Monitorización de la función del corazón en las larvas Drosophila melanogaster Para los estudios fisiológicos

Summary

Se presenta de varias maneras para controlar la función del corazón en la larva de

Abstract

Se presentan varios métodos para registrar la función cardíaca en la larva

Protocol

INTRODUCCIÓN

Los mecanismos celulares en la función del corazón, tanto para los insectos y vertebrados son sorprendentemente similares Drosophila melanogaster se están utilizando para la investigación de las mutaciones genéticas que son responsables de los estados de enfermedad en otros animales, incluyendo seres humanos (Bier y Bodmer, 2004;.. Perón y otros, 2009). Ahora diversas enfermedades están siendo inducidos en este organismo dócil genética (Dowse et al, 1995;. Johnson et al, 1998;. Ganetzky, 2000; Bier y Bodmer, 2004;. Ocorr et al, 2007a, b) y con la esperanza de que en la terapia génica tiempo se puede probar para recuperar la función normal. Además Drosophila servir como un buen modelo para las funciones fisiológicas a nivel celular.

Muchos de los estudios anteriores sobre la Drosophila del corazón se han dirigido a los aspectos de desarrollo en el embrión (Azpiazu y Frasch 1993, Bodmer 1993, Bodmer et al. 1990). Unos pocos estudios de la función fisiológica se produjo en las etapas pre-pupa, pupa o adulto (Ashton et al, 2001;. Él y Adler, 2001; Molina y Cripps, 2001; Ponzielli et al, 2002;. Sláma y Farkas, 2005; Wessells y Bodmer, 2004). Sin embargo, el estado de pupa es una de las metamorfosis y los cambios hormonales, así como fluctuaciones de las aminas biógenas distintas. También que el corazón está sufriendo una transformación estructural que puede llegar a ser difícil de controlar para las variables en la investigación de la fisiología de los miocitos (Dulcis et al 2005;. Johnson et al 2002;. Miller, 1997; Papaefthimiou y Theophilidis, 2001). El corazón es conocido por ser miogénica en la etapa larval y fácilmente se puede quitar o dejados in situ mientras se bañaba en una solución salina fisiológica definida para limitar las variables de compuestos tales como hormonas circulantes o péptidos (Dowse et al, 1995;.. Johnson et al 1997 ; Dasari y Cooper, 2006; Feng et al 2004).. La naturaleza miogénica del corazón larval es comparable con el corazón de los mamíferos en que hay marcapasos que impulsan el resto del corazón para bombear el líquido en una dirección para ser efectiva en los órganos de baño. La naturaleza cronotrópica y ionotrópicos del corazón larvas de Drosophila es de interés ya que podría servir como un medio rápido para poner a prueba los principios fundamentales y los efectos patológicos de la función del corazón de mamíferos, así como ayudar a desarrollar un modelo comparativo de la fisiología celular, como la regulación iónica de las células marcapasos.

El corazón de larvas es muy susceptible a las aminas biogénicas y péptidos que varían en la hemolinfa, según la fuente de alimentos o el estado intrínseco de los animales (Dasari y Cooper, 2006; Johnson et al, 1997, 2000,.. Nichols et al 1999; Zornik et al . 1999). Abordar cómo los compuestos endógenos o exógenos influyen en el corazón de manera mecánica es de interés. Insecticidas, posiblemente, la novela con menos efectos en otros organismos se pueden desarrollar si logramos una mejor comprensión de la fisiología de los insectos y la farmacología.

El mecanismo celular de acción de los neurotransmisores y moduladores cardíaco en larvas no se han descrito hasta la fecha, no ha habido suficiente comprensión de las corrientes iónicas y los tipos de canales presentes en el corazón de larvas que contribuyen y regular la actividad de marcapasos. Por lo que sabemos, no hay informes que documentan las grabaciones extracelular o intracelular de los miocitos para evaluar las corrientes iónicas para hacer frente a los efectos mecánicos de los moduladores de larvas de Drosophila.

En este informe se presentan varios métodos para registrar la frecuencia cardíaca y las propiedades fisiológicas del corazón larval.

MÉTODOS

Larvas intactas:

1. Un buen medio de la visualización de un corazón que late larvas intactas es directamente con un microscopio, sin embargo, la larva debe permanecer quieto lo suficiente para la cuenta de las contracciones. Nos métodos de desarrollo para controlar la frecuencia cardíaca en las larvas se mueven libremente, así como larvas de contenido. En función de los método experimental a una pregunta podría ser más adecuado que otro.
2. Estos enfoques podrían ser utilizados para seguir a un individuo durante largos períodos de tiempo si se tiene cuidado para evitar la deshidratación. Estos métodos también se pueden utilizar para evaluar fármacos introducidos en la dieta o para el examen varias veces en el desarrollo de líneas de mutación o con la inducción de genes de choque térmico.
3. El método de desenfrenado primer término la "granja de hormigas". Esta técnica consiste en dos placas de vidrio separadas por una delgada capa de alimento las larvas. Las larvas son capaces de ser visualizado en un plano de enfoque. Esta técnica fue utilizada también para controlar el movimiento la actividad eléctrica circadiano en larva (Cooper y Cooper, 2004). Esta técnica consiste en dos placas de vidrio (portaobjetos, 75 x 25 mm; Melvin J. Marca Freed) estrechamente espaciados (1 a 1.5 mm) separadas por una fina capa de larvas de alimentos (por ejemplo, harina de maíz húmedo, una versión modificada de Lewis, 1960) para que las larvas son capaces de ser visualizado en un plano de enfoque. Separadores de uso común para electroforesis en gel de placas (mini gel Bio-Rad, Life Science Research, Hercules, CA 94547, EE.UU.), funcionan muy bien, ya que se pueden comprar con espesor variable para su uso con primera, segunda o tercera estadio las larvas de los procedimientos de granja de hormigas. Otra opción es utilizar un plástico sólido de un cierto espesor y cortar la región que se utilizará como espacio de gatear.
4. Para evitar que las larvas de arrastrarse fuera de los bordes de las dos placas de vidrio se utiliza un plástico del grosor deseado. Ligeramente la inclinación de la plataforma de 20 a 45 grados, ocasiona que las larvas se quedan, la mayoría de las veces, con la cabeza apuntando hacia abajo y la cola que contiene los espiráculos por encima de la comida o en un paso de aire en la capa de los alimentos.
5. Esta "técnica de Ant Farm", también permite imágenes de vídeo en un solo plano con la comida de espesor uniforme. En esta configuración, las larvas tienden a no arrastrarse a lo largo de la comida, pero en su lugar para comer y pasar gradualmente en todo en el plano 2D. La luz blanca se proyecta desde la parte inferior de la platina del microscopio con un espejo para que pueda ser trasladado en consecuencia para el mejor contraste del corazón o de la tráquea dos que se mueven al mismo tiempo el corazón se contrae. Un microscopio (zoom ajustable 0,67 a 4,5; Instrumento World Precision, modelo 501 379) se utiliza. Uno de los objetivos base de 2X y 0.5X objetivo tubo se utiliza para obtener la suficiente resolución espacial y la ampliación para cubrir un rectángulo de 1 cm por 0,5 cm. Una cámara montada a través de un montaje trinocular se utiliza (Mintron, MTV, instrumentos de precisión Mundial). La temperatura ambiente se mantiene a 20 ° C.

   
   Figura 1. Vista dorsal de una larva intacta 3 ^º estadio. El movimiento de la tráquea debido a la tracción de los anexos del corazón se utiliza para observar el ritmo cardíaco.

6. Para controlar los animales se mueven libremente se puede colocar unas gotas de una mezcla diluida de los alimentos en la cabeza los animales. Esto debe hacerse en un recipiente de vidrio para que la luz transmitida puede pasar a través de las larvas para la visualización del conducto del corazón. La microscopía mismo conjunto como se describe anteriormente se puede utilizar para ver los latidos del corazón y obtener cargos.
7. Otro método consiste en restringir la larva de una ubicación mediante el uso de cinta adhesiva de doble sobre un portaobjetos de vidrio y colocación de la parte ventral de la larva en la cinta (Baker et al., 1999). Sin embargo este enfoque no funciona bien si la cinta se moja cuando se alimentan las larvas. Para evitar que la cinta de conseguir un mojado puede utilizar vaselina (inyección de una pequeña aguja en la base de las larvas y alrededor del borde de la cinta). Aquí se puede alimentar a la larva en el tiempo sin tener que perseguir a las larvas en el plano de enfoque, o mientras se está moviendo en un plato. Si se desea liberar a las larvas de la cinta puede ser humedecido y se pierde su adhesividad a los animales.

Si uno no está interesado en la liberación de las larvas para la experimentación se puede utilizar el método permanente de alejamiento de la larva por pegar al animal a un portaobjetos de vidrio. Con el uso del método de pegamento, el animal puede comer e incluso se tratarán en una solución húmeda mientras permanece adherida a la hoja de la cubierta de vidrio. Los procedimientos son los siguientes:

1. Tome un portaobjetos limpio y colocar una hoja de cubierta en un extremo de la misma.
2. Ponga una porción de pegamento en una esquina de la hoja de la cubierta.
3. Busque su larva de Drosophila y retírela del tubo de ensayo.
4. Lugar a la larva de una placa de Petri y enjuagar con una pequeña cantidad de agua para eliminar cualquier exceso de comida.
5. Sumérjase en el fresado de alimentos con la punta de un pañuelo de papel pequeña o una toalla de papel.
6. Suavemente recoger larvas con pinzas y colocarlo en la diapositiva en el extremo opuesto de la hoja de la cubierta.
7. Coloque el portaobjetos bajo el microscopio y ajustar su presta en la larva. La larva debe estar en su estómago con su espalda hacia arriba frente. Se puede distinguir entre los dos lados de la larva por la espalda con dos "franjas de carreras", que son la tráquea. El estómago tiene tenues surcos horizontales a lo largo de ella con el pelo negro muy fino.
8. Si la larva está orientado en la dirección incorrecta, simplemente a su vez de la manera correcta de él con cuidado volcó con sus pinzas.
9. Con un nuevo conjunto de pinzas utilizan específicamente para el pegamento tomar una cantidad muy pequeña de la caída al final de su hoja de cubierta y colóquelo en la esquina del extremo opuesto. Usted debe utilizar una cantidad fraccionada de la cola, sólo lo suficiente para cubrir la cabeza de las pinzas. También, asegúrese de limpiar los extremos de sus pinzas para que no se pega cerrada.
10. Bajo el microscopio, revise para asegurarse de que la larva se encuentra todavía en la posición correcta. Si se ha entregado, consulte el paso ocho.
11. Ahora, con las pinzas utilizadas para manejar larva, recoger las larvas ycolocarlo suavemente en el parche nuevo de la cola. Asegúrese de que los ganchos de la boca negro se encuentran cerca o en el borde de la hoja de la cubierta y ni ellos ni los espiráculos marrón en contacto con el pegamento.
12. Con cuidado, presione sobre la larva a aplanarse.
13. Ahora que la larva está en su lugar, puede administrar las sustancias que se desea para ponerlos a prueba.
14. Esto se logra mejor si se utiliza una jeringa para extraer la sustancia y lo coloca en pequeñas dosis por la cabeza de la larva para que se ingieren.
15. Por último, la frecuencia cardíaca puede ser observada por contar el número de pulsos de los espiráculos en un minuto.

In situ: la disección y el recuento de la frecuencia cardíaca:

Los preparativos se cortan a lo largo del eje longitudinal medio-ventral y cubrió plana. El plato preparación consistió en un portaobjetos de vidrio (VWR) con la cinta magnética (Mejor Compra al por menor que fuera) se adhirió a un lado. Un agujero en el centro de la banda magnética permite la preparación para ser visto con luz transmitida. Alfileres de disección (Fine Herramientas Científicas, WA) se doblan y se pegan a los clips de papel. Los clips son de fácil maniobra en la cinta magnética para mantener la preparación de filetes en su lugar. Este tipo de plato de grabación se ha descrito anteriormente para la utilización de clavos ganglios aislados del cordón nervioso ventral sanguijuela (Muller et al., 1981).

1. Lugar intacto tercera larva instar en la placa de disección. Gire larva en su lado ventral hasta la tráquea ya no son visibles a través de la cutícula.
2. Coloque los cuatro pernos en la larva intacta. Dos pines ir a ambos lados de los ganchos de la boca, y dos pasadores de ir a cada lado de los espiráculos.
3. Añadir solución salina, y hacer una incisión horizontal a poca distancia de los pines de la cabeza, y luego continuar con una incisión horizontal a lo largo del eje longitudinal.
4. Dejar de cortar a una corta distancia desde el corazón verdadero. Corte alrededor del verdadero corazón y al lado de los espiráculos.
5. Levantar un pin dorsal y el gancho que por debajo de la cutícula. Usar el pasador para abrir la cavidad del cuerpo y la propagación de abrirlo. Repita esto con los pines restantes.
6. Quitar las tripas, teniendo cuidado de no dañar ni la tráquea o el corazón. Cabe señalar que algunas estructuras se unen al corazón y puede dañar si se retira. Estos incluyen varios cuerpos grasos, y el cerebro. Si usted puede ver el corazón se estira mientras se quita las tripas, deje de tratar de eliminar esa estructura.

El corazón está expuesto y listo para la exposición a las condiciones experimentales.

Figura 2. Disección ventral de un estadio 3 ^º para ver directamente el corazón. La fijación de los animales en la espalda después de la disección se utiliza para aplicar directamente los compuestos en el corazón, con o sin el sistema nervioso central intacto. Pequeña flecha indica el lugar donde el corazón y la aorta se separan para seccionado estudios vaso dorsal (ver más abajo). Tr, tráquea; Sp, espiráculos, H, corazón, AO, Aorta.

Esta técnica de disección se ha utilizado para evaluar directamente los agentes farmacológicos en el corazón de las larvas de Drosophila (Gu y Singh, 1995). El tiempo de la disección es de 3-6 min. La preparación se le permite relajarse mientras se bañaba en HL3 solución salina durante 3-5 minutos después de la disección.

La solución salina HL3 fue controlada cuidadosamente para estar a un pH de 7,2 ya HR disminuye a pH alto y se acelera a pH más bajo (Badre et al., 2005). Gu y Singh (1995) utilizó un pH de 7,0 para el análisis farmacológico del corazón y también demostró la viabilidad de mantener. Durante estos ensayos se mantuvo la solución salina aireada por la agitación de la solución salina a través de la inyección repetitiva, a través de una aguja de calibre 21, en un vaso.

Para cuantificar de recursos humanos o la observación directa se puede utilizar o las imágenes pueden ser grabadas en cintas de VHS o una cámara digital para su reproducción en una pantalla. Un método fotodiodo ha sido previamente descrito (Dasari y Cooper, 2006).

La exposición al choque térmico:

1. Diseccionar larva.
2. Colocar la preparación sobre la placa de la cubierta disecados.
3. Calor baño de agua.
4. Compruebe la temperatura interior del baño de flotación por una sonda de temperatura en una placa de la cubierta.
5. Cuando la temperatura es satisfactoria, el lugar de preparación y la cubierta en el baño.
6. Agregar la preparación en una cantidad de tiempo deseada y eliminar cuando haya terminado.

Se puede utilizar lo que cada pulso de calor y la temperatura necesaria para su experimentación.

Eléctricamente conducir el corazón a ritmo de:

1. Llenar un electrodo central (aproximadamente 20 micras de diámetro) con una jeringa insertada y sellada en el extremo abierto y el dibujo de la temperatura ambiente (21 ° C) vuelan solución salina (HL3) en el electrodo. Monte el electrodo en el manipulador, la comprobación de que thcable e está en la solución salina dentro del electrodo y el estimulador se apaga.
2. Colocar la preparación de una larva de Drosophila tercera estadio larval corazón disecado en el microscopio de disección y seguro en su lugar. Coloque el cable de tierra en la salina de la preparación, cuidado para evitar el contacto con los pasadores y los lados de la preparación.
3. Use el manipulador a la posición de la punta del electrodo en la parte superior del corazón, el ajuste del foco del microscopio, según sea necesario. La mejor manera de lograrlo es centrarse en el electrodo mientras se mueve la punta hacia abajo.
4. Cuando la punta se percibe en la posición, el estimulador (modelo S9 Grass Instruments, Quincy, Massachusetts, EE.UU.) se debe activar con la frecuencia de 2 Hz, la duración de 0,5 a 1 ms y la tensión en la posición más baja. El ajuste de retardo debe estar entre 12 y 14.
5. Mientras observa el ritmo del corazón, la frecuencia debe ser convertido a unos 3 Hz y la tensión aumenta lentamente hasta que el ritmo del corazón visto corresponde con el ritmo producido por el estimulador. Normalmente, el corazón late a volar diseccionado con una frecuencia de alrededor de 2 Hz, así que cuando el ritmo estimulado es más alta que la tasa intrínseca, el corazón se ve, el corazón se puede ver a latir a un ritmo más rápido de lo normal. Tensión no debe pasar de unos 20 V, como el daño celular puede ocurrir a altas tensiones, lo que la preparación inútil. Por lo general, se puede estimular el corazón entre 2 y 8 V, dependiendo de la distancia y el sello creado en el corazón.
6. Si la tensión máxima que se alcanza y no efecto observado es decir, la polaridad puede ser invertida. Si esto tampoco funciona, la sonda debe ser movido para establecer una mejor conexión en el corazón.
7. Una vez que el ritmo de la estimulación impulsado se ha establecido, el ritmo puede ser manipulado mediante la variación de la frecuencia y la duración de la configuración. Debe darse a conocer, sin embargo, que las frecuencias por encima de 4 Hz se puede poner el corazón en la tetania. Diversos alcoholes y agentes farmacológicos se pueden añadir y su efecto sobre uniones pueden ser observados una vez que el ritmo deseado se establece. Bloqueados uniones no llevan a cabo una corriente y el ritmo propagado cesará.
   
   
   Por favor, haga clic aquí para ver una versión mayor de esta cifra.

Medir los potenciales de campo:

1. Los electrodos de vidrio están hechos de Kimax de vidrio (diámetro exterior: 1,5 mm). El tubo de vidrio se tira y pulido al fuego para producir puntas de parche con un diámetro interior de 10 a 20 micras.
2. La luz del electrodo se llena con el medio baño. El amplificador y el registro en línea a una computadora es la misma que se utiliza a continuación para los registros intracelulares.
3. La luz del electrodo de la grabación de un 'macro-parche "(Stühmer et al., 1983) se coloca directamente sobre una región del corazón. El ritmo espontáneo de las fibras musculares producen un potencial de campo que se puede controlar con el electrodo central.
4. La atención debe ser dada por bajar suavemente la luz y el aumento de la vuelta de cada región del corazón para ser monitoreados. Los potenciales se registran a través de un electrodo de macro-parche.

El recuento directo de la frecuencia cardíaca y la vigilancia de los eventos eléctricos es posible. La alteración de los medios de comunicación de baño durante la grabación de estos potenciales también es posible evaluar los efectos potenciales sobre la materia.

Medir el potencial intracelular:

Para controlar los potenciales transmembrana de los miocitos es atravesado una región del corazón con un electrodo afilado intracelular (20 a 30 la resistencia mOhm) lleno de 3 M KCl. Una etapa de la cabeza estándar y un amplificador para el registro intracelular puede ser utilizado, sin embargo se utilizó un modelo Axonclamp 2B (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.) y amplificador de 1 X etapa de la cabeza LU. Parece que el extremo caudal del corazón es más rígido y es aquí donde residen las células marcapasos ya que la contracción se inicia en esta región la mayoría de las veces (Badre et al, 2005;. Dasari y Cooper 2006; Dasari et al, 2007. ).

Materials

Dissection tools: Fine #5 tweezers and fine scissors (all obtained from Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139) Dissecting microscope with zoom function for dissection and counting heart rate. For focal stimulation of the heart this is needed as well. For extracellular and intracellular recordings a compound microscope with upright objectives (4 x and 20X) is used. Standard intracellular amplifier and A/D board for on line recording to a computer. Electrical signals are recorded on line to a PowerLab/4s interface (ADInstruments, Australia). We use standard software from ADInstruments named Chart or Scope. Chemicals: All saline chemicals are obtained from Sigma chemical company (St. Louis, MO). For intracellular recordings we use glass capillary tubing (catalogue # 30-31-0 from FHC, Brunswick, ME, 04011, USA) and for focal macropatch recording and stimulating electrodes we use Kimax-51, Kimble Products Art. No. 34502, ID 0.8-1.1mm, length 100mm. The intracellular electrode should have a resistance of 20 to 30 mOhm. The macropatch electrode is constructed by breaking off the tip of the glass after a fine tip was made from an electrode puller. The broken off tip needs to be a clean perpendicular break about 20μM in diameter. The tip is then heat polished to about 10μM inner diameter for the focal extracellular recording. For the stimulating electrode to drive the heart we use a final tip of about 20-50 μM in diameter. The shaft of the electrode is run over a heating element to cause it to bend about 45 degrees with a gradual bend. This produces a flat or perpendicular electrode lumen over the heart tube as the angle with the micro-manipulator will produce about another 45 degrees to the preparation.