitro Cellular & Developmental Biol. Animal. 37, 445-449 (2001).
  29. Peron, S., Zordan, M. A., Magnabosco, A., Reggiani, C., Megighian, A. From action potential to contraction: Neural control and excitation-contraction coupling in larval muscles of Drosophila. Comp. Biochem.Physiol. A: Molecular & Integrative Physiol. 154, 173-183 (2009).
  30. Ponzielli, R., Astier, M., Chartier, A., Gallet, A., Therond, P., Semeriva, M. Heart tube patterning in Drosophila requires integration of axial and segmental information provided by the Bithorax Complex genes and hedgehog signaling. Develop. 129, 4509-4521 (2002).
  31. Sl ma, K., Farkas, R. Heartbeat patterns during the postembryonic development of Drosophila melanogaster. J. Insect Physiol. 51, 489-503 (2005).
  32. St hmer, W., Roberts, W. S., Almers, W. Single channel recordings. Sakmann, B., Neher, E. The loose patch clamp, Plenum Press. New York. 123-132 (1983).
  33. Wessells, R. J., Bodmer, R. Screening assays for heart function mutants in Drosophila. Biotechniques. 37, 58-66 (2004).
  34. Zornik, E., Paisley, K., Nichols, R. Neural transmitters and a peptide modulate Drosophila heart rate. Peptides. 20, 45-51 (1999).
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Cooper, A. S., Rymond, K. E., Ward, M. A., Bocook, E. L., Cooper, R. L. Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies. J. Vis. Exp. (33), e1596, doi:10.3791/1596 (2009).More

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