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Biology

애벌레의 모니터링 심장​​ 기능 Drosophila melanogaster 생리 연구

doi: 10.3791/1596 Published: November 16, 2009

Summary

우리의 유충에서 심장 기능을 모니터링하는 여러 가지 방법을 제시

Abstract

우리는 애벌레에서 심장 기능을 기록하는 다양한 방법을 제시

Protocol

소개

곤충과 척추 동물 모두에게 마음의 기능의 세포 메커니즘은 놀랍게도 비슷한 Drosophila melanogaster가 인간 (비에 및 Bodmer, 2004을 포함한 다른 동물의 질병 상태에 대한 책임은 유전자 변이를 조사에 사용되고 있습니다,.. 퍼론 외, 2009). (비에 및 Bodmer, 2004,,. Ocorr 외, 2007a, B는.; 존슨 외, 1998;. Ganetzky, 2000 다우스 외, 1995)와 희망 그걸로 지금은 여러 가지 질병이 다루기 쉬운 유전 생물에 유도되는 시간 유전자 치료의 정상 기능의 회복에 대해 테스트할 수 있습니다. 또한 Drosophila는 세포 수준에서 생리 기능에 대한 좋은 모델로 제공하고 있습니다.

Drosophila 마음에 과거 연구의 대부분은 배아의 발달 측면 (Azpiazu 및 Frasch 1993, Bodmer 1993, Bodmer 외. 1990)쪽으로 타겟으로하고 있습니다. . 그 사람과 애들러, 2001,, 몰리나와 크립스, 2001; Ponzielli 외, 2002;. 슬라마과 Farkaš, 2005, 생리 기능의 몇 가지 연구는 사전 pupal, pupal 또는 성인 단계 (애쉬튼 외, 2001 년 발생 Wessells 및 Bodmer, 2004). 그러나 pupal 단계는 변형과 변화 호르몬뿐만 아니라 변동 다양한 biogenic 아민의 하나입니다. 또한 심장 myocytes의 생리 조사 때 변수 제어하기 어려운 증명할 수 구조적 변화 겪고 있습니다 (Dulcis 외를 2005;. 존슨 외를 2002;. 밀러, 1997, Papaefthimiou 및 Theophilidis, 2001). 마음은 애벌레 단계에 myogenic 것으로 알려져있다와 같은 순환 호르몬이나 펩티드 (다우스 1995으로 합성 변수를 제한하는 정의 생리적 호수에서 목욕을하면서 쉽게 제거하거나 현장에 남아있을 수 있습니다.. 존슨 외를 1997 ; Dasari와 쿠퍼, 2006; 펭 2004).. 애벌레 마음의 myogenic 성격 해수욕장 장기 효과에 대한 방향으로 유체를 펌프하는 심장의 나머지 부분을 드라이브 맥박 조정기가있다는 것을의 포유류의 심장과 비교됩니다. 그것이 포유류의 심장 기능에 대한 기본 원칙과 병리 학적 효과를 테스트하기위한 신속한 수단으로서뿐만 아니라, 수 있으므로 Drosophila 애벌레 마음의 chronotropic과 ionotropic 자연 관심있는 그러한 이온 규제로 세포 생리학 비교 모델을 개발하는 데 도움 맥박 조정기 세포.

존슨 1997, 2000;,.. 니콜스 1999; Zornik 애벌레 마음은 식량이나 동물의 내장 상태 (Dasari와 쿠퍼, 2006에 따라 hemolymph 다양 biogenic 아민과 펩티드 매우 쉽습니다 . 1999). 내생 또는 외인성 물질이 mechanistically 심장에 영향을 미치는 방법을 주소 것은 관심입니다. 우리는 곤충 생리학과 약리학의 더 나은 이해를 얻을 수있다면 다른 생물체에 적은 효과를 가능 소설 살충제가 개발할 수 있습니다.

유충의 신경 전달 물질과 심장 변조기의 동작의 세포 메커니즘은 이온 전류 및 맥박 조정기 활동을 기여하고 규제 애벌레 마음에있는 채널 유형의 충분한 이해가되지 않았기 때문에 현재까지 설명되지 않았습니다. 마찬가지로 지금까지 우리가 알고 있듯이, 애벌레 Drosophila에서 모듈 레이터의 기계론의 영향을 해결하기 위해 이온 전류를 평가하기 위해 myocytes의 세포 또는 세포 레코딩을 문서화에 대한보고는 없습니다.

이 보고서에서 우리는 애벌레 심장의 심장 박동과 생리 속성을 기록하는 다양한 방법을 제시한다.

방법

그대로 애벌레 :

  1. 그대로 두들겨 애벌레 마음을 시각화의 좋은 수단은 현미경으로 직접되지만, 유충은 여전히​​ 수축의 개수만큼 있어야합니다. 우리의 개발 방법은 자유롭게 유충뿐만 아니라 구속 애벌레 이동의 심장 박동을 모니터합니다. 사람에 따라 실험 질문이 한 접근 방법은 다른 것보다 더 적합 할 수도 있습니다.
  2. 이러한 접근은 치료가 탈수를 피하기 위해 사용되는 경우에는 시간 연장 기간 동안 개인에 따라 사용할 수 있습니다. 이러한 방법은 또한 다이어트에 소개 약리 요원을 평가하거나 mutational 라인에서 개발 또는 열 충격 유전자의 유도와 다양한 시대를 검사하는 데 사용할 수 있습니다.
  3. 첫 번째 억제 방법은 우리가 용어 "개미 농장". 이 기술은 애벌레 식품의 얇은 층으로 분리 간격 두개의 유리 접시로 구성되어 있습니다. 애벌레는 초점 중 하나 비행기 내에 시각 될 수 있습니다. 이 기술은 또한 유충의 전기 활동 circadian 운동 (쿠퍼와 쿠퍼, 2004)에 의해 모니터링하는 데 사용되었다. (1-1 근소한 간격이 기술은 두 개의 유리 접시 (;, 75 X 25mm J. 멜빈 프리드 브랜드 현미경 슬라이드)로 구성되어 있습니다.애벌레의 초점 중 하나 비행기 내에 시각 될 수 있습니다 있도록 애벌레 식품의 얇은 층 (루이스 1960의 예 촉촉한 옥수수 식사 - 수정된 버전)에 의해 간격 5mm). 일반적으로 겔 electrophoreses 플레이트에 사용되는 스페이서는 (미니 젤 바이오 래드, 생명 과학 연구, 헤라클레스, CA 94547, 미국)은 1 일, 둘째 또는 셋째 instar의 애벌레 개미 농장 절차와 함께 사용하기위한 두께를 변화와 함께 구입하실 수 있기 때문에 매우 잘 작동합니다. 또한 옵션은 주어진 두께의 단단한 플라스틱을 사용하여 크롤 링 공간으로 사용할 수있는 영역을 잘라하는 것입니다.
  4. 원하는 두께의 플라스틱이 사용되는 유리의 두 접시의 가장자리에서 밖으로 크롤 링에서 애벌레를 방지하기 위해. 20-45 도에 약간 틸팅 플랫폼은 애벌레가 남아있는 원인은, 그들의 머리와 시간의 대부분은 아래로 지적하고 꼬리는 음식 위 또는 식품 계층에 공기 통로 내에서 spiracles를 포함.
  5. 이 "개미 팜 기술"도 균일한 두께의 음식과 하나의 평면 내에 비디오 이미징 수 있습니다. 이 구성에서 애벌레가 음식을 통해 크롤 링하지 않는 경향이 있지만, 대신에 식사하고 점차적으로 2D 평면에서 주위로 이동합니다. 그것이 심장 계약을하면서 이동 심장 또는 두 기관의 최고 대비를 위해 적절하게 이동할 수 있도록 하얀 불빛이 거울로 현미경 단계의 아래쪽에서 예상됩니다. 현미경 (가변 줌 0.67-4.5, 세계 정밀 악기, 모델 501379)이 사용됩니다. 2X 기본 객관적이고 객관적인 튜브 0.5X는 0.5 cm의 사각형으로 1cm를 커버하기에 충분한 공간 해상도와 배율을 얻을하는 데 사용됩니다. trinocular 마운트를 통해 마운트된 카메라 (; 세계 정밀 악기 Mintron, MTV)이 사용됩니다. 주위 온도 20 ° C.에서 관리하고 있습니다

    그림 1
    그림 1. 손상 제 3 instar의 유충의 도설 볼 수 있습니다. 때문에 마음에서 첨부 파일의 철수에기도의 운동은 심장 박동을 관찰하는 데 사용됩니다.

  6. 자유롭게 이동 동물을 모니터 하나는 동물 머리 희석 식품 혼합 몇 방울을 배치할 수 있습니다. 전송 빛이 심장 튜브를 시각화에 대한 애벌레 통과 수 있도록이 유리 접시에 완료해야합니다. 위에서 설명한대로 설정한 동일한 현미경은 심장 박동을보고 카운트를 얻는 데 사용할 수 있습니다.
  7. 또 다른 방법은 유리 슬라이드를 더블 스틱 테이프를 사용하고 테이프 (베이커 외., 1999)에 유충의 복부 측면을 배치하여 한 위치에 유충을 억제하는 것입니다. 유충을 먹이 때 테이프가 서부 유럽 표준시 도착 경우에는이 방법이 잘 작동하지 않습니다. 방지를 위해 서부 유럽 표준시 하나를 받고 테이프는 바셀린을 (애벌레의 기본 주변 및 테이프 가장자리 주위에 작은 바늘이 밖으로 주입)를 사용할 수 있습니다. 여기는 접시에서 이동하는 동안 초점 비행기에 애벌레를 추적하거나하지 않고 시간이 지남에 따라 유충 먹이를하실 수 있습니다. 한 소원이 애벌레를 무료로하면 테이프가 moistened 그리고 그것은 동물에의 접착력을 looses 수 있습니다.

한 실험에 대한 애벌레를 자유롭게 관심이없는 경우 하나는 유리 슬라이드 gluing하여 동물을 유충을 억제의 영구적인 방법을 사용할 수 있습니다. 슈퍼 접착제 방법의 사용을 통해, 동물은 먹을 수 있으며 유리 커버 슬립을 준수 남아있는 동안에도 습한 솔루션에 적용됩니다. 절차는 다음과 같습니다

  1. 깨끗한 슬라이드를 가지고 그것을 한쪽 끝에 커버 전표를 놓습니다.
  2. 커버 슬립 중 한 모서리에 superglue의 작은를 좀 넣어 줘봐.
  3. 귀하의 Drosophila의 유충을 찾아서 테스트 튜브에서 제거합니다.
  4. 배양 접시에있는 유충을 놓고 초과 음식을 제거하는 물을 소량으로 씻어.
  5. 작은 조직이나 종이 타월의 모서리와 음식을 reaming 만끽해보세요.
  6. 부드럽게 핀셋과 유충을 선택하고 커버 슬립의 반대 끝에 슬라이드에 배치하십시오.
  7. 현미경 슬라이드를 삽입하고 조정하여 그 유충의 것으로. 유충은 다시 마주 이상과의 위에 있어야합니다. 자신의 백업이 기관 두 "경주 줄무늬"기능 때문에 유충의 양쪽을 구별하실 수 있습니다. 배가 아주 좋아 검은 머리카락과 함께 실행 희미한 가로 홈이 있습니다.
  8. 유충이 잘못된 방향의 경우, 단순히 부드럽게하여 핀셋으로 이상 틀지하여 올바른 방법을 켜십시오.
  9. 접착제용으로 특별히 사용하는 핀셋의 새로운 세트 실수로 반대 끝 모퉁이에서 배치 표지의 끝에 드롭에서 작은 소량을 함께. 당신은 접착제의 fractionally 금액을 사용해야합니다; 충분히 핀셋의 머리를 커버합니다. 또한, 그들은 접착 종료가되지 않도록하여 핀셋의 끝부분을 닦아 있는지 확인하십시오.
  10. 현미경을 두 번 유충이 올바른 위치에 아직도 있는지 확인하십시오. 그것이 뒤집어 경우, 8 단계를 참조하십시오.
  11. 이제 유충을 처리하는 데 사용되는 핀셋으로 유충을 선택하고접착제의 새로운 패치를 부드럽게 넣습니다. 검은 입 갈고리가 근처 또는 커버 슬립의 가장자리에 위치하고 또는 갈색 spiracles도는 접착제와 접촉되어 있는지 확인하십시오.
  12. 조심스럽게 그것을 버리고 유충 아래로 누르십시오.
  13. 이제 유충이 곳에있다는 것을, 당신은 그들을 시험하고자하는 물질을 관리할 수 있습니다.
  14. 당신이 물질을 세우하고 수집할 수있는 유충의 머리에 의해 작은 복용에 배치하기 위해 주사기를 사용하는 경우이 최고의 수행됩니다.
  15. 마지막으로, 심장 박동 한 분 spiracles의 펄스의 개수를 세어 볼 수 있습니다.

현장에서 : 해부 및 심장 박동수를 계산 :

준비는 중반 복부 세로 축을 따라 슬릿하고 평면 박혀. 준비 요리 한쪽을 준수 자기 테이프와 함께 유리 슬라이드 (VWR) (최고의 소매 밖하게 사지)로 구성되어. 자기 스트립의 중심에 구멍이 준비가 전송 빛을 볼 수 있습니다. 해부 핀 (좋은 과학 도구, WA)이 벤트와 종이 클립에 붙어 있습니다. 종이 클립은 쉽게 제자리에 토막 준비를 잡아 자기 테이프에서 였는데 있습니다. 녹음 요리의이 유형은 이전에 리치 복부 신경 코드 (뮬러 외., 1981)에서 분리된 신경을 달아 활용에 대한 설명되었습니다.

  1. 해부 접시에 그대로 셋째 instar의 유충를 놓습니다. 기관의 표피를 통해 더 이상 표시되지 않습니다 때까지 복부 측면에 유충을 회전합니다.
  2. 손상 유충 네 개의 핀을 삽입합니다. 두 핀은 입 갈고리의 양쪽에 가서 두 핀은 spiracles의 양쪽에 이동합니다.
  3. 생리 추가 및 수평 절개에게 머리 핀을에서 작은 거리를 확인 후, 세로축의 길이 아래로 수평 절개를 계속합니다.
  4. 진정한 마음에서 짧은 거리를 절단 중지합니다. spiracles 진정한 마음을 주위와 측면을 따라 잘라.
  5. 한 지느러미 핀을 들어 표피 밑에 그것을 연결. 뱃속을 열고 열어 확산에 핀을 사용합니다. 남은 핀이이 단계를 반복합니다.
  6. , 내장을 제거 기관이나 심장 중 하나를 손상하지 않도록주의하고. 그것은 어떤 구조가 마음에 붙어 있으며 제거한 경우 그것을 손상시킬 수 있다고 언급한다. 이들은 여러 지방 기관 및 두뇌를 포함합니다. 당신은 내장을 제거하는 동안 늘어되는 마음을 볼 수있다면, 즉시 그 구조를 제거하려고 시도 중지합니다.

마음은 이제 노출과 실험 조건에 노출 준비가 된 것입니다.

그림 2
그림 2. 직접적으로 마음을 볼 수있는 3 instar의 복부 절개. 해부 직접 손상 또는 CNS없이 마음에있는 화합물을 적용하는 데 사용 후의 뒷면에있는 동물의 달아. 작은 화살표는 심장과 대동맥이 (아래 참조) 가로 등의 선박 연구에 대한 분리 어디 나타냅니다. TR, 기관, SP, Spiracles, H, 심장, AO, 대동맥.

이 부검 기술 직접 Drosophila의 애벌레의 중심 (구와 싱, 1995)에 대한 약리 요원을 평가하는 데 사용되었습니다. 해부 시간은 3-6 분입니다. 준비는 절개 후 3-5 분 HL3 호수에서 목욕을하면서 휴식을 취할 수 있습니다.

HL3의 호수는 신중하게 인사가 높은 산도에서 느려지고 낮은 PH (Badre 외., 2005)에서 속도 때문에 산도 7.2에 갈 수있는 제어했습니다. 구 및 싱 (1995)는 마음의 약리 분석 산도 7.0을 사용하고 또한 유지 가능성을 보여주었다. 이러한 시련 동안 호수가 비커에, 21 게이지 바늘을 통해 반복적으로 주입 생리를 통해 솔루션의 교반에 의해 aerated 있었다.

HR도 직접 관찰을 사용하거나 이미지가 스크린에 VHS 테이프 또는 재생을위한 디지털 카메라에 기록될 수를 정할 수 있습니다. photodiode 방법은 이전에 (Dasari와 쿠퍼, 2006) 설명되었습니다.

열 충격에 노출 :

  1. 유충을 해부하다.
  2. 커버 플레이트에서 해부하는 준비를 놓으십시오.
  3. 히트 물 목욕.
  4. 커버 플레이트에서 온도 프로브를 부동으로 욕조의 온도 내부를 확인합니다.
  5. 온도가 만족, 장소 준비 및 욕조에서 커버 플레이트 경우.
  6. 시간 원하는 금액으로 준비를 떠나 완료되면 제거합니다.

하나는 모든 열 펄스와 온도가 자신의 실험에 필요한 무엇을 사용할 수 있습니다.

전기 속도로 마음을 드라이브 :

  1. 열린 끝에 삽입 밀봉 주사기를 사용하여 전극에 호수 (HL3)을 비행하는 실내 온도 (21 ° C)를 그림으로써 초점 전극 (직경 약 20 미크론) 입력합니다. 그 일을 확인, 조작하는 사람에 전극 마운트전자 와이어 전극 내부의 호수에 있으며 자극기은 해제되어 있습니다.
  2. 해부 현미경에 Drosophila의 유충 셋째 instar 애벌레 심장 해부 준비 장소와 장소에 안전. 준비 핀과 측면과 접촉을 피하기 위해주의 준비의 호수로 접지 와이어를 놓습니다.
  3. 필요에 따라 현미경의 초점을 조정, 마음의 맨 위에 전극의 팁을 위치로 조작하는 사람을 사용합니다. 이것을 달성하는 가장 좋은 방법은 팁 아래쪽으로 이동하는 동안 전극에 집중하는 것입니다.
  4. 팁이 위치에 있어야 인식되면 자극기 (모델 S9 그라스 악기, 퀸시, 매사 추세츠, 미국)가 0.5에서 가장 낮은 설정 1 MS와 전압, 2 Hz에서에서 주파수으로 시간을 설정할 수 있습니다. 지연 설정은 12 층과 14 층 사이의해야합니다.
  5. 심장의 리듬을 관찰하는 동안, 주파수는 약 3 Hz로 설정되어 있어야하고 본 심장의 리듬은 자극기에 의해 만들어진 리듬에 해당하는 때까지 전압이 서서히 증가했습니다. 일반적으로 해부하는 파리 심장이 때문에 자극 리듬이 본질적인 속도보다 높은 경우, 심장이 보여줄 것입니다, 약 2 Hz의 주파수에서 뛰고 심장이 정상보다 빠른 속도로 맞춰 볼 수 있습니다. 전압은 세포 손상이 준비가 쓸모 만들기, 고전압에서 발생할 수있는 약 20 V를 초과해서는 안됩니다. 일반적으로, 하나는 거리와 심장에 만들어진 인감에 따라, 2, 8 V 사이의 마음을 자극 수 있습니다.
  6. 최대 전압에 도달하고 아무런 효과가 보지 경우 극성이 반대 수 있습니다. 이 또한 작동하지 않는 경우, 프로브가 더 마음에 연결을 설정으로 이동해야합니다.
  7. 자극 중심의 리듬이 설립되면, 리듬은 빈도와 기간 설정을 변화함으로써 조작하실 수 있습니다. 그것은 4 Hz에서 위의 주파수가 tetany에 마음을 초청할 수 있지만, 알려진하여야한다. 각종 알콜과 약리 대리인이 추가될 수 있으며, 원하는 리듬이 설정되면 간격 분기점에서 자신의 효과를 볼 수 있습니다. 차단 간격 분기점은 현재를 실시하지 않고 전파 리듬이 중단됩니다.
    그림 3

    그림 4 하시기 바랍니다 여기를 클릭 이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

필드 잠재력을 측정 :

  1. 유리 전극은 Kimax 유리 (: 1.5 mm 외경)에서 만들어집니다. 유리관이 가져온 10에서 20 μm의에 이르기까지 내부 직경과 패치 조언을 생산하는 불타는 광택입니다.
  2. 전극의 루멘은 목욕 매체로 가득 차 있습니다. 컴퓨터에 라인 증폭기 및 녹음은 세포내 레코딩 아래 사용된 것과 동일합니다.
  3. '매크로 패치'기록 전극의 루멘은 (Stühmer 외., 1983)의 중심부에 영역을 통해 직접 배치됩니다. 근육 섬유의 자연 서성 거려은 초점 전극과 함께 모니터링할 수 있습니다 필드 잠재력을 생산하고 있습니다.
  4. 케어는 부드럽게 루멘을 절감하고 모니터링할 수있는 마음의 각 지역 곳곳을 높여 주어해야합니다. 잠재력은 매크로 패치 전극을 통해 기록됩니다.

심장 박동 및 모니터링 전기 이벤트를 직접 계산이 가능합니다. 이러한 잠재력을 기록하면서 입욕 매체를 변경하면 필드 잠재력에 미치는 영향 엉덩이에 가능합니다.

세포 잠재력을 측정 :

마음의 영역이 3 M KCl로 가득 날카로운 세포내 전극 (20-30 mOhm 저항)에 찔려 죽은있는 myocytes의 transmembrane의 잠재력을 모니터링합니다. 표준 헤드 무대와 세포내 레코딩을위한 증폭기를 사용할 수 있습니다, 그러나 우리는 (분자 디바이스, 서니 베일, CA, 미국) 모델 2B Axonclamp 앰프 1 X LU 머리 단계를 사용합니다. . 그것은 마음의 꼬리 끝에 더 딱딱한하고 수축이 지역의 시간 (Badre 외, 2005의 대부분을 시작부터 맥박 조정기 세포가있는 곳이라고 나타납니다, Dasari와 쿠퍼 2006; Dasari 외, 2007. ).

Acknowledgments

생물의 도서관, 켄터키 영 연구자 및 대학 교육 유레카의 G.의 리블 장학금 기금에 의해 제공! 오피스 (KY의 Univ.).

Materials

  1. Dissection tools: Fine #5 tweezers and fine scissors (all obtained from Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139)
  2. Dissecting microscope with zoom function for dissection and counting heart rate. For focal stimulation of the heart this is needed as well.
  3. For extracellular and intracellular recordings a compound microscope with upright objectives (4 x and 20X) is used.
    Standard intracellular amplifier and A/D board for on line recording to a computer. Electrical signals are recorded on line to a PowerLab/4s interface (ADInstruments, Australia). We use standard software from ADInstruments named Chart or Scope.
  4. Chemicals: All saline chemicals are obtained from Sigma chemical company (St. Louis, MO).
  5. For intracellular recordings we use glass capillary tubing (catalogue # 30-31-0 from FHC, Brunswick, ME, 04011, USA) and for focal macropatch recording and stimulating electrodes we use Kimax-51, Kimble Products Art. No. 34502, ID 0.8-1.1mm, length 100mm. The intracellular electrode should have a resistance of 20 to 30 mOhm. The macropatch electrode is constructed by breaking off the tip of the glass after a fine tip was made from an electrode puller. The broken off tip needs to be a clean perpendicular break about 20μM in diameter. The tip is then heat polished to about 10μM inner diameter for the focal extracellular recording. For the stimulating electrode to drive the heart we use a final tip of about 20-50 μM in diameter. The shaft of the electrode is run over a heating element to cause it to bend about 45 degrees with a gradual bend. This produces a flat or perpendicular electrode lumen over the heart tube as the angle with the micro-manipulator will produce about another 45 degrees to the preparation.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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애벌레의 모니터링 심장​​ 기능<em> Drosophila melanogaster</em> 생리 연구
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Cooper, A. S., Rymond, K. E., Ward, M. A., Bocook, E. L., Cooper, R. L. Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies. J. Vis. Exp. (33), e1596, doi:10.3791/1596 (2009).More

Cooper, A. S., Rymond, K. E., Ward, M. A., Bocook, E. L., Cooper, R. L. Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies. J. Vis. Exp. (33), e1596, doi:10.3791/1596 (2009).

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