Larvaların olarak izlenmesi Kalp Fonksiyonu Drosophila melanogaster Fizyolojik Çalışmaları

Summary

Larva kalp fonksiyonları izlemek için çeşitli yollar mevcut

Abstract

Biz larva kardiyak fonksiyonu kaydetmek için çeşitli yöntemler mevcut

Protocol

GİRİŞ

Hem böcekler ve omurgalılar için kalp fonksiyon hücresel mekanizmaları inanılmaz benzer Drosophila melanogaster insanlar (Bier ve Bodmer, 2004 de dahil olmak üzere diğer hayvanlarda hastalık durumları için sorumlu olan gen mutasyonlarının araştırılması için kullanılmaktadır. Peron ve ark, 2009). (Bier ve Bodmer, 2004;;. Ocorr ve ark, 2007a, b; Johnson ve ark, 1998; Ganetzky, 2000 Dowse ve ark, 1995) ve umuyoruz ki, Şimdi çeşitli hastalıklar bu uysal Genetik organizmada meydana ediliyor Zaman gen tedavisi normal işlev geri kazanmak için test edilebilir. Drosophila Buna ek olarak bir hücresel düzeyde fizyolojik fonksiyonu için iyi bir model olarak hizmet vermektedir.

Drosophila kalp geçmiş çalışmaların çoğu, embriyonun gelişim yönlerini (Azpiazu ve Frasch 1993, Bodmer 1993, Bodmer ve ark 1990) hedef olmuştur . O ve Adler, 2001; Molina ve Cripps, 2001; Ponzielli ve ark, 2002; Sláma ve Farkas, 2005; fizyolojik fonksiyonu Birkaç çalışmalar ön-pupa, pupa veya yetişkin evrelerinde (Ashton ve ark, 2001 yılında meydana gelen Wessells ve Bodmer, 2004). Ancak pupa aşamada metamorfoz ve değişen hormonlar gibi dalgalanan çeşitli biyojen aminler biridir. Ayrıca kalp miyosit fizyolojisini araştıran değişkenler için kontrol etmek zor olduğu ispat yapısal dönüşüm geçirmekte (Dulcis ve ark 2005; Johnson ve ark 2002; Miller, 1997; Papaefthimiou ve Theophilidis, 2001). Larva aşamasında miyojenik olarak bilinen kalp gibi dolaşan hormonlar veya peptidlerin (Dowse ve arkadaşları 1995 gibi değişkenlerin bileşik sınırlamak için belirli bir fizyolojik tuzlu su ile yıkanıyor kolayca temizlenebilir veya in situ sol olabilir.. Johnson ve ark, 1997 Dasari ve Cooper, 2006; Feng ve ark 2004). Larva kalp miyojenik doğa banyo organlarda etkili olabilmesi için bir yön sıvı pompalamak için kalbin geri kalan sürücü Kalp pili olduğunu memeli kalp karşılaştırılabilir. Memeli kalp fonksiyonu için temel ilkeleri ve patolojik etkileri test etmek için hızlı bir aracı olarak hizmet yanı sıra bu yana Drosophila larva kalp kronotropik ve inotropik doğa ilgi gibi iyonik düzenleme gibi hücresel fizyoloji için karşılaştırmalı bir model geliştirmek için yardım kalp pili hücreleri.

Johnson ve ark 1997, 2000;. Nichols ve ark 1999; Zornik ve ark larva kalp bağlı olarak besin kaynağı ya da bir hayvanın içsel durumu (Dasari ve Cooper, 2006 hemolimf değişir biyojenik aminler ve peptidler karşı son derece hassastır . 1999). Endojen veya eksojen bileşiklerin mekanistik kalbi nasıl etkilediğini Adresleme ilgi. Muhtemelen roman diğer canlılar üzerindeki etkileri daha az olan böcek, böcek fizyoloji ve farmakoloji bir anlayışa geliştirilebilir.

Larva nörotransmitterlerin ve kalp modülatörleri eylem hücresel mekanizma iyonik akımlar ve larva kalp pacemaker aktivitesi düzenleyen ve katkıda bulunan kanal türleri yeterli anlayışı olmamıştır olarak bugüne kadar tanımlanmamıştır. Bildiğim kadarıyla biz farkında olarak, larva Drosophila modülatörlerin mekanik etkileri adresi iyonik akımlar değerlendirmek için miyositler ekstrasellüler ya da hücre içi kayıtları belgeleyen herhangi bir rapor vardır.

Bu yazıda larva kalp kalp hızı ve fizyolojik özellikleri kaydetmek için çeşitli yöntemler sunuyoruz.

YÖNTEM

Bozulmamış larva:

1. Sağlam bir dayak larva kalp görselleştirme iyi bir araç doğrudan mikroskop ile Bununla birlikte, larva hala kasılmaları saymak için yeterli kalmalıdır. Biz geliştirme yöntemleri larvaları gibi ölçülü larvalar, serbestçe hareket eden kalp hızı monitörü. Bağlı olanlar üzerinde deneysel soru bir yaklaşımı, diğerlerinden daha uygun olabilir.
2. Bu yaklaşımlar, bakım dehidratasyonu önlemek için kullanıldığı takdirde uzun bir süre içinde tek bir takip için kullanılabilir. Bu yöntemler aynı zamanda diyet tanıtıldı farmakolojik ajanların değerlendirmek veya mutasyon hatlarında geliştirme veya ısı şok genlerin indüksiyon ile çeşitli zamanlarda incelemek için kullanılabilir.
3. Ilk dizginlenmemiş yöntemi terim, "Ant çiftlik". Bu teknik larvaları gıda ince bir tabaka tarafından arayla iki cam levha oluşur. Larvaları odak düzlemi içinde görüntülenmiştir. Bu teknik aynı zamanda larva elektriksel aktivite sirkadiyen hareketi (Cooper ve Cooper, 2004) izlemek için kullanılmıştır. (1 ile 1 dar aralıklı Bu teknik, iki cam plaka (75 x 25 mm J. Melvin Freed Marka mikroskop lamı) oluşur.Larvaların bir düzlem içinde odak görüntülenebilmekte mümkün olduğu kadar larvaları gıda ince bir tabaka (Lewis, 1960 örneğin nemli mısır yemek değiştirilmiş bir sürümü) dışında 5 mm). Jel electrophoreses plakalar için yaygın olarak kullanılan Rondela (mini jel Bio-Rad, Yaşam Bilimleri Araştırma, Hercules, CA 94.547, ABD), 1., 2. veya 3. instar larvaları karınca çiftliği prosedürleri kullanmak için kalınlığı değişen satın alınabilir bu yana çok iyi çalışmaz. Ayrıca bir seçenek, belirli bir kalınlıkta sağlam bir plastik kullanımı ve tarama alanı olarak kullanmak için bölgeyi kesip.
4. Istenilen kalınlıkta bir plastik kullanılan iki tabak, cam kenarlarından dışarı sürünerek larvaları önlemek için. 20 ila 45 derece hafifçe eğerek platform larvaları kalmasına neden olur, zamanın büyük bir çoğunluğu, kendi kafa ile aşağı çekti ve kuyruk, gıda yukarıda veya gıda tabakası hava geçişini içinde spiracles içeren.
5. Bu "Ant Farm Tekniği", aynı zamanda gıda ile aynı kalınlıkta bir tek düzlem içinde video görüntüleme sağlar. Bu yapılandırmada larvaları gıda boyunca tarama değil eğilimindedir, ancak bunun yerine yemek ve kademeli olarak 2 boyutlu düzlemde dolaşmak. Beyaz ışık, kalp sözleşmeleri ise hareket kalp ya da iki trakea en iyi kontrast buna göre hareket ettirilebilir ve böylece bir ayna ile mikroskop aşamasında alt tahmin edilmektedir. A mikroskobu (ayarlanabilir zoom 0,67-4,5; Dünya Hassas Çalgı; Model 501.379) kullanılır. 2X temel amacı ve tüp hedefi 0.5x 0.5 cm dikdörtgen bir 1cm karşılamak için yeterli uzaysal çözünürlük ve büyütme elde etmek için kullanılır. Trinoküler montaj yoluyla monte edilmiş bir kamera (Dünya Precision Instrument Mintron, MTV) kullanılır. Ortam sıcaklığı 20 ° C'de muhafaza

   
   Şekil 1, sağlam ^bir 3. instar larva Dorsal görünümü . Kalpten gelen ekleri çekerek nedeniyle trakea hareketi kalp atış hızını gözlemlemek için kullanılır.

6. Serbestçe hareket hayvan izlemek için bir seyreltilmiş gıda karışımı hayvanların başının üzerine birkaç damla yerleştirebilirsiniz. Bu iletilen ışık kalp tüp görselleştirmek için larva geçmesine böylece bir cam tabak içinde yapılmalıdır. Kalp atışı izlemek ve sayıları elde etmek için, yukarıda açıklandığı gibi ayarlayabilirsiniz aynı mikroskopi kullanılabilir.
7. Diğer bir yaklaşım, çift kaset sopa kullanarak bir bardak slayt ve teyp (Baker ve ark, 1999) larva ventral tarafında yerleştirerek bir konuma larva dizginlemek için . Larvaları besleme bant ıslanırsa Ancak bu yaklaşım iyi çalışmaz. Önlemek için ıslak bir elde bant Vazelin (larva tabanı etrafında ve bant kenarı etrafında küçük bir iğne dışarı enjekte) kullanabilirsiniz. Burada bir zaman içinde bir çanak üzerinde hareket ederken, odak düzlemi içine larva kovalamak veya kalmadan larva besleyebilir. Bir dilek larvaların serbest Eğer bant nemlendirilmiş ve hayvan bu yapışkanlık kaybeder olabilir.

Bir deney için larva kurtararak ilgilenen değilse bir cam slayt yapıştırma hayvan larva frenleyici kalıcı bir yöntem kullanabilirsiniz. Süper yapıştırıcı yönteminin kullanımı ile, hayvanın yemek ve cam kapak slip yapıştırılır kalırken, nemli bir çözüm bile karşılanabilir. Bu prosedürler şunlardır:

1. Temiz bir slayt atın ve bunun bir ucunda bir kapak kayma bir yer.
2. Superglue, kapak kayma bir köşesinde küçük bir dab koyun.
3. Drosophila larva bulun ve test tüpü çıkarın.
4. Petri kabı içerisinde larva yerleştirin ve herhangi bir aşırı gıda kaldırmak için küçük bir miktar su ile durulayın.
5. Köşesinde küçük bir doku ya da kağıt havlu ile gıda raybalama içinize çekin.
6. Cımbız ile hafifçe larva pick up ve kapak kayma zıt ucunda slayt üzerine yerleştirin.
7. Slayt mikroskop altında yerleştirin ve ayarlamak larva katıyor. Larva arkasına bakacak şekilde yukarı karnına alınmalıdır. Sırtlarını trakea iki "Racing Stripes" özelliği nedeniyle larva iki tarafı ayırt edebilirsiniz. Mide çok ince siyah kıllar ile birlikte çalışan soluk yatay oluk vardır.
8. Larva yanlış bir şekilde karşı karşıya ise, sadece cımbızla yavaşça ters çevirerek doğru yol açmak.
9. Cımbız bir dizi yeni özellikle yapıştırıcı için kullanılan kayma ve diğer ucunu köşesine yerleştirin açılan kapağı sonunda küçük bir dab ile. Tutkal Kesirli miktarda kullanmanız gerekir; cımbız baş örtüsü için yeterli. Ayrıca, yapıştırılmış kapattı olmazlar böylece cımbız ucu silin emin olun.
10. Mikroskop altında, çift larva hala doğru konumda olduğundan emin olmak için kontrol edin. Devretti, sekiz adıma bakın.
11. Şimdi, larva işlemek için kullanılan cımbız, larva, pick up vetutkal taze yama hafifçe yerleştirin. Siyah ağız kanca yakın veya kapak kayma kenarında bulunan ve kendilerinin ya da kahverengi spiracles ne yapıştırıcı ile temas halinde gelir emin olun.
12. Düzleştirmek için larva dikkatlice bastırın.
13. Şimdi larva yerinde olduğunu, onları test etmek istediğiniz maddeler yönetebilirsiniz.
14. Madde hazırlamak ve yemek için küçük dozlarda larva başkanı tarafından bir şırınga kullanıyorsanız, bu en iyi şekilde gerçekleştirilir.
15. Sonuç olarak, kalp hızı, bir dakika içinde spiracles bakliyat sayısını sayma görülebilir.

In situ: Diseksiyon ve kalp hızı sayma:

Preparatlar orta-ventral uzunlamasına ekseni boyunca yarık ve düz tutturulmuş. Hazırlık çanak bir tarafa yapıştırılır manyetik bant ile cam slayt (VWR) (En İyi perakende dışında izin Buys) oluşuyordu. Manyetik şerit merkezinde bir delik hazırlık iletilen ışık görülebilmesini sağlar. Diseksiyon pimleri (Güzel Bilimsel Araçlar, WA) eğildi ve ataç yapıştırılmış. Ataç kolayca fileto hazırlık yerinde tutmak için manyetik teyp manevra. Bu tür kayıt çanak sülük ventral sinir kablosu (Muller ve ark, 1981) izole ganglionlar bağlantılarını kullanımı için daha önce tarif edilmiştir .

1. Diseksiyonu plaka sağlam 3. instar larva yerleştirin. Trakea manikür ile artık görünür olana kadar, ventral tarafta larva döndürün.
2. Sağlam larva dört iğne yerleştirin. Ağız kanca iki tarafında iki pin ve iki pin spiracles iki tarafına gitmek.
3. Tuzlu su ekleyin ve yatay bir kesi başkanı pimleri küçük bir mesafe, daha sonra yatay bir kesi ile uzunlamasına eksen uzunluğu aşağı devam etmektedir.
4. Gerçek kalp kısa bir mesafe kesme durdurma. Spiracles gerçek kalbin etrafında ve kenarı boyunca kesin.
5. Bir sırt pin kaldırın ve manikür altında kanca. Pin, vücut boşluğuna açık ve açık yaymak için kullanın. Kalan iğneler ile bu işlemi tekrarlayın.
6. Trakea veya kalp ya zarar vermemek için dikkatli olmak cesaret çıkarın. Bazı yapıların kalbe bağlı olan ve kaldırılır eğer zarar verebilir dikkat edilmelidir. Bunlar, birkaç yağ organları ve beyin içerir. Cesaret çıkarırken gergin olan kalp görebiliyorsanız, bu yapıyı kaldırmak için çalışırken hemen durdurun.

Kalp şimdi açık ve deneysel koşullara maruz kalma için hazırdır.

Şekil 2 kalp doğrudan ^3. instar Ventral diseksiyonu. Diseksiyonu bozulmamış ya da merkezi sinir sistemi olmadan doğrudan kalp bileşikler uygulamak için kullanıldıktan sonra sırtında hayvan İğneleme. Küçük ok, kalp ve aorta (aşağıya bakın) transeksiyon dorsal damar çalışmaları için ayrılmış nerede gösterir. Tr, Trakea; Sp, Spiracles, H, Kalp, AO, Aort.

Bu diseksiyon tekniği farmakolojik ajanların doğrudan kalbi Drosophila larvaları (Gu ve Singh, 1995) değerlendirmek için kullanılır olmuştur. Diseksiyonu süre 3-6 dk. Hazırlık diseksiyonu sonra 3-5 dakika HL3 tuzlu su ile yıkanan süre dinlenmek için izin verilir.

HL3 serum fizyolojik pH 7,2 İK yüksek pH yavaşlatır ve düşük pH (Badre ve ark, 2005) hızlandırır dikkatle kontrol edildi. Gu ve Singh (1995), pH 7.0 kalp farmakolojik analizi için kullanılan ve aynı zamanda muhafaza canlılığı gösterdi. Bu çalışmalar sırasında serum fizyolojik bir behere 21-gauge bir iğne ile, arka arkaya tuzlu su enjekte yoluyla çözüm sallanarak gazlı kaldı.

İK ölçmek ya doğrudan gözlemler kullanılabilir veya bir ekran VHS kasetleri veya oynatma için bir dijital kamera görüntüleri kaydedilmiş olabilir. Bir fotodiyot yöntemi (Dasari ve Cooper, 2006) tarif edilmiştir.

Maruz kalınan ısı şoku:

1. Larva teşrih.
2. Kapağındaki disseke hazırlık yerleştirin.
3. Isı su banyosu.
4. Bir kapak plakası üzerinde bir sıcaklık probu yüzen banyo sıcaklığı iç kontrol edin.
5. Sıcaklığı tatmin edici bir yer hazırlama ve banyo kapak plakası.
6. Bırakın ve bir zaman istenilen miktarda hazırlık bittiğinde kaldırmak.

Bir her ısı nabız ve sıcaklık, deneyler için gerekli ne kullanabilirsiniz.

Elektrikle hızda kalp sürücü:

1. Açık ucuna eklenmiş ve mühürlü bir şırınga kullanarak ve elektrot içine salin (HL3) sinek oda sıcaklığında (21 ° C) çizim bir odak elektrot (çapı yaklaşık 20 mikron) doldurun. O inci, kontrol, manipülatör Mount elektrote tel elektrodun içinde tuzlu su ve stimülatör kapalıdır.
2. Diseksiyon mikroskobu, bir Drosophila larva 3. instar larva kalp disseke hazırlık koyun ve bir yere sabitleyin . Topraklama kablosu hazırlanması pimleri ve yanlar ile temasını engellemek için dikkatli hazırlanması tuzlu su içine koyun.
3. Mikroskop odak gerektiği şekilde ayarlayarak, kalp üstüne elektrodun ucunun manipülatör kullanın. Bunu başarmak için en iyi yolu, elektrot ucu aşağı doğru hareket ettirerek odaklanmak.
4. Ucu pozisyon olarak algılanan, stimülatörü (S9 modeli Çim Aletleri, Quincy, Massachusetts, ABD), 1 ms ve voltaj düşük ayarda 0.5, 2 Hz frekansta süresi açık olmalıdır. Gecikme ayarı 12 ve 14 arasında olmalıdır.
5. Kalp ritim gözlemleyerek, frekans yaklaşık 3 Hz açık olmalı ve görülen kalp ritmi stimülatör tarafından üretilen ritmine karşılık kadar gerilim yavaş yavaş artmıştır. Disseke sinek kalp Normalde uyarılmış ritim içsel hızından daha yüksek olduğunda, kalp görüleceği, yaklaşık 2 Hz frekansta atıyor, kalbin normalden daha hızlı bir oranda yenmek için görülecektir. Voltaj hazırlık gereksiz hale hücre hasarı, yüksek gerilim oluşabilir olarak yaklaşık 20 V geçmemek gerekir. Genellikle, bir mesafe ve kalp üzerinde yarattığı mühür bağlı olarak, 2 ve 8 V arasında kalp uyarabilir.
6. Maksimum gerilim ulaştı ve hiçbir etkisi görülürse, polarite ters olabilir. Bu da işe yaramazsa, prob, kalp üzerinde daha iyi bir bağlantı kurmak için hareket ettirilmelidir.
7. Stimülasyon odaklı bir ritim kurulduktan sonra, ritim, sıklığı ve süresi ayarlarını değiştirerek manipüle edilebilir. 4 Hz üstünde frekansları tetani kalp koyabilirsiniz, ancak bilinen yapılmış olmalıdır. Çeşitli alkoller ve farmakolojik ajanlar eklenebilir ve istenilen ritmi sağlandıktan sonra gap junction üzerindeki etkisi görülebilir. Engellenen gap junction bir akım yapmayın ve yayılır ritim sona erecek.
   
   
   Lütfen , bu rakamın büyük bir halini görmek için buraya tıklayın .

Alan potansiyelleri ölçün:

1. Cam elektrotlar Kimax cam (dış çap: 1.5 mm) yapılır. Cam tüp çekilir ve 10 ila 20 mm arasında değişen iç çaplarda yama ipuçları üretmek için yangın cilalı.
2. Elektrot lümen banyo orta ile doludur. Amplifikatör ve kayıt bir bilgisayar satır aşağıda intrasellüler kayıtları için kullanılan aynı.
3. Bir 'makro-yama' kayıt elektrot lümen (Stühmer ve ark, 1983), kalbin bir bölge üzerinde yer almaktadır . Kas liflerinin spontan pacing odak elektrot ile izlenebilir bir alan potansiyel üretir.
4. Bakım hafifçe lümen düşürücü ve kontrol edilmesi gereken kalp her bölge üzerinde yükselterek tarafından verilmesi gerekir. Potansiyelleri bir makro-yama elektrot ile kaydedilir.

Doğrudan sayma, kalp hızı ve elektriksel olayların izlenmesi mümkündür. Bu potansiyelleri kayıt sırasında banyo medya değiştirme alanındaki potansiyeller üzerine etkileri eşek uygulanabilir.

Intrasellüler potansiyelleri ölçün:

3 M KCl ile dolu keskin intrasellüler elektrot (20 ila 30 mOhm direnç) ile kalp bir bölge kazığa miyositler transmembran potansiyelleri izlemek için. Standart bir kafa sahne ve amplifikatör hücre içi kayıt için kullanılabilir; ancak biz (Moleküler Aygıtlar, Sunnyvale, CA, USA) bir model 2B Axonclamp amplifikatör ve 1 X LU baş sahne. Kalp kuyruk ucuna daha katıdır ve bu daralma bu bölgede zaman çoğunluğu (Badre ve ark, 2005 başlatır yılından beri kalp pili hücreleri ikamet ettiği anlaşılmaktadır; Dasari ve Cooper 2006; Dasari ve arkadaşları, 2007. .)

Materials

Dissection tools: Fine #5 tweezers and fine scissors (all obtained from Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139) Dissecting microscope with zoom function for dissection and counting heart rate. For focal stimulation of the heart this is needed as well. For extracellular and intracellular recordings a compound microscope with upright objectives (4 x and 20X) is used. Standard intracellular amplifier and A/D board for on line recording to a computer. Electrical signals are recorded on line to a PowerLab/4s interface (ADInstruments, Australia). We use standard software from ADInstruments named Chart or Scope. Chemicals: All saline chemicals are obtained from Sigma chemical company (St. Louis, MO). For intracellular recordings we use glass capillary tubing (catalogue # 30-31-0 from FHC, Brunswick, ME, 04011, USA) and for focal macropatch recording and stimulating electrodes we use Kimax-51, Kimble Products Art. No. 34502, ID 0.8-1.1mm, length 100mm. The intracellular electrode should have a resistance of 20 to 30 mOhm. The macropatch electrode is constructed by breaking off the tip of the glass after a fine tip was made from an electrode puller. The broken off tip needs to be a clean perpendicular break about 20μM in diameter. The tip is then heat polished to about 10μM inner diameter for the focal extracellular recording. For the stimulating electrode to drive the heart we use a final tip of about 20-50 μM in diameter. The shaft of the electrode is run over a heating element to cause it to bend about 45 degrees with a gradual bend. This produces a flat or perpendicular electrode lumen over the heart tube as the angle with the micro-manipulator will produce about another 45 degrees to the preparation.