Isolatie en zuivering van Drosophila Perifere neuronen door Magnetic Bead sorteren

Summary

In deze video-artikel stellen we een methode voor de isolatie en zuivering van

Abstract

De

Protocol

Algemeen Reacties op Magnetic Bead sorteren van Drosophila perifere neuronen (Totaal Timing voor de voltooiing van het protocol: 2,5-3 uur)

Standaard lab procedures voor het handhaven van een schone, RNAse vrije omgeving moeten worden nageleefd te allen tijde RNA degradatie te voorkomen.

Wanneer de Drosophila larven cuticula is ontleed en geplaatst in de cel dissociatie buffer, de perifere neuronen zijn een van de laatste cellen los te maken van de cuticula. We hebben benut deze eigenschap en ontworpen dit protocol voor de meeste van de niet-specifieke cellen van de cuticula, zoals spier-en vetweefsel voorafgaand aan het isoleren van de da neuronen te verwijderen.

Met de praktijk, kan de hele protocol met succes worden voltooid binnen ongeveer 2,5 uur. De voorbereiding van antilichamen gecoate kralen moet zijn afgerond voordat het experiment begint.

1. Voorbereiden magnetische korrels voor Binding Cells:

Deze stap moet voor de aanvang van het experiment worden afgerond. De voorbereide kralen kunnen worden bereid en bewaard bij 4 ° C totdat het nodig is.

1. Was de 100 ul Dynabeads M-280 Streptavidine gecoate kralen drie keer in PBS door resuspenderen in 500 pi van verse PBS en pellets in een sterk magnetisch veld per keer.
2. Eindelijk direct resuspendeer de kralen in 100 pi van onverdund gebiotinyleerd rat anti-muis-CD8a antilichaam (antilichaamconcentratie is 100 ug / ml).
3. Incubeer dit mengsel gedurende 1 uur op ijs met af en toe een lichte vortexen naar sedimentatie te voorkomen. [1 ui van Dynabeads M-280 kunnen binden 0,05-0,10 ug van gebiotinyleerd antilichaam].
4. Was de kraal-antilichaam mengsel drie keer, zoals beschreven in stap 1.1 om het overtollige antilichaam te verwijderen. De magnetische kralen zijn nu bedekt met antilichamen en klaar om gebruikt te worden. Bewaar de kraal-antilichaam mengsel in 100 ul PBS 1X bij 4 ° C tot gebruik.

2. Selecteren en Wassen Larven: (10-15 minuten)

1. Kies 30-50 jaar geëvenaard derde instar larven en leg ze in een 1.6ml microfugebuis met 1 tot 1,2 ml 1X fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). (3-5 minuten)
2. Sluit de buis en vortex deze op de maximale instelling drie keer voor een seconde elk.
3. Met behulp van een brand-gepolijste Pasteur pipet volledig ontdoen van het supernatant. Herhaal de wasbeurt (2.1) en vortex (2.2) stappen 3-4 keer tot de bovenste is zichtbaar vrij is van alle etensresten en vuil.
4. Kort herhalen van de wassen met 1 ml 70% ethanol en gooi de supernatant.
5. Twee keer was de larven met 1 ml ddH2O Verwijder de bovenstaande vloeistof.
6. Kort herhalen de was nog eens met 1 ml van RNase-AWAY en gooi het supernatant.
7. Was de larven drie keer in 1 ml van ddH2O om volledige verwijdering van RNase-AWAY te verzekeren.

3. Dissectie: (10-12 minuten)

1. Plaats 10 tot 12 larven in het midden van een Sylgard gecoate 35mm Petri plaat. Plaats ze iets weg van elkaar. [Kritische stap: Gooi alle larven die niet lijken te zijn op het juiste ontwikkelingsstadium]
2. Opengesneden het voorste puntje van de larven met behulp van een paar van fijne dissectie schaar voor alle larven.
3. Met behulp van een paar saaie Dumont nr. 5 tang draai de larven inside-out. Plaats een pincet in de larvale cuticula helemaal naar het achterste einde. Samen Knijp de uiteinden van de tang aan het achterste einde van de cuticula (figuur 1a) (probeer het indrukken van de cuticula neer op de Sylgard oppervlak gemakkelijker te maken) te grijpen. Met behulp van het tweede paar pincetten, duw de larvale nagelriem binnen en van buiten. [Kritische stap: Probeer het beoefenen van deze methode een paar keer voordat de cel isolatie experiment. Probeer de larven helemaal omgedraaid te krijgen, om ervoor te zorgen dat alle zachte weefsels worden blootgesteld aan de oplossing voor eenvoudige dissociatie.]
4. Na het ontleden 3-4 larven, direct overbrengen naar verse, ijskoud PBS (plaats de buis op het ijs) in een 1,6 ml microfugebuis.
5. Herhaal de stappen 3,1 tot 3,4 totdat alle benodigde larven worden verzameld (30-40 larven in dit protocol). [Critical Stap:. Anticipeer op 10-20% verlies tijdens dissectie en dissociatie, en plan dienovereenkomstig]

4. Verwijdering van losjes hechtende niet-specifieke cellen: (2-3 minuten)

[Deze stap helpt bij het opruimen van los hechtende niet-specifieke weefsels zoals vet lichamen en CNS.]

1. Neem de 1,6 ml microfugebuisje met het omgekeerde larvale nagelriemen en vervang het supernatant met ongeveer 700 tot 800 ul van verse ijskoude PBS.
2. Pulse-vortex de microfugebuis 5 keer (3 seconden per puls) op volle snelheid.
3. Verwijder het supernatant en vervang deze met ongeveer 700 tot 800 ul vers, ijskoud PBS.
4. Herhaal de stappen 4.2 en 4.3 drie keer.
5. Resuspend het larvale nagelriemen in 400 ul vers, ijskoud PBS

5. Dissociatie het weefsel in een enkele celsuspensie: (18-20 minuten)

[Kritische stap: Over-dissociatie kan het verlies van de cel-oppervlak marker wat leidt tot een slechte cel-rendement en een lage levensvatbaarheid van de cellen veroorzaken. De larvale weefsel kan los gezien worden door een mechanische dissociatie (sonicatie, douncing), enzymatische dissociatie (trypsine, collagenase enz.) of een combinatie van beide. Aangezien deze larven weefsels zijn moeilijk te scheiden, vonden we dat een combinatie van zowel mechanische en enzymatische dissociatie de beste resultaten opgeleverd.]

1. Voeg 1,5 pi van 1X Liberase Blendzyme 3 (28 W nsch eenheden / flacon) tot het larvale cuticula gesuspendeerd in 400 pi PBS.
2. Vortex de oplossing 2-3 keer gedurende 1 seconde per bij maximale instelling (Dit zou het losjes adherente cellen van de opperhuid te verwijderen in de oplossing).
3. Incubeer de oplossing bij kamertemperatuur (22-25 ° C) gedurende 5 minuten. [Kritische stap: Incubatie tijd grote invloed op de uiteindelijke celsortering efficiency. De aanbevolen incubatietijd zou voldoende moeten zijn voor het losmaken van het weefsel. Niet meer dan 15 minuten.]
4. Pulse-vortex de buis 20-30 keer op maximale instellingen voor 2 seconden per puls op volle snelheid. Dit moet releases van de spieren en andere weefsels in de oplossing. Inspecteer een kleine greep uit de oplossing onder een tl-stereo-microscoop bij elke stap. (Met een ervaring moeten kunnen om het niveau van dissociatie te bepalen door het observeren van de microfugebuis direct onder een fluorescentie-enabled stereo-microscoop)
5. Was het larvale nagelriemen 2-3 keer met verse, ijskoud PBS en uiteindelijk hen resuspendeer in 500 ul vers, ijskoud PBS dat 1% BSA.
6. Om te voorkomen dat het larvale cuticula vasthouden aan het glazen oppervlak van de 2 ml Kontes weefsel molen en de grote ruimte stamper, pre-coat het weefsel molen en een stamper met een 1% BSA in PBS-oplossing en na een korte spoeling gooi de BSA-oplossing. Vervolgens wordt met behulp van een brand-gepolijste Pasteur pipet de nagelriemen van stap 5.5 op de BSA-gecoate weefsels molen. [Kritische stap: Pre-cool het weefsel molen / stamper door het op ijs voor een paar minuten tot celbeschadiging / lysis te voorkomen].
7. Dounce het weefsel met een langzame en gestage slagen, het vermijden van schuimvorming (ongeveer 20-30 slagen). [Critical Stap:. Dounce langzaam en gelijkmatig, anders kunnen de cellen lyseren]
8. Voor de beoordeling van de cel dissociatie niveaus, veeg de buitenmuur van het weefsel molen met een schone tissue Kimwipe, en inspecteer deze onder een tl-stereo-microscoop. De neuronen moeten los van de nagelriem, en kan gezien worden in de oplossing. Als dit blijkt te zijn moeilijk, als alternatief pipet uit een kleine steekproef van de oplossing, en observeer het onder een tl-stereo-microscoop. Een goede indicatie van de cel dissociatie is de afwezigheid van de neuronen van de larvale cuticula. Echter, als men nog steeds op neuronen aan de nagelriem, of merkt onvolledig gescheiden cellen, verder dounce totdat de cellen komen tot een enkele celsuspensie.
9. Vermaal de oplossing vijf keer met een brand-gepolijste Pasteur pipet gedaald tot ongeveer 50% van de standaard tip diameter, gevolgd door 10 keer met een brand-gepolijste Pasteur pipet gedaald tot ongeveer 25% van de standaard tip diameter. [Kritische stap: Krachtig fijnwrijving kan schade aan de cellen. Monitor de cellen tussen de stappen, en dienovereenkomstig aan te passen van de procedure].
10. Filtreer de oplossing door een 30 um cel filter en verzamel de cel filtraat op in een 1,6 ml microfugebuis. De resulterende oplossing moet bestaan ​​uit een enkele cel schorsing en is nu klaar voor magnetische celsortering.

6. Magnetische Bead Cell Sorting: (45 - 75 minuten, afhankelijk van de antilichamen incubatietijd)

1. Voeg 15 ul van het antilichaam gecoate magnetische kralen om 500 pi van de celsuspensie (stap 5,10). De resterende antilichaam geconjugeerd magnetische korrels kunnen worden opgeslagen totdat ze nodig voor latere cel isolaties.
2. Incubeer de cellen met antilichaam gecoate magnetische korrels gedurende 30-60 minuten op ijs met af en toe hand-mixen. [Kritische stap: Incubatie bij een hogere temperatuur of langere tijd kan leiden tot niet-specifieke antilichaam binding.]
3. Plaats de microfugebuis in een sterk magnetisch veld gedurende 2 minuten. Alle positief geselecteerde cellen, samen met niet-gebonden kralen zal scheiden aan de zijkant van de buis.
4. Langzaam pipet het supernatant, zorg ervoor niet naar de cel pellet te verstoren.
5. Was de cellen 3-4 keer in verse, ijskoude PBS om alle resterende niet-specifieke cellen te verwijderen.
6. Resuspendeer de cellen in 30 ul van verse, ijskoude PBS.
7. Om onderlinge aanpassing van de zuiverheid en de opbrengst van de cellen, pipet 5 ul van de cel suspension op het gepolijste oppervlak van een hemocytometer en tel alle zichtbare fluorescerende cellen onder een tl-stereo-microscoop. Controleer ook de hoeveelheid niet-fluorescerende cellen en geen tekenen van onzuiverheden. Typisch het monster zal zeer worden verrijkt voor de fluorescerende cellen.

7. RNA isolatie van Magnetic Bead Gesorteerd Cells: (60 - 75 minuten)

1. Na het tellen, pellet de cellen in een magnetisch veld, gooi het supernatant en voeg 20 ul van de extractie buffer van de PicoPure ™ RNA Isolation Kit (Molecular Devices). Afhankelijk van het aantal cellen een kan nodig zijn om een ​​hoger volume van de extractie buffer toe te voegen.
2. Vortex de buis met maximale snelheid aan het mengen van celpellet met extractiebuffer mogelijk te maken.
3. Incubeer de buis bij 42 ° C gedurende 30 minuten.
4. Om ervoor te zorgen verwijdering van de magnetische beads voorafgaand aan de kolom zuivering van het RNA (zie stap 7.5), is de buis kort gecentrifugeerd bij 2.000 (x) g gedurende 2 minuten om pellet het magnetische korrels. De buis wordt dan geplaatst in een sterk magnetisch veld om de pellet te behouden, en het supernatant is overgebracht naar een nieuwe microfugebuis.
5. Extract en kolom zuiveren het RNA volgens de PicoPure RNA-extractie kit instructies van de fabrikant. DNAse behandeling is optioneel, en kan worden uitgevoerd op kolom in de RNA-zuivering volgens de analyse vereiste. Ten slotte is elueren de gebonden totaal RNA in een klein volume (11 tot 30 pl) van elutiebuffer en bewaar bij -80 ° C tot aan gebruik. Indien gewenst kan een 1 pi aliquot kan worden gebruikt om de totale RNA kwaliteit te beoordelen op een Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc.)

Representatieve resultaten:

Magnetische bead sortering werd gebruikt om Drosophila da neuronen (figuur 1) te isoleren. Het RNA gezuiverd van deze geïsoleerde da neuronen (figuur 2a) bleek te zijn van uitstekende kwaliteit, zoals aangegeven door de aanwezigheid van scherpe 5.8S, 18S en 28S ribosomaal RNA pieken wanneer geanalyseerd op een Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc) ( Figuur 2b). Beginnen met 30-40 derde instar larven we in staat waren om het isoleren van gemiddeld 300 tot 500 klasse-IV da neuronen met behulp van de PPK-GAL4 driver, en da 1500-2000 neuronen (klasse I, II, III en IV) met behulp van de pan- da neuron-specifieke GAL4 ^21-7 driver. Voor de beoordeling van de neuronale-specifieke verrijking van onze geïsoleerde cellen wij controlewerkzaamheden uitgevoerd kwantitatieve reverse transcriptie PCR (qRT-PCR) met behulp van twee neuronale gen-specifieke markers (elav en futsch). Deze analyses aangetoond dat er belangrijke factor verrijking van zowel de marker-genen duidt op een zeer specifieke verrijking voor da neuronen in vergelijking met de stromen door het gebruik van onze protocol (figuur 3). Ten slotte werd de geïsoleerd RNA uit zowel pan-da neuronen en klasse-IV da neuronen gebruikt worden om transcriptionele expressie profilering uit te voeren op Agilent Drosophila melanogaster hele genoom oligo microarrays (4 x 44K) (figuur 4). Deze analyses tal van eerder betrokken toezichthouders van da neuron dendriet morfogenese geïdentificeerd als aanvulling op een breed spectrum van eerder ongekarakteriseerde moleculen en vermeende signaaltransductie die mogelijk spelen een belangrijke functionele rol in da neuron ontwikkeling. Studies is ontworpen om de mogelijke rol (len) van de eerder ongekarakteriseerde moleculen in het bemiddelen da neuron ontwikkeling, en in het bijzonder dendriet morfogenese te beoordelen, zijn momenteel aan de gang.

Figuur 1:. Schema van de magnetische kraal sorteren van Drosophila da neuronen (a) Leeftijd afgestemd derde instar larven met het da neuron-specifieke GAL4, UAS-mCD8-GFP reporter transgen wordt doorsneden door het omkeren van de larvale cuticula inside-out, om de bloot PNS tot dissociatie buffer en opgeslagen in ijskoud PBS. (b) Enzymatische dissociatie wordt uitgevoerd door het toevoegen van Liberase Blendzyme 3 tot en met de oplossing die larvale cuticula. (c) De larven weefsels worden verder gescheiden door een combinatie van vortexen, trituratie en douncing voor niet specifiek gelabeld weefsels zoals vet-lichamen, darm en CZS. (d, e) De cellen worden vervolgens gefilterd met behulp van een 30 micrometer cel filter te verwijderen. De oplossing bevat een enkele celsuspensie van verschillende celtypen waaronder epitheel, spier-en zenuwcellen. (F) Anti-muis CD8a-antilichaam gecoate Dynabeads M-280 worden toegevoegd aan de celsuspensie, en geïncubeerd op ijs gedurende 30-60 minuten. ( g) De magnetische korrels bindt aan de da neuronen die uiting van een muis CD8 gelabeld GFP fusie-eiwit. (h, i) De magnetische kraal gecoate cellen worden gescheiden door het plaatsen van de oplossing in een sterk magnetisch veld. Het supernatant wordt verwijderd, en de cellen worden drie keer gewassen om eventuele resten van niet-specifieke cellen te verwijderen, wat resulteert in (j) highly gezuiverde populaties van da neuronen. Gelieve Klik hier voor een grotere versie van figuur 1 te zien.

Figuur 2: (a) representatief beeld van positief geselecteerde, GFP fluorescente klasse-IV da neuronen geïsoleerd door cel dissociatie en magnetische kraal sorteren. De resulterende populatie van neuronen werd bepaald in hoge mate verrijkt voor klasse-IV da neuronen met weinig of geen vervuilende cel onzuiverheden. (B) Een Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc) electropherogram van totaal RNA geïsoleerd van magnetische bead gesorteerd da neuronen , waarin een uitstekende totaal RNA kwaliteit, zoals aangegeven door de aanwezigheid van 5.8S, 18S en 28S rRNA. Gelieve Klik hier voor een grotere versie van figuur 2 te zien.

Figuur 3: qRT-PCR-analyse van neuronale marker genexpressie in geïsoleerde da neuronen (GAL421-7, UAS-mCD8-GFP) en de stroom door de fractie werd in drievoud uitgevoerd. De expressie niveaus van de twee neuronale-specifieke marker genen (elav en futsch) werden beoordeeld door qRT-PCR. Waarden verkregen uit deze analyses werden genormaliseerd om de endogene controle (rp49), en de niveaus ten opzichte van die welke werden waargenomen in de doorstroming fractie werd berekend met de ΔΔCτ methode ^6. Zowel elav en futsch waren significant verrijkt in de geïsoleerde da neuron bevolking ten opzichte van de stroom door fractie.

Figuur 4: Representatieve klasse-IV da neuron-specifieke Cy3 gelabeld microarray image-bestand. Hier afgebeeld is een Agilent Drosophila melanogaster hele genoom oligo microarray (4 x 44K) gehybridiseerd met Cy3-labeld totaal RNA geïsoleerd van klasse-IV da neuronen gezuiverd door middel van magnetische kraal sorteren. Gelieve Klik hier voor een grotere versie van figuur 4 te zien.

Discussion

Het protocol hier gepresenteerde is geoptimaliseerd voor de isolatie en zuivering van de perifere neuronen die strak te houden aan de binnenkant van de Drosophila derde instar larven nagelriemen met behulp van een magnetisch bolletje celsortering strategie. Hoewel we hebben gebruikt dit protocol om specifiek Drosophila da neuronen, toepassingen van dit protocol te isoleren om het isolement van andere celtypen die voldoen aan de cuticula in larve-of popstadium stadia van ontwikkeling (bijvoorbeeld epitheel, spieren, andere perifere neuronen) kunnen worden aangepast door variëren van een paar parameters en het gebruik van verschillende GAL4, UAS-mCD8-GFP reporter transgenen die de cel type of types van belang label. Bovendien kan dit protocol worden gebruikt in zowel de verlies-van-functie en gain-of-function benaderingen waarbij een gen van belang kan worden gekloneerd in een UAS-mCD8-GFP transgene die kan worden gekoppeld aan een GAL4 transgen om ofwel direct gen- specifieke verlies-van-functie (bv. UAS-RNAi) of gain-of-functie om een celtype van belang. Bijvoorbeeld in het geval van een transcriptiefactor kan men willen mogelijk up-of down-gereguleerde genen te identificeren bij de verlies-van-functie of gain-of-functie expressie in een celtype van belang. Door het isoleren van totaal RNA uit de gezuiverde celtype van belang via dit protocol en het gebruik van dit RNA te microarray expressie profilering uit te voeren is het mogelijk om differentieel gereguleerde genen die kunnen vertegenwoordigen downstream targets van transcriptionele regulatie die een rol spelen bij het bemiddelen fenotypische veranderingen in de cel .

Voor een succesvolle celsortering is het essentieel om aandacht te geven aan de kritische stappen gemarkeerd in de bovenstaande protocol. Voorbeelden van veel voorkomend probleem gebieden die wat meer het oplossen van problemen en optimalisatie kan eisen, afhankelijk van het type cel, omvatten (1) lage cel opbrengst en (2) cel klonteren tijdens de magnetische kraal isolatie. In het eerste geval kan men proberen het verminderen van de concentratie van Liberase Blendzyme 3, en te compenseren door een verhoging van de mechanische dissociatie via douncing. In het tweede geval kan men proberen het verminderen van de magnetische veldsterkte door toepassing van een enkele of meerdere lagen van de lijm lab tape over de magneet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)	MP Biomedicals	PBS10X02	Diluted to 1X working solution
10X Liberase Blendzyme 3	Roche Group	11814176001	Diluted to 1X working solution (28 Wünsch units/vial)
RNase-AWAY	Sigma-Aldrich	83931
Biotinylated Rat anti-Mouse-CD8a antibody	Invitrogen	MCD0815	100 μg/ml stock concentration
BSA (Bovine Serum Albumin), Fraction V	GIBCO, by Life Technologies	11018-017	Prepare a 1% BSA solution in PBS
Dynabeads M-280 Streptavidin	Invitrogen	11205D	1 μl can bind 0.05-0.10 μg of biotinylated antibody
PicoPure RNA Isolation Kit	Molecular Devices	KIT0204	Follow manufacturer’s instructions
Equipment (10) Neodymium block magnets (K & J Magnetics, Inc., Cat. #B444B), alternatively DynaMag™-2 (Invitrogen, Cat. #123-21D) may be used. Kontes Glass Tissue Grinder, 2 ml working capacity, with large clearance pestle (Cat. #885300-0002) Cell filters, e.g. MACS Pre-Separation Filter (Miltenyi Biotec, Cat. #130-041-407) 35 mm petri-dishes coated with Sylgard (Dow Corning Corporation, Cat. #3097358-1004) Dissecting tools: two pairs of Dumont No. 5 forceps (Fine Science Tools, Cat. #11251-20) Vannas spring micro-dissection scissors (Fine Science Tools, Cat. #15000-08) Pipettes (P-1000, P-100, P-10) with disposable tips Standard hemocytometer to count the cells and estimate purity Pasteur pipettes with fire polished tips of standard diameter, narrowed to ~50% of standard diameter and narrowed to ~25% of standard diameter for trituration Table top micro-centrifuge (1-16,000 (x) g) Vortex Fluorescent stereo-microscope (a Leica MZ16FA was used in this protocol)