Isolering och rening av Drosophila Kringutrustning Nervceller av magnetiska Bead Sortering

Summary

I denna video-artikeln presenterar vi en metod för isolering och rening av

Abstract

Den

Protocol

Allmänna kommentarer om Magnetic Bead Sortering av Drosophila neuron (Totalt Tidpunkt för genomförandet av protokollet: 2,5-3 timmar)

Standard lab rutiner för att upprätthålla en ren, RNAse fri miljö måste iakttas vid alla tillfällen för att förhindra RNA nedbrytning.

När Drosophila larver nagelband är dissekeras och placeras i cellen dissociation buffert, det perifera nervceller är en av de sista cellerna att lossna från nagelbanden. Vi har utnyttjat denna egenskap och utformade detta protokoll för att ta bort de flesta av de icke-specifika celler från nagelbanden, såsom muskler och fett före isolera da nervceller.

Med lite övning kan hela protokollet vara slutfört inom cirka 2,5 timmar. Beredningen av antikroppsförsedda pärlor måste slutföras innan försöket börjar.

1. Förbereda magnetiska kulor för bindning Celler:

Detta steg måste slutföras före starten av försöket. Den beredda pärlor kan förberedas och förvaras vid 4 ° C tills det behövs.

1. Tvätta 100 ìl Dynabeads M-280 Streptavidin belagd pärlor tre gånger i PBS genom resuspending den i 500 l av färska PBS och pelletering den i ett starkt magnetfält varje gång.
2. Slutligen resuspendera kulorna direkt i 100 ìl outspädd biotinylerad råtta anti-mus-CD8a antikropp (antikropp koncentration är 100 mikrogram / ml).
3. Inkubera blandningen i 1 timme på is med enstaka milda vortexa att förhindra sedimentering. [1 ìl Dynabeads M-280 kan binda 0,05-0,10 mikrogram biotinylerad antikroppar].
4. Tvätta pärlan-antikroppen blandning tre gånger som beskrivs i steg 1,1 att ta bort överskott antikropp. Den magnetiska kulor är nu belagda med antikroppar och redo att användas. Förvara pärla-antikroppen blandningen i 100 l 1X PBS vid 4 ° C fram till användning.

2. Välja och tvätt Larver: (10-15 minuter)

1. Plocka 30-50 åldersmatchade third INSTAR larver och placera dem i en 1.6ml mikrofugrör med 1-1,2 ml 1X Fosfatbuffrad saltlösning (PBS). (3-5 minuter)
2. Tillslut röret och skaka den på högsta inställningen tre gånger för en sekund var.
3. Med hjälp av en brand polerad pasteurpipett kassera supernatanten helt. Upprepa tvätt (2,1) och skaka (2,2) steg 3-4 gånger tills supernatanten är synligt fri från matrester och skräp.
4. Kortfattat upprepa tvätta med 1 ml 70% etanol och kassera supernatanten.
5. Tvätta larverna två gånger med 1 ml ddH2O och kassera supernatanten.
6. Kortfattat upprepa tvätta en gång med 1 ml RNase-away och kassera supernatanten.
7. Tvätta larver tre gånger i 1 ml ddH2O att säkerställa fullständig borttagning av RNase-away.

3. Dissection: (10-12 minuter)

1. Placera 10-12 larver i mitten av en Sylgard belagd 35mm Petri platta. Placera dem något från varandra. [Kritiska steget: Släng alla larver som inte verkar vara i rätt utvecklingsstadium]
2. Skär öppna den främre spetsen av larver med hjälp av ett par fina dissektion sax för alla larver.
3. Använda ett par trista Dumont nr 5 pincett invertera larverna inifrån och ut. Sätt ett forcep inuti larvala nagelbanden hela vägen till den bakre änden. Nyp tips av pincett tillsammans för att greppa den bakre änden av nagelband (Figur 1a) (prova att trycka på nagelbanden ner på Sylgard ytan för att göra det lättare). Använda den andra pincett, tryck larver ytterhud inifrån och ut. [Kritiska steget: Försök att öva den här metoden ett par gånger innan försöket cellen isolering. Försök att få larverna helt omvänt, att garantera att alla mjukdelar utsätts för en lösning för enkel dissociation.]
4. Efter att dissekera 3-4 larver, överföra dem till friska, iskalla PBS (placera röret på is) i en 1,6 ml mikrofugrör.
5. Upprepa steg från 3,1 till 3,4 tills alla nödvändiga larver samlas in (30-40 larver i detta protokoll). [Avgörande steg:. Förutse 10-20% förlust under dissekering och dissociation, och planera därefter]

4. Borttagning av löst vidhäftande icke-specifika celler: (2-3 minuter)

[Detta steg hjälper till vid clearing av löst vidhäftande icke-specifika vävnader såsom fett organ och CNS.]

1. Ta 1,6 ml mikrofugrör innehåller den inverterade larver nagelbanden och ersätta supernatanten med ca 700-800 l färska iskall PBS.
2. Puls-Vortexa mikrofugrör 5 gånger (3 sekunder per puls) i full fart.
3. Kassera supernatanten och ersätta det med ca 700-800 l färska, iskall PBS.
4. Upprepa steg 4,2 och 4,3 tre gånger.
5. Resuspend de larver nagelbanden i 400 l av färska, iskall PBS

5. Isär vävnaden till en enda cell suspension: (18-20 minuter)

[Kritiska steget: Över-dissociation kan orsaka förlust av cellytan markör som leder till dålig cell avkastning och låga cellernas livskraft. Den larver vävnaden kan skiljas av antingen mekanisk dissociation (ultraljudsbehandling, douncing), enzymatiska dissociation (trypsin, kollagenas etc.) eller en kombination av båda. Eftersom dessa larver vävnader är svåra att särskilja, fann vi att en kombination av både mekanisk och enzymatisk dissociation gav bäst resultat.]

1. Tillsätt 1,5 l 1X Liberase Blendzyme 3 (28 W nsch enheter / flaska) till larver nagelbanden upphängd i 400 l PBS.
2. Vortex lösningen 2-3 gånger under 1 sekund var vid maximal inställning (Detta bör ta bort den löst vidhäftande celler från nagelbanden i lösningen).
3. Inkubera i rumstemperatur (22-25 ° C) i 5 minuter. [Kritiska steget: Inkubationstiden kraftigt påverkar den slutliga effektivitet cellen sortering. Den rekommenderade Inkubationstiden bör räcka för att lossa vävnad. Inte överstiga 15 minuter.]
4. Puls-vortex röret 20-30 gånger på högsta inställningarna i 2 sekunder per puls i full fart. Detta bör frigör muskler och andra vävnader i lösningen. Inspektera ett litet urval ur lösningen under en fluorescerande stereomikroskop vid varje steg. (Med erfarenhet man ska kunna fastställa graden av dissociation genom att observera mikrofugrör direkt under en fluorescens aktiverad stereomikroskop)
5. Tvätta larver nagelbanden 2-3 gånger med rent, iskallt PBS och slutligen resuspendera dem i 500 l av färska, iskall PBS innehållande 1% BSA.
6. För att undvika larver nagelband fastnar på glasytan på 2 ml Kontes vävnad kvarn och stora clearance mortelstöt, pre-coat vävnaden kvarn och stöt med en 1% BSA i PBS lösning och efter en kort sköljning kassera BSA lösningen. Därefter, med hjälp av en brand-polerat Pasteur pipett nagelbanden från steg 5,5 till BSA-belagda vävnad kvarn. [Kritiska steget: Pre-cool vävnaden kvarn / mortel genom att placera den på is i några minuter för att förhindra cellskador / lys].
7. Dounce vävnaden med långsam och stadig stroke och undvika skumbildning (cirka 20-30 slag). [Avgörande steg:. Dounce långsamt och stadigt, annars celler kan Lyse]
8. För att bedöma cellen dissociation nivåer, torka av yttervägg av vävnaden kvarn med en ren Kimwipe vävnad, och inspektera den under en fluorescerande stereomikroskop. De nervceller bör ha lossnat från nagelbanden, och kan ses i lösningen. Om detta visar sig vara svårt, alternativt pipett ut ett litet urval av lösningen, och observera den under en fluorescerande stereomikroskop. En bra indikation på cellen dissociation är frånvaron av nervceller från larver nagelbanden. Men om man fortfarande konstatera att nervceller knuten till nagelbanden, eller konstaterar ofullständigt dissocierade celler, dounce vidare tills celler får en enda cell suspension.
9. Mal sönder lösningen 5 gånger med en brand-polerad pasteurpipett minskat till cirka 50% av standarden spetsen diameter, följt av 10 gånger med en brand-polerad pasteurpipett minskat till cirka 25% av standarden spetsen diameter. [Kritiska steget: Kraftfull trituration kan skada cellerna. Övervaka celler mellan stegen och justera enlighet därmed].
10. Filtrera lösningen genom ett 30 ìm cell filter och samla cellen filtratet i en 1,6 ml mikrofugrör. Den färdiga lösningen skall bestå av ett enda cellsuspensionen och är nu redo för magnetisk cell sortering.

6. Magnetisk Bead Cell Sortering: (45 - 75 minuter, beroende på antikroppar inkubationstid)

1. Tillsätt 15 ìl antikroppsförsedda magnetiska kulor till 500 l cellsuspension (steg 5,10). Resterande antikropp konjugerad magnetiska kulor kan lagras tills det behövs för senare cell isolering.
2. Inkubera cellerna med antikroppsförsedda magnetiska kulor i 30-60 minuter på is med enstaka hand-blandning. [Kritiska steget: inkubation vid en högre temperatur eller längre tid kan leda till icke-specifik antikropp bindande.]
3. Placera mikrofugrör i ett starkt magnetfält i 2 minuter. Alla positivt markerade cellerna tillsammans med obundna pärlor kommer att separera till sidan av röret.
4. Sakta pipett supernatanten och se till att inte störa cellpelleten.
5. Tvätta cellerna 3-4 gånger i färskt, iskalla PBS att undanröja eventuella återstående icke-specifika celler.
6. Resuspendera cellerna i 30 l färska, iskall PBS.
7. Att närma renhet och avkastningen av celler, pipett 5 ìl av cellen Suspension på den polerade ytan av en hemocytometer och räkna alla synliga fluorescerande celler i ett fluorescerande stereomikroskop. Kontrollera också hur mycket icke-fluorescerande celler och några tecken på orenheter. Typiskt provet kommer att höganrikat för fluorescerande celler.

7. RNA Isolering från Magnetisk Sorterat Bead Celler: (60 - 75 minuter)

1. Efter att ha räknat, pellets cellerna i ett magnetfält, kassera supernatanten och tillsätt 20 l extraktionsbuffert från PicoPure ™ RNA Isolation Kit (Molecular Devices). Beroende på mobilnummer man kan behöva lägga till en högre volym extraktionsbuffert.
2. Vortex röret vid maximal hastighet för att blanda cellpelleten med extraktionsbuffert.
3. Inkubera röret i 42 ° C i 30 minuter.
4. För att säkerställa avlägsnande av magnetiska kulor innan kolumn rening av RNA (se steg 7.5), är röret kort centrifugeras vid 2000 (x) g i 2 minuter till pellets den magnetiska pärlor. Röret placeras sedan i ett starkt magnetfält för att behålla pellets, och supernatanten överförs till en ny mikrofugrör.
5. Utdrag och kolumn rena RNA enligt PicoPure RNA-extraktion kit tillverkarens anvisningar. DNAse behandling är frivillig och kan utföras på kolumnen under RNA rening enligt analysen krav. Slutligen eluera bunden totala RNA i en liten volym (11-30 l) av eluering buffert och förvara vid -80 ° C tills redo att användas. Om så önskas en 1 l alikvot kan användas för att bedöma total RNA kvalitet på en Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc.).

Representativa resultat:

Magnetisk pärla sortering användes för att isolera Drosophila da neuron (figur 1). RNA renas från dessa isolerade da neuroner (Figur 2a) visade sig vara av utmärkt kvalitet som framgår av förekomsten av skarpa 5.8S, 18S och 28S ribosomalt RNA toppar när de analyseras på en Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.) ( Figur 2b). Från och med 30-40 third INSTAR larver vi kunde isolera i genomsnitt 300-500 klass IV da nervceller med hjälp av PPK-GAL4 förare, och 1500-2000 da nervceller (klass I, II, III & IV) med hjälp av pan- da neuron-specifika GAL4 ^21-7 förare. För att bedöma neuronala-specifika anrikning av våra isolerade celler vi utförde kvantitativ PCR omvänd transkription (QRT-PCR) som innehåller två neuronala genspecifika markörer (elav och futsch). Dessa analyser visade signifikanta gånger anrikning av både markörgener visar en mycket specifik berikande för da nervceller jämfört med flödet genom att använda våra protokoll (Figur 3). Slutligen var de isolerade RNA från både pan-da neuroner och klass-IV da nervceller som används för att utföra transkriptionell expression profiling på Agilent Drosophila melanogaster helgenom-oligo microarrays (4 x 44K) (Figur 4). Dessa analyser identifierat ett flertal tidigare inblandade tillsynsmyndigheter i da neuron Dendrite morfogenes förutom ett brett spektrum av tidigare uncharacterized molekyler och möjliga signalvägar transduktion som eventuellt spelar en viktig funktionell roll i da neuron utveckling. Studier för att bedöma de potentiella roll (er) av dessa tidigare uncharacterized molekyler att medla da neuron utveckling, och särskilt Dendrite morfogenes, är för närvarande pågår.

Figur 1:. Schematisk av magnetiska sträng sortering av Drosophila da nervceller (a) åldersmatchade third INSTAR larver bär da neuron-specifika GAL4, UAS-mCD8-GFP reporter transgenen är dissekeras genom att vända larver nagelbanden inifrån och ut, för att avslöja PNS till dissociation buffert och lagras i iskalla PBS. (b) enzymatiska dissociation sker genom att lägga Liberase Blendzyme 3 till lösning som innehåller larver nagelband. (c) larver vävnader ytterligare dissocierade av en kombination av vortexa, trituration och douncing att ta bort icke-specifikt märkta vävnader såsom fett-organ, tarm och CNS. (d, e) celler sedan filtreras med hjälp av ett 30 filter ìm cell. Lösningen innehåller en enda cell suspension av olika celltyper inklusive epitel, muskel-och nervceller. (F) anti-mus CD8a-antikropp Dynabeads M-280 läggs till cellsuspension, och inkuberas på is i 30-60 minuter. ( g) Den magnetiska pärlor binds till da nervceller som uttrycker en mus CD8 taggad GFP fusionsprotein. (h, i) Den magnetiska pärla belagda celler avskiljs genom att placera lösningen i ett starkt magnetfält. Supernatanten tas bort, och cellerna tvättas tre gånger för att ta bort eventuella icke-specifika celler, vilket resulterar i (j) highly renade populationer av da nervceller. Vänligen klicka här för att se en större version av figur 1.

Figur 2: (a) representant bild av positivt utvalda, GFP fluorescerande klass IV da neuroner isoleras genom cellen dissociation och magnetiska sträng sortering. Den resulterande populationen av nervceller bedömdes vara höganrikat för klass-IV da nervceller med liten eller ingen kontaminerar föroreningar cell. (B) En Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.) electropherogram av totala RNA isoleras från magnetiska sorteras pärla da nervceller som visar en utmärkt total RNA kvalitet som indikeras av närvaron av 5.8S, 18S och 28S rRNAs. Vänligen klicka här för att se en större version av figur 2.

Figur 3: QRT-PCR-analys av neuronala markör genuttryck i isolerad da neuron (GAL421-7, UAS-mCD8-GFP) och flödet genom fraktionen utfördes i tre exemplar. Uttrycket nivåer av de två neuronala-specifika markörgener (elav och futsch) bedömdes av QRT-PCR. Värden som erhålls från dessa analyser normaliserades till den endogena kontrollen (rp49), och nivåerna i förhållande till de som observerats hos flödet genom bråkdel har beräknats med hjälp av ΔΔCτ metod ^6. Både elav och futsch var signifikant anrikas i den isolerade da neuron befolkningen jämfört med flödet genom fraktion.

Figur 4: representant klass IV da neuron-specifika Cy3 märkt microarray bildfil. Visas här är en Agilent Drosophila melanogaster helgenom-oligo microarray (4 x 44K) hybridiseras med Cy3-labeld totala RNA isoleras från klass IV da neuroner renas genom magnetisk pärla sortering. Vänligen klicka här för att se en större version av figur 4.

Discussion

Protokollet presenteras här är optimerad för isolering och rening av perifera nervceller som följer tätt på insidan av Drosophila third INSTAR larver nagelband hjälp av en magnetisk kula strategi cell sortering. Samtidigt som vi har använt detta protokoll för att specifikt isolera Drosophila da nervceller, tillämpningar av detta protokoll till isolering av andra celltyper som följer på nagelbanden i larver eller PUPP-utvecklingsstadier (t.ex. epitel, muskel, andra perifera nervceller) kan anpassas av varierande ett fåtal parametrar och bygger på olika GAL4, UAS-mCD8-GFP reporter transgener som etikett cellen eller de typer av intresse. Dessutom kan detta protokoll användas både förlust-av-funktion och få-av-funktion strategier där en gen av intresse kan klonas i ett UAS-mCD8-GFP transgenen som kan kopplas till en GAL4 transgen direkt antingen gen- specifik förlust-av-funktion (t.ex. UAS-RNAi) eller få-av-funktion för att en cell typ av intresse. Till exempel i fallet med en transkriptionsfaktor man kan önska att upptäcka möjliga upp-eller ned-reglerade gener vid bortfall av funktion eller vinst-of-funktionen uttryck i en cell typ av intresse. Genom att isolera totala RNA från det renade celltypen av intresse via detta protokoll och använda denna RNA utföra microarray expression profiling är det möjligt att identifiera differentiellt reglerade gener som kan representera nedströms mål för transkriptionell reglering som spelar en roll inom fenotypiska förändringar i cellen .

För framgångsrika cellsortering det är viktigt att ge stor uppmärksamhet åt de kritiska stegen lyfts fram i ovan nämnda protokoll. Exempel på vanliga problemområden som kan kräva vissa ytterligare felsökning och optimering, beroende på celltyp, inkludera (1) låg cell avkastning och (2) cellen klumpar under magnetiska sträng isolering. I det första fallet kan man försöka minska koncentrationen av Liberase Blendzyme 3, och kompensera genom att öka mekanisk dissociation via douncing. I det andra fallet kan man försöka minska den magnetiska fältstyrkan genom att tillämpa en enda eller flera lager av självhäftande lab tejp över magneten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)	MP Biomedicals	PBS10X02	Diluted to 1X working solution
10X Liberase Blendzyme 3	Roche Group	11814176001	Diluted to 1X working solution (28 Wünsch units/vial)
RNase-AWAY	Sigma-Aldrich	83931
Biotinylated Rat anti-Mouse-CD8a antibody	Invitrogen	MCD0815	100 μg/ml stock concentration
BSA (Bovine Serum Albumin), Fraction V	GIBCO, by Life Technologies	11018-017	Prepare a 1% BSA solution in PBS
Dynabeads M-280 Streptavidin	Invitrogen	11205D	1 μl can bind 0.05-0.10 μg of biotinylated antibody
PicoPure RNA Isolation Kit	Molecular Devices	KIT0204	Follow manufacturer’s instructions
Equipment (10) Neodymium block magnets (K & J Magnetics, Inc., Cat. #B444B), alternatively DynaMag™-2 (Invitrogen, Cat. #123-21D) may be used. Kontes Glass Tissue Grinder, 2 ml working capacity, with large clearance pestle (Cat. #885300-0002) Cell filters, e.g. MACS Pre-Separation Filter (Miltenyi Biotec, Cat. #130-041-407) 35 mm petri-dishes coated with Sylgard (Dow Corning Corporation, Cat. #3097358-1004) Dissecting tools: two pairs of Dumont No. 5 forceps (Fine Science Tools, Cat. #11251-20) Vannas spring micro-dissection scissors (Fine Science Tools, Cat. #15000-08) Pipettes (P-1000, P-100, P-10) with disposable tips Standard hemocytometer to count the cells and estimate purity Pasteur pipettes with fire polished tips of standard diameter, narrowed to ~50% of standard diameter and narrowed to ~25% of standard diameter for trituration Table top micro-centrifuge (1-16,000 (x) g) Vortex Fluorescent stereo-microscope (a Leica MZ16FA was used in this protocol)