Summary
В этом видео-работе предлагается метод выделения и очистки
Abstract
Protocol
Общие замечания по Магнитные бисера Сортировка дрозофилы нейроны периферийных (Всего Сроки завершения протокола: 2,5-3 часа)
Стандартные процедуры лабораторию для поддержания чистой, свободной РНКазы среды должны соблюдаться во все времена для предотвращения деградации РНК.
Когда кутикулы дрозофилы личиночной изрезана и помещен в буфер клеточной диссоциации, периферические нейроны являются одним из последних клетки отделяются от кутикулы. Мы использовали это свойство и предназначен этот протокол для удаления большей части неспецифические клетки кутикулы, таких как мышцы и жир до изоляции да нейронов.
С практикой, протоколом в целом может быть успешно завершен в течение примерно 2,5 часов. Подготовка покрытые антителом бисером должно быть завершено до эксперимент начинается.
1. Подготовка Магнитные гранулы для связывания клеток:
Этот шаг должен быть завершен до начала эксперимента. Подготовлены бусины могут быть подготовлены и хранить при температуре 4 ° С до необходимости.
- Вымойте 100 мкл Dynabeads М-280 стрептавидин покрытых бисером три раза PBS путем суспендирования ее в 500 мкл PBS свежие и гранулирования его в сильное магнитное поле каждый раз.
- Наконец ресуспендирования бисером непосредственно в 100 мкл неразбавленного биотинилированного крысы антимышиным-CD8a антител (антитела концентрации 100 мкг / мл).
- Выдержите смесь в течение 1 часа на льду с редкими мягкий вортексе для предотвращения оседания. [1 мкл Dynabeads М-280 может связывать 0,05-0,10 мкг биотинилированного антитела].
- Вымойте бусинка-антитело смесь три раза, как описано в шаге от 1,1 до удаления избытка антител. Магнитных гранул в настоящее время покрыты антителами и готов к использованию. Магазин бусинка-антитело смеси в 100 мкл 1X PBS при 4 ° С до использования.
2. Выбор и стиральные Личинки: (10-15 минут)
- Выберите 30-50 соответствующей возрастной третьего возраста личинок и поместить их в 1.6ml трубки микроцентрифужную с 1-1,2 мл 1X фосфатно-солевым буфером (PBS). (3-5 минуты)
- Закрыть трубки и вихревые его на максимальное значение в три раза в течение 1 секунды каждое.
- Использование огневой полировкой пипетки Пастера отказаться супернатант полностью. Повторите мыть (2,1) и вихревые (2,2) шаги 3-4 раза, пока супернатант заметно от любых частиц пищи и мусора.
- Кратко повторим промыть 1 мл 70% этанола и отбросить супернатант.
- Вымойте личинки в два раза с 1 мл ddH2O и отбросить супернатант.
- Кратко повторим еще раз мыть с 1 мл РНКазы-AWAY и отбросить супернатант.
- Вымойте личинки три раза в 1 мл ddH2O для обеспечения полного удаления РНКазы-AWAY.
3. Препарирование: (10-12 минут)
- Место 10-12 личинок на центр Sylgard покрытием пластины 35мм Петри. Позиция их немного подальше друг от друга. [Важнейший шаг: Не использовать личинки, которые, кажется, не будет на соответствующем этапе развития]
- Разрежьте передний конец личинки с помощью пары тонких ножниц рассечение для всех личинок.
- Используя пару скучно Дюмон № 5 щипцы инвертировать личинки наизнанку. Вставьте один forcep внутри личиночной кутикулы все пути к заднему концу. Pinch кончики пинцета вместе, чтобы захватить заднем конце кутикулы (рис. 1а) (попробуйте нажать кутикулу вниз на поверхность Sylgard, чтобы сделать его легче). Использование второй паре щипцов, нажмите личиночной кутикулы наизнанку. [Важнейший шаг: Попробуйте практикующих этот метод несколько раз, прежде чем пытаться экспериментировать изолятор. Постарайтесь, чтобы личинки полностью перевернутой, чтобы гарантировать, что все мягкие ткани подвергаются решение для легкой диссоциации.]
- После вскрытия 3-4 личинок, передавать их сразу же на свежий, ледяной PBS (место пробирку на льду) в 1,6 трубки микроцентрифужную мл.
- Повторите шаги с 3,1 до 3,4, пока все необходимые личинки собираются (30-40 личинок в этом протоколе). [Важнейший шаг:. Предвидеть 10-20% потерь во время вскрытия и диссоциации, и соответствующим образом планировать]
4. Удаление свободно присоединенными неспецифических клеток: (2-3 минуты)
[Этот шаг способствует очистке свободно присоединенными неспецифических тканях, таких как жир тела и нервной системы.]
- Возьмите 1,6 мл микроцентрифужную трубку с перевернутой личиночной кутикулы и заменить супернатант с примерно 700-800 мкл свежей ледяной PBS.
- Импульсно-вихревой трубки микроцентрифужную 5 раз (3 секунды за импульс) на полной скорости.
- Удалите супернатант и заменить его примерно 700-800 мкл свежей, ледяной PBS.
- Повторите шаги 4,2 и 4,3 в три раза.
- Resuspend личиночной кутикулы в 400 мкл свежей, ледяным PBS
5. Диссоциирующего ткани в суспензии отдельных клеток: (18-20 минут)
[Важнейший шаг: Более диссоциации может привести к потере клеточной поверхности маркера приводит к плохой урожай клеток и низкой жизнеспособности клеток. Личиночные ткани могут быть отделены либо механической диссоциации (ультразвуком, douncing), ферментативной диссоциации (трипсин, коллагеназа и др.) или их комбинации. Поскольку эти личиночных тканей трудно отделить, мы обнаружили, что сочетание механической и ферментативной диссоциации дало лучшие результаты.]
- Добавить 1,5 мкл 1X Liberase Blendzyme 3 (28 Вт nsch ЕД / флакон) в личиночной кутикулы приостановлена в 400 мкл PBS.
- Vortex раствора 2-3 раза в течение 1 секунды каждый на максимальное значение (Это должно устранить свободно присоединенными клетки кутикулы в раствор).
- Выдержите растворе при комнатной температуре (22-25 ° С) в течение 5 минут. [Важнейший шаг: Время инкубации очень сильно влияет на окончательный эффективность сортировки клеток. Рекомендуется время инкубации должно быть достаточно для разрыхления тканей. Не более 15 минут.]
- Импульсно-вихревой трубки в 20-30 раз при максимальных настройках в течение 2 секунд в импульсе на полной скорости. Это должно релизы мышцы и другие ткани в раствор. Осмотрите небольшую выборку из раствора под флуоресцентным микроскопом стерео на каждом шагу. (С опытом один должен быть в состоянии определить уровень диссоциации, наблюдая микроцентрифужную трубки непосредственно под флуоресцентным включен стерео-микроскопа)
- Вымойте личиночной кутикулы 2-3 раза свежей ледяной PBS и, наконец, их ресуспендируют в 500 мкл свежей, ледяным PBS, содержащим 1% BSA.
- Чтобы избежать личиночной кутикулы прилипания к поверхности стекла от 2 мл Kontes мясорубку ткани и большой пестик просвет, предварительно слой ткани мясорубку и пестик с 1% BSA в растворе PBS, и после короткого промыть отменить решение BSA. Впоследствии, с помощью огневой полировкой пипетки Пастера перенести кутикулы с шагом от 5,5 до BSA покрытием ткани мясорубки. [Важнейший шаг: Предварительное охлаждение мясорубки ткани / пестиком, поместив его на льду в течение нескольких минут, чтобы предотвратить повреждение клеток / лизис].
- Dounce ткани медленный и стабильный удары, избегая вспенивания (примерно 20-30 ударов). [Важнейший шаг:. Dounce медленно и постепенно, в противном случае клетки могут лизировать]
- Для оценки клеточном уровнях диссоциации, протрите наружную стенку ткани шлифовальная машина с чистой ткани Kimwipe, и осмотреть его под флуоресцентным микроскопом стерео. Нейроны должны отделяться от кутикулы, и его можно увидеть в растворе. Если это окажется трудным, в качестве альтернативы пипетки из небольшого образца решения, и наблюдать его под флуоресцентным микроскопом стерео. Хорошим признаком клеточной диссоциации отсутствие нейроны от личиночной кутикулы. Однако, если человек по-прежнему наблюдает нейронов придается кутикулы, или замечены полностью диссоциированных клеток, Dounce дальше, пока клетки достижения суспензии отдельных клеток.
- Растирают раствор 5 раз с огневой полировкой пипетки Пастера сократился до примерно 50% от стандартного диаметра наконечника, а затем 10 раз с огневой полировкой пипетки Пастера сократился до примерно 25% от стандартного диаметра наконечника. [Важнейший шаг: Силовое растиранием может привести к повреждению клеток. Монитор клетки между ступенями, а также настроить порядок, соответственно,].
- Фильтр решение через ячейки фильтра 30 мкм и собирать ячейки фильтрата в 1,6 трубки микроцентрифужную мл. Полученный раствор должен состоять из суспензии отдельных клеток, и теперь готова для магнитной сортировки клеток.
6. Магнитные бисера Сортировка Cell: (45 - 75 минут, в зависимости от времени инкубации антитела)
- Добавить 15 мкл антител покрытием магнитных гранул до 500 мкл клеточной суспензии (шаг 5,10). Остальные антитела сопряженных магнитных гранул может храниться до необходимого для последующего выделения клеток.
- Инкубируйте клеток с антителами покрытием магнитных гранул в течение 30-60 минут на льду с редкими ручного смешивания. [Важнейший шаг: Инкубация при более высокой температуре или более длительного времени может привести к неспецифические антитела.]
- Место микроцентрифужную трубки в сильное магнитное поле в течение 2 минут. Все положительно выделенных ячеек вместе с несвязанными бисером будут отделяться в сторону трубы.
- Медленно пипетку надосадочной, убедившись, что не нарушать клеточный осадок.
- Вымойте клетки 3-4 раза в свежем, ледяной PBS для удаления оставшихся неспецифических клеток.
- Ресуспендируют клеток в 30 мкл свежей, ледяным PBS.
- Для приближения чистоту и выход клеток, пипеткой 5 мкл ячейки SUSPension на полированной поверхности гемоцитометра и посчитать все видимые флуоресцентные клетки под флуоресцентным микроскопом стерео. Также проверьте объем не флуоресцентных клеток и каких-либо признаков примесей. Обычно образец будет высоко обогащенного для люминесцентных клеток.
7. РНК Изоляция от магнитных бисера Сортировать Клетки: (60 - 75 минут)
- После подсчета, пеллет клетки в магнитное поле, отбросить супернатант и добавить 20 мкл буфера для экстракции из PicoPure ™ РНК Изоляция Kit (Molecular Devices). В зависимости от ячейки номер один, возможно, придется добавить больший объем буфера для экстракции.
- Вихревые трубки на максимальной скорости, чтобы смешивание осадок клеток с выделением буфера.
- Выдержите трубки при 42 ° С в течение 30 минут.
- Чтобы обеспечить удаление магнитных гранул до колонки очистки РНК (см. шаг 7.5), трубка на короткое время центрифугировали при 2000 (х) г в течение 2 минут для осаждения магнитных бус. Трубка помещается в сильное магнитное поле, чтобы сохранить гранул, а супернатант переносили в новую пробирку и отцентрифугировать.
- Извлечение и столбцов очистить РНК в соответствии с инструкциями извлечения PicoPure РНК комплект производителя. ДНКазы лечение не является обязательным, и может быть выполнена на колонку во время очистки РНК в соответствии с анализом требований. Наконец, элюировать связаны общей РНК в небольшом объеме (11-30 мкл) буфера элюирования и хранить при температуре -80 ° С до готовности к использованию. При желании 1 мкл могут быть использованы для оценки общего качества РНК на Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc.)
Представитель Результаты:
Магнитный шарик сортировки был использован, чтобы изолировать дрозофилы да нейронов (рис. 1). РНК очищали от этих изолированных нейронов да (рис. 2а) оказался отличного качества, как указано наличие резких 5.8S, 18S и 28S рибосомных РНК пики, когда анализируются на Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc) ( рис. 2б). Начиная с 30-40 личинок третьего возраста, мы были способны к изоляции в среднем 300-500 Класс-IV нейроны да использовании ППК-GAL4 водитель, и 1500-2000 да нейронов (класс I, II, III и IV), используя пан- да нейрон конкретных GAL4 21-7 водителя. Для оценки нейронов конкретных обогащению наших изолированных клеток мы выполнили количественные обратной транскрипции ПЦР (QRT-PCR) с использованием двух нейронов генов-маркеров (elav и futsch). Эти исследования выявили значительные кратное обогащение как маркерные гены, указывающие на весьма специфический обогащения для нейронов да по сравнению с потоком путем использования нашего протокола (рис. 3). Наконец, изолированной РНК с обеих пан-да нейронов и класс-IV да нейронов используется для выполнения транскрипционных профилей выражение Agilent дрозофилы целого генома микрочипов олиго (4 х 44K) (рис. 4). Эти исследования выявили многочисленные ранее замешанных регуляторов да морфогенеза дендритов нейронов в дополнение к широкому спектру ранее неохарактеризованных молекулами и предполагаемые пути передачи сигналов, которые потенциально играют важную функциональную роль в развитии да нейрона. Исследования, направленные на оценку потенциальной роли (ы) этих ранее неохарактеризованных молекул в посредничестве да нейрона развития, и, в частности дендритов морфогенеза, в настоящее время в стадии реализации.
Рисунок 1. Схема магнитной бусины сортировки дрозофилы нейронов да () Возраст соответствует третьему возраста личинки подшипника да нейрон конкретных GAL4, UAS-mCD8-GFP репортер трансгенов расчленены инвертирующего личиночной кутикулы наизнанку, разоблачать ПНС к диссоциации буфера и хранится в ледяной PBS. (б) Ферментативный диссоциации осуществляется путем добавления Liberase Blendzyme 3 к раствору, содержащему личиночной кутикулы. (с) личиночных тканей далее диссоциировали сочетание вортексе, растиранием и douncing для удаления неспецифически помечены тканей, таких как жир органов, кишечника и ЦНС. (г, д) клетки затем фильтруется с помощью ячейки 30 мкм фильтр. Решение содержит суспензии отдельных клеток различных типов клеток, включая эпителий, мышечная и нейронов. (Е) Анти-мышь CD8a-антитело покрытием Dynabeads М-280 добавляются к клеточной суспензии, и инкубировали на льду в течение 30-60 минут. ( г) магнитных шариков связывается да нейронов, которые выражают мыши CD8 меткой GFP белок слияния. (H, I) магнитные бусины покрыты клетки отделяются друг от друга размещения решения в сильное магнитное поле. Супернатант отбрасывают, а клетки промывают три раза, чтобы удалить остатки неспецифические клетки, в результате чего (к) чighly очищенной популяций нейронов да. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 1.
Рисунок 2: (а) представитель образ положительно выбран, GFP флуоресцентные класс-IV нейроны да изолированы клеточной диссоциации и магнитные бусины сортировки. В результате население нейронов была определена как высоко обогащенного для класса-IV нейроны да практически без загрязняющих примесей клетки. (Б) Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc) electropherogram от общего числа РНК, выделенной из магнитной бусины отсортированы нейронов да , показав отличные общее качество РНК на что указывает наличие 5.8S, 18S, 28S рРНК и. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 2.
Рисунок 3: QRT-PCR анализа нейронных экспрессии генов маркеров в изолированных да нейронов (GAL421-7, УАС-mCD8-GFP) и поток через часть была выполнена в трех экземплярах. Уровня экспрессии двух нейронов конкретных генов-маркеров (elav и futsch) были оценены QRT-PCR. Значения, полученные от этих анализов были нормированы на эндогенного контроля (rp49), а также уровней относительно тем, которые наблюдаются в потоке через дробь были рассчитаны с использованием метода ΔΔCτ 6. Оба elav и futsch были существенно обогатилась за изолированной популяции да нейрона по сравнению с потоком через дробь.
Рисунок 4: представитель класса-IV-да-нейрон-специфический Cy3 помечены микрочипов файла изображения. На рисунке вы видите Agilent дрозофилы целого генома олиго микрочипов (4 х 44K) гибридизации с Cy-3-labeld общую РНК, выделенной из класса IV нейроны да очищают магнитные бусины сортировки. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, представленные здесь, оптимизированная для выделения и очистки периферических нейронов, которые придерживаются сильно, чтобы внутренняя поверхность дрозофилы третьего возраста личиночной кутикулы с помощью магнитного бусинка стратегии сортировки клеток. Хотя мы использовали этот протокол специально выделить дрозофил да нейронов, применение этого протокола в отрыве от других типов клеток, которые придерживаются кутикулы в личиночной или куколки стадиях развития (например, эпителия, мышц, других периферийных нейронов) может быть адаптирован различной несколько параметров и использования различных GAL4, UAS-mCD8-GFP репортер трансгенов какой лейбл типа клеток или видов, представляющих интерес. Более того, этот протокол может быть использован как в связи с потерей функции и получить-функции подходы, где интерес гена может быть клонирован в UAS-mCD8-GFP трансгенов, которые могут быть связаны с GAL4 трансгенов направить либо ген- удельные потери-функции (например, UAS-RNAi) или получить-функции для типа клеток, представляющих интерес. Например, в случае фактора транскрипции можно желать для выявления потенциально вверх или вниз-регулируемых генов на потерей функции или получить-функции выражение в типе клеток, представляющих интерес. Выделяя общей РНК из очищенных типа клеток интереса по этому протоколу и использования этой РНК выполнять микрочипов профилирования выражения можно определить дифференциально регулируемых генов, которые могут представлять вниз по течению целей регуляции транскрипции, которые играют роль посредника в фенотипические изменения в клетке .
Для успешной сортировки ячейки необходимо уделить пристальное внимание критически важных шагов было подчеркнуто выше в протоколе. Примерами общих проблемных областей, что может потребовать некоторого дальнейшего поиска неисправностей и оптимизации, в зависимости от типа клеток, включают (1) низкая доходность клеток и (2) клетка слипания во время магнитных бусинка изоляции. В первом случае, можно попытаться снижения концентрации Liberase Blendzyme 3, и компенсировать за счет увеличения механической диссоциации через douncing. Во втором случае, можно попытаться снижения напряженности магнитного поля путем применения одного или нескольких слоев скотча лаборатории над магнитом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы благодарим доктора. Yuh-Нунг Ян и Уэс Grueber за предоставление летать запасы, используемые в данном исследовании. Авторы признают, Томас Ф. и Кейт Миллер Джеффресс Мемориального Фонда за поддержку этого исследования (РСК) и Управления Университета Джорджа Мейсона благочинного (EPRI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | MP Biomedicals | PBS10X02 | Diluted to 1X working solution |
| 10X Liberase Blendzyme 3 | Roche Group | 11814176001 | Diluted to 1X working solution (28 Wünsch units/vial) |
| RNase-AWAY | Sigma-Aldrich | 83931 | |
| Biotinylated Rat anti-Mouse-CD8a antibody | Invitrogen | MCD0815 | 100 μg/ml stock concentration |
| BSA (Bovine Serum Albumin), Fraction V | GIBCO, by Life Technologies | 11018-017 | Prepare a 1% BSA solution in PBS |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 11205D | 1 μl can bind 0.05-0.10 μg of biotinylated antibody |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Molecular Devices | KIT0204 | Follow manufacturer’s instructions |
Equipment
|
|||
References
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim,, Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods. Methods. 25, 402-408 (2001).
