Summary
במאמר וידאו זה אנו מציגים שיטה בידוד וטיהור של
Abstract
Protocol
הערות כלליות על מיון ביד מגנטית של הנוירונים תסיסנית היקפיים (עיתוי סך להשלמת לפרוטוקול: 2.5-3 שעות)
נהלי מעבדה רגיל לשמירה על סביבה נקייה, RNAse חינם יש לשמור בכל עת על מנת למנוע הידרדרות RNA.
כאשר לציפורן הזחל תסיסנית הוא גזור והוכנסו למאגר תא דיסוציאציה, הנוירונים ההיקפיים הם אחד התאים האחרון להתנתק לציפורן. אנחנו צריכים לנצל את רכוש שנועד בפרוטוקול זה כדי להסיר את רוב הלא ספציפית של תאים לציפורן כגון שריר ושומן לפני לבודד את הנוירונים דה.
בעזרת תרגול, פרוטוקול כולו ניתן להשלים בהצלחה בתוך כ 2.5 שעות. ההכנה של חרוזים מצופים נוגדן יש להשלים לפני שהניסוי יתחיל.
1. הכנת חרוזים מגנטיים עבור תאים איגוד:
צעד זה חייב להסתיים לפני תחילת הניסוי. החרוזים מוכן יכול להיות מוכן ומאוחסן על 4 מעלות צלזיוס עד הצורך.
- שטפי 100 μl של Dynabeads M-280 חרוזים מצופים streptavidin שלוש פעמים על ידי PBS resuspending אותו μl 500 של PBS טריים pelleting אותו שדה מגנטי חזק כל הזמן.
- לבסוף resuspend החרוזים ישירות μl 100 של חי נוגדן biotinylated עכברוש אנטי עכבר CD8a (ריכוז הנוגדנים היא 100 מיקרוגרם / מ"ל).
- דגירה את התערובת למשך שעה 1 על הקרח עם vortexing קלה מדי פעם כדי למנוע שקיעה. [1 μl של Dynabeads M-280 ניתן לאגד 0.05-0.10 מיקרוגרם של הנוגדן biotinylated].
- לשטוף את התערובת חרוז-נוגדן שלוש פעמים כמתואר בשלב 1.1 להסיר את עודפי הנוגדנים. החרוזים המגנטי מצופה כעת עם נוגדן ומוכנים לשמש. אחסן את התערובת חרוז הנוגדן 100 μl של 1X PBS על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
2. בחירה כביסה הזחלים: (10-15 דקות)
- פיק 30-50 מתאימים הגיל השלישי הזחלים instar ולמקם אותם בתוך שפופרת microfuge 1.6ml עם 1-1.2 מ"ל של בופר פוספט 1X (PBS). (3-5 דקות)
- סגור את צינור מערבולת אותה הגדרה המרבי שלוש פעמים עבור כל 1 שנייה.
- באמצעות אש מלוטש פיפטה פסטר להתעלמות supernatant לחלוטין. חזור על לשטוף (2.1) ו מערבולת (2.2) צעדים 3-4 פעמים עד supernatant ברורה לעין של כל חלקיקי מזון ופסולת.
- בקצרה לחזור על לשטוף עם 1 מ"ל של אתנול 70% ו להתעלמות supernatant.
- שטפו את הזחלים פעמיים עם 1 מ"ל של ddH2O וזורקים supernatant.
- בקצרה לחזור על לכבס שוב עם 1 מ"ל של RNase-משם להתעלמות supernatant.
- שטפו את הזחלים שלוש פעמים 1 מ"ל של ddH2O כדי להבטיח הסרה מלאה של RNase, משם.
3. Dissection: (10-12 דקות)
- 10-12 זחלים על המקום במרכז צלחת פטרי מצופה Sylgard 35mm. מקם אותם מעט אחד מהשני. [שלב קריטי: מחק כל הזחלים שאינם נראים בשלב ההתפתחותי המתאים]
- גזור לפתוח את קצה הקדמי של הזחלים באמצעות מספריים לנתיחה קנס עבור כל הזחלים.
- באמצעות זוג משעמם דומון מס '5 מלקחיים להפוך הזחלים מבפנים החוצה. להוסיף אחת המלקחיים בתוך לציפורן הזחל כל הדרך עד הסוף האחורי. קורט קצות מלקחיים יחד כדי לתפוס את הקצה האחורי של לציפורן (איור 1 א) (נסה להקיש את הקוטיקולה מטה על פני השטח Sylgard כדי להקל). שימוש בזוג השני של מלקחיים, לדחוף את לציפורן הזחל מבפנים החוצה. [שלב קריטי: נסו לתרגל בשיטה זו כמה פעמים לפני שתנסה את הניסוי בידוד התא. נסה להשיג את הזחלים הפוכה לחלוטין, על מנת להבטיח כי כל הרקמות הרכות נחשפים הפתרון עבור ניתוק קל.]
- לאחר ביתור הזחלים 3-4, להעביר אותם מיד טרי, קר כקרח PBS (במקום צינור על הקרח) בצינור מ"ל 1.6 microfuge.
- חזור על שלבים 3.1-3.4 עד כל הזחלים נדרש נאספים (זחלים 30-40 בפרוטוקול זה). [שלב קריטי:. צופים הפסד 10-20% במהלך דיסקציה ואת הניתוק, ולתכנן בהתאם]
4. הסרת הלא ספציפית בתאי חסיד רופף: (2-3 דקות)
[צעד זה מסייע ניקוי שאינם ספציפיים רקמות חסיד רופף כמו גופים CNS שומן.]
- קח את שפופרת המכילה 1.6 מ"ל microfuge שורשה הזחל הפוכה ולהחליף את supernatant עם μl כ 700-800 של טרי קר כקרח PBS.
- Pulse-המערבולת צינור microfuge 5 פעמים (3 שניות לכל הדופק) במלוא המהירות.
- בטל supernatant ולהחליף אותו בערך 700-800 μl טרי, קר כקרח PBS.
- חזור על שלבים 4.2 ו - 4.3 שלוש פעמים.
- Resuspend שורשה הזחל ב 400 μl של טרי, קר כקרח PBS
5. Dissociating רקמת ההשעיה לתוך תא בודד: (18-20 דקות)
[שלב קריטי: Over-דיסוציאציה עלול לגרום לאובדן של הסמן על פני קרום התא המוביל תשואה תא עניים כדאיות התא נמוכה. הרקמה הזחל יכול להיות מנותק או על ידי ניתוק מכני (sonication, douncing), דיסוציאציה האנזימטית (טריפסין, collagenase וכו ') או שילוב של שניהם. כאשר רקמות אלה הזחל שקשה לנתק, מצאנו כי שילוב של שניהם ניתוק מכני האנזימטית הניבו את התוצאות הטובות ביותר.]
- הוספת 1.5 μl של 1X Liberase Blendzyme 3 (28 יחידות nsch W / בקבוקון) כדי לציפורן הזחל תלויה μl 400 של PBS.
- וורטקס הפתרון 2-3 פעמים עבור כל שנייה בבית 1 הגדרה לכל היותר (זה אמור להסיר את התאים חסיד רופף מ לציפורן לתוך התמיסה).
- דגירה הפתרון בטמפרטורת החדר (22-25 מעלות צלזיוס) במשך 5 דקות. [שלב קריטי: זמן דגירה מאוד משפיע על יעילות הסופי מיון התא. זמן הדגירה מומלץ צריך להיות מספיק התרופפות הרקמה. לא יעלה על 15 דקות.]
- Pulse-המערבולת צינור 20-30 פעמים הגדרות מקסימום 2 שניות לכל הדופק במלוא המהירות. זה אמור משחרר את השרירים ורקמות אחרות לתוך התמיסה. בדיקת מדגם קטן מן הפתרון תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו בכל שלב. (עם ניסיון אחד צריך להיות מסוגל לקבוע את רמת דיסוציאציה ידי התבוננות צינור microfuge ישירות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו מופעל)
- לשטוף את העור הקרני הזחל 2-3 פעמים עם טרי, קר כקרח PBS ולבסוף resuspend אותם 500 μl של טרי BSA, PBS קר כקרח המכיל 1%.
- כדי למנוע את לציפורן הזחל דבק משטח הזכוכית של מטחנת Kontes 2 מ"ל רקמות העלי פינוי גדול, מעיל מראש מטחנת רקמות העלי עם BSA 1% פתרון PBS ואחרי שטיפה קצרה להשליך את הפתרון BSA. לאחר מכן, באמצעות אש מלוטש פיפטה פסטר, העברת שורשה משלב 5.5 ל מטחנת BSA מצופה הרקמה. [שלב קריטי: טרום לקרר את מטחנת רקמה / העלי ידי הצבתו על הקרח במשך כמה דקות על מנת למנוע נזק לתאים / תמוגה].
- Dounce רקמת במשיכות איטית ויציבה, הימנעות מקציף (כ 20-30 משיכות). [שלב קריטי:. Dounce לאט ובהתמדה, אחרת התאים עשויים lyse]
- כדי להעריך את רמות התא דיסוציאציה, לנגב את הקיר החיצוני של מטחנת את הרקמה עם רקמות Kimwipe נקי, לבדוק אותו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו. הנוירונים צריך מנותקת לציפורן, וניתן לראות את הפתרון. אם זה נמצא להיות קשה, לחילופין פיפטה מתוך מדגם קטן של הפתרון, ולבחון אותה תחת ניאון סטריאו מיקרוסקופ. אינדיקציה טובה תא דיסוציאציה הוא היעדר של נוירונים מ לציפורן הזחל. עם זאת, אם מישהו עדיין צופה נוירונים המחוברים לציפורן, או מעירה תאים ניתק באופן חלקי, dounce נוספת עד שהתאים להשיג ההשעיה תא בודד.
- Triturate הפתרון 5 פעמים עם אש מלוטש פיפטה פסטר צמצמה ל כ 50% מקוטר קצה סטנדרטי, ואחריו 10 פעמים עם אש מלוטש פיפטה פסטר צמצמה עד כ -25% מקוטר קצה רגיל. [שלב קריטי: טחינה דקה בכוח עלול לגרום נזק לתאים. צג התאים בין הצעדים, ולהתאים את ההליך בהתאם].
- סנן את הפתרון באמצעות מסנן 30 מיקרומטר תא לאסוף את התא תסנין בצינור מ"ל 1.6 microfuge. הפתרון שהתקבל צריכה להיות מורכבת ההשעיה תא בודד ועכשיו הוא מוכן מיון התא מגנטי.
6. מיון מגנטי נייד ביד: (45-75 דקות, תלוי זמן הדגירה נוגדן)
- הוסף 15 μl של חרוזים מצופים נוגדן מגנטי μl 500 ההשעיה התא (שלב 5.10). הנותרים מצומדות נוגדן חרוזים מגנטיים ניתן לאחסן עד הדרוש isolations תא הבאים.
- דגירה התאים עם חרוזים מצופים נוגדן מגנטי עבור 30-60 דקות על הקרח עם מזדמנים יד ערבוב. [שלב קריטי: דגירה בטמפרטורה גבוהה או זמן ארוך יותר עלול לגרום מחייב הלא ספציפית נוגדנים.]
- מניחים את הצינור microfuge בשדה מגנטי חזק במשך 2 דקות. כל התאים שנבחרו באופן חיובי יחד עם חרוזים מאוגד יפרידו לצד של הצינור.
- לאט לאט פיפטה supernatant, מוודא שלא להפריע התא גלולה.
- לשטוף את התאים 3-4 פעמים ב טרי, קר כקרח PBS להסיר כל שאר הלא ספציפית לתאים.
- Resuspend התאים μl 30 של טרי, קר כקרח PBS.
- כדי טוהר המשוער ואת התשואה של תאים, פיפטה 5 μl לכל חש של התאension על פני השטח המלוטשים של hemocytometer ולספור את כל התאים ניאון גלוי תחת ניאון סטריאו מיקרוסקופ. כמו כן לבדוק את כמות אי - ניאון תאים סימנים של זיהומים. בדרך כלל המדגם יהיה מועשר עבור תאים ניאון.
7. RNA ניתוק מן מגנטי תאים ממוין ביד: (60-75 דקות)
- לאחר הספירה, גלולה התאים השדה המגנטי, לבטל את supernatant ולהוסיף 20 μl של חיץ החילוץ של ™ PicoPure RNA בידוד Kit (התקנים מולקולריים). בהתאם למספר תא אחד ייתכן שיהיה צורך להוסיף נפח גבוה יותר של החיץ החילוץ.
- וורטקס הצינור במהירות המרבית כדי לאפשר ערבוב של התא גלולה עם חיץ החילוץ.
- דגירה הצינור ב 42 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
- כדי להבטיח הסרה של חרוזים מגנטיים לפני טיהור עמודה של רנ"א (ראה שלב 7.5), הצינור הוא centrifuged בקצרה במשך 2 דקות גלולה חרוזים מגנטיים ב 2000 (x) g. הצינור ממוקם אז שדה מגנטי חזק כדי לשמור על גלולה, ואת supernatant מועברת צינורית microfuge חדש.
- תמצית ועמודה לטהר את RNA בהתאם להוראות RNA PicoPure ערכת חילוץ של היצרן. טיפול DNAse הוא אופציונלי, וניתן לבצעו על עמודה במהלך טיהור RNA על פי דרישה ניתוח. לבסוף, elute רנ"א הכל קשור בנפח קטן (11-30 μl) של חיץ elution ולאחסן ב -80 ° C עד מוכן לשימוש. אם תרצה aliquot 1 μl ניתן להשתמש כדי להעריך את האיכות הכוללת RNA על Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc).
נציג תוצאות:
מיון חרוז מגנטי שימש לבודד תסיסנית דה נוירונים (איור 1). RNA מטוהרים אלו נוירונים בודדים דה (איור 2 א) נמצאה באיכות מעולה כפי שמצוין על ידי נוכחות של 5.8S, 18S חדה -28 פסגות RNA ריבוזומלי כאשר נותחו על 2100 Agilent Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc) ( איור 2b). החל זחלי 30-40 instar השלישי אנו מסוגלים לבודד בממוצע 300-500 בכיתה-IV נוירונים דה באמצעות הנהג פ.פ.ק.-GAL4, ו 1500-2000 נוירונים דה (Class I, II, III & IV) באמצעות הפאן דה נוירון ספציפי GAL4 21-7 הנהג. כדי להעריך את העשרת עצבי ספציפי של תאים מבודדים שלנו ביצענו כמותי שעתוק לאחור PCR (qRT-PCR) באמצעות שני גנים ספציפיים העצבית סמנים (elav ו futsch). ניתוחים אלה נחשפו העשרה לקפל משמעותי של שני גנים סמן המעיד על העשרת ספציפיות ביותר עבור נוירונים דה לעומת תזרים באמצעות שימוש בפרוטוקול שלנו (איור 3). לבסוף, RNA שבודד נוירונים הן פאן דה ומעמד-IV נוירונים דה שימש לביצוע פרופיל ביטוי תעתיק על Agilent תסיסנית melanogaster כולו הגנום microarrays אוליגו (4 x 44K) (איור 4). ניתוחים אלה זיהו הרגולטורים מעורבים בעבר רבים של המורפוגנזה דה דנדריט נוירון בנוסף קשת רחבה של מולקולות uncharacterized בעבר המשוערת הולכת אותות המסלולים כי פוטנציאל לשחק תפקידים פונקציונלי חשוב בהתפתחות נוירון דה. מחקרים שנועדו להעריך את התפקיד הפוטנציאלי (ים) של המולקולות הללו uncharacterized בעבר בתיווך דה פיתוח נוירון, ו המורפוגנזה דנדריט במיוחד, נערכים כיום.
איור 1:. סכמטי של מיון חרוז המגנטי של נוירונים תסיסנית דה (א) בהתאמה הגיל השלישי הזחלים instar הנושאת את נוירון ספציפי דה GAL4, כטב"מ-mCD8-GFP כתב transgene הם גזור על ידי היפוך לציפורן הזחל מבפנים החוצה, כדי לחשוף את PNS כדי ניתוק חיץ ומאוחסנים קר כקרח PBS. (ב) ניתוק אנזימתי מתבצעת על ידי הוספת Liberase Blendzyme 3 לפתרון המכיל לציפורן הזחל. (ג) ברקמות הזחל הם ניתק עוד יותר על ידי שילוב של טחינה דקה vortexing ו douncing כדי להסיר אי - במיוחד ברקמות שכותרתו כגון שומן הגוף, הבטן ואת מערכת העצבים המרכזית. (ד, ה) תאים מסוננים מכן באמצעות 30 תאים לסנן מיקרומטר. הפתרון כולל השעיה תא בודד של תאים מסוגים שונים, כולל שרירים, epithelia ונוירונים. (ו) אנטי עכבר CD8a-נוגדן מצופה Dynabeads M-280 מתווספים ההשעיה את התא מודגרות על הקרח במשך 30-60 דקות. ( ז) חרוזים מגנטיים נקשר הנוירונים דה כי מביעים עכבר CD8 מתויג חלבון ה-GFP היתוך. (ח, ט) בתאים מגנטי מצופה חרוז מופרדים באמצעות הצבת פתרון שדה מגנטי חזק. Supernatant נמחקת, וגם התאים נשטפים שלוש פעמים כדי להסיר את כל שיירי הלא ספציפית התאים, וכתוצאה מכך (י) hמטוהרים ighly אוכלוסיות של נוירונים דה. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1.
איור 2: (א) התמונה נציג שנבחר באופן חיובי, GFP ניאון מחלקה-IV נוירונים דה מבודד על ידי תא דיסוציאציה ומיון חרוז מגנטי. האוכלוסייה של נוירונים וכתוצאה מכך היה נחוש בדעתו להיות מועשר עם מעט או ללא זיהומים תא לזהם לשיעור-IV נוירונים דה. (ב) 2100 Agilent Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc) electropherogram של רנ"א סך מבודד מגנטי נוירונים מיון חרוז da , מראה באיכות מעולה הכולל RNA כפי שצוין על ידי נוכחות של 5.8S, 18S, ו -28 rRNAs. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של הדמות 2.
איור 3: qRT-PCR ניתוח של ביטוי גנים העצבית סמן מבודדים דה נוירונים (GAL421-7, כטב"מ-mCD8-GFP) ואת לזרום חלק בוצעה בשלושה עותקים. רמות הביטוי של שני נוירונים ספציפיים גנים סמן (elav ו futsch) הוערכו על ידי qRT-PCR. הערכים המתקבלים ניתוחים אלה היו מנורמל לשלוט אנדוגני (rp49), ואת רמות יחסית לאלו שנצפו לזרום חלק חושבו בשיטת ΔΔCτ 6. שני elav ו futsch היו מועשר באופן משמעותי את אוכלוסיית נוירון בודד דה לעומת תזרים באמצעות שבר.
איור 4: נציג מעמד-IV דה נוירון ספציפי Cy3 שכותרתו microarray קובץ התמונה. המוצג כאן הוא תסיסנית Agilent melanogaster כולו הגנום אוליגו microarray (4 x 44K) הכלאה עם Cy3-RNA labeld סך מבודד ממעמד-IV נוירונים דה מטוהרים על ידי מיון חרוז מגנטי. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של הדמות 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המובא כאן הוא אופטימיזציה עבור בידוד וטיהור של נוירונים הפריפריה אשר להיצמד בחוזקה לפני השטח הפנימי של לציפורן third תסיסנית הזחל instar באמצעות מיון מגנטי חרוז אסטרטגיה התא. אמנם יש לנו להשתמש בפרוטוקול זה במיוחד כדי לבודד תסיסנית נוירונים דה, יישומים של פרוטוקול זה לבידודה של סוגי תאים אחרים לדבוק לציפורן של הזחל גלמי או בשלבים של פיתוח (למשל epithelia, שריר, עצב היקפיים אחרים) ניתן להתאים על ידי משתנים כמה פרמטרים ושימוש GAL4 ברורים, כטב"מ-mCD8-GFP transgenes הכתב אשר התווית את סוג התא או סוגים של עניין. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול לשמש הן אובדן פונקציה של ולהשיג-of-פונקציה גישות שבו הגן של עניין ניתן משובטים לתוך transgene כטב"מ-mCD8-GFP שניתן יחד עם transgene GAL4 ישיר או גנים ההפסד הספציפי של פונקציה (למשל כטב"מ-RNAi) או רווח של פונקציה לסוג התא של עניין. לדוגמה, במקרה של גורם שעתוק אפשר לאחל לזהות גנים פוטנציאל למעלה או למטה מוסדר על הפסד פונקציה של רווח או של פונקציה ביטוי בסוג התא של עניין. ידי בידוד RNA סך מסוג התא מטוהרים עניין באמצעות פרוטוקול זה באמצעות RNA לבצע אפיון ביטוי microarray ניתן לזהות גנים מוסדר באופן דיפרנציאלי, כי רשאי לייצג מטרות במורד הזרם של תקנה תעתיק כי תפקיד בתיווך שינויים פנוטיפי בתוך התא .
עבור מיון התא מוצלח חשוב לתת תשומת לב קפדנית את השלבים הקריטיים הדגיש בפרוטוקול לעיל. דוגמאות אזורים בעיה נפוצה אשר יחייבו כמה בעיות אופטימיזציה נוספת, בהתאם לסוג התא, כוללים (1) תשואה התא נמוכה (2) התא clumping במהלך הבידוד חרוז מגנטי. במקרה הראשון, אפשר לנסות להפחית את ריכוז Liberase Blendzyme 3, ולפצות על ידי הגדלת ניתוק מכני באמצעות douncing. במקרה השני, אפשר לנסות להפחית את עוצמת השדה המגנטי על ידי יישום שכבות בודדות או מרובות של קלטת המעבדה דבק על המגנט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
אנו מודים בני הזוג. Yuh-Nung יאן ווס Grueber למתן מניות לטוס השתמשו במחקר זה. המחברים להכיר תומס פ קייט מילר Jeffress הזיכרון אמון על התמיכה של מחקר זה (DNC) ו-Office ג'ורג' מייסון האוניברסיטה מכללה (EPRI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | MP Biomedicals | PBS10X02 | Diluted to 1X working solution |
| 10X Liberase Blendzyme 3 | Roche Group | 11814176001 | Diluted to 1X working solution (28 Wünsch units/vial) |
| RNase-AWAY | Sigma-Aldrich | 83931 | |
| Biotinylated Rat anti-Mouse-CD8a antibody | Invitrogen | MCD0815 | 100 μg/ml stock concentration |
| BSA (Bovine Serum Albumin), Fraction V | GIBCO, by Life Technologies | 11018-017 | Prepare a 1% BSA solution in PBS |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 11205D | 1 μl can bind 0.05-0.10 μg of biotinylated antibody |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Molecular Devices | KIT0204 | Follow manufacturer’s instructions |
Equipment
|
|||
References
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim,, Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Ann. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
- Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5199-5204 (2007).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) methods. Methods. 25, 402-408 (2001).
