Цифровой Microfluidics автоматизированного протеомных Обработка

Summary

Цифровой Microfluidics это техника характеризуется манипуляции дискретных капель (~ NL - мл) на массив электродов с применением электрических полей. Она хорошо подходит для проведения быстрых, последовательных, миниатюрных автоматизированных биохимических анализов. Здесь мы сообщаем платформы, способной автоматизировать несколько протеомных шагов обработки.

Abstract

Клиническая протеомика стала важной новой дисциплиной, обещая открытию биомаркеров, которые будут полезны для ранней диагностики и прогноза заболевания. Хотя клинические протеомных методы отличаются друг от друга, общая характеристика необходимости (я) экстракция белков из очень разнородных жидкостей (например, сыворотки, цельной крови и др.) и (II), обширные биохимические обработки до анализа. Здесь мы сообщаем о новых цифровых микрофлюидики (DMF) метод, основанный на интеграции нескольких этапов обработки, используемые в клинической протеомики. Это включает в себя белок добычи, resolubilization, сокращение, алкилирования и ферментативного пищеварения. Цифровой микрофлюидики является микромасштабной жидкости обработки техника, в которой nanoliter-микролитр размера капель манипулируют на открытой поверхности. Капли расположены на верхней части массив электродов, покрытых слоем диэлектрика - когда электрический потенциал прикладывается к капле, расходы накапливаются по обе стороны от диэлектрика. Обвинения служить электростатическая ручки, которые могут быть использованы для контроля капли позиции, и смещение последовательности электродов в серии, капли можно обойтись, перемещение, слияние, соединение, и разделить на поверхности. Таким образом, DMF является естественным, пригодный для проведения быстрых, последовательных, многоступенчатое, миниатюрных автоматизированных биохимических анализов. Это представляет собой значительный шаг вперед по сравнению с традиционными методами (опираясь на Руководство пипетки или роботов), и имеет потенциал, чтобы быть полезным новым инструментом в клинической протеомики.

Маис Дж. Джебраил, Вивьен Н. Лук, и Стив CC Ши способствовали в равной степени к этой работе.

Текущий адрес Серджио LS Фрейре является в университете наук в Филадельфии расположен в 600 Юг 43-й улицы, Philadelphia, PA 19104.

Protocol

Часть 1: Изготовление устройств

1. Чистая стеклянных подложек в растворе Piranha (3:1 конц серной кислоты. 30% перекиси водорода). Оставьте субстратов в Piranha решение в течение 10 минут при частом помешивании.
2. После ополаскивания в деионизированной (DI) воде и сушки подложки с N ₂ газа, место подложки в камере электронного пучка для хрома осаждения (толщиной 250 нм).
3. Для обезвоживания хром покрытием подложки, промыть в изопропанола и затем выпекать на горячей плите в течение 5 минут при температуре 115 ° C.
4. Сухие субстраты и премьер с гексаметилдисилазана (HMDS) спин-покрытие (30 с, 3000 оборотов в минуту). Спин-пальто снова (используя одинаковые параметры) с Шипли S1811 фоторезиста.
5. Предварительно испечь подложки, на горячую плиту (100 ° C, 2 мин), то картина фоторезиста под воздействием ультрафиолетового (УФ) облучение в течение 5 с через фотошаблон.
6. Разработка УФ-воздействию субстратов в Шипли MF 321 разработчиков в течение 3 минут и промыть в воде DI. После выпекать на горячей пластине при 100 ° С в течение 1 мин.
7. Etch подвергается хрома путем погружения в хроме травителя в течение 30 сек Промойте в воде Д.И., затем погрузите в AZ300T стриптизершу в течение 10 минут, чтобы удалить оставшиеся фоторезиста. Промойте в воде DI и сухой с N ₂ газа.
8. Депозит 2-5 мкм Parylene-C (изоляционные полимера) путем химического осаждения из паровой фазы на подложку подшипников узорной хрома. Депозит 50 нм из тефлона-AF (чтобы сделать поверхность гидрофобной) спин-покрытие раствором (1% вес / вес в Fluorinert FC-40) при 2000 оборотов в минуту в течение 60 сек После выпекать на горячей пластине (160 ° C, 10 мин).
9. Для формирования верхней пластине, флаг ООН узором оксида индия и олова (ITO) стеклянные подложки 50 нм тефлон-AF, как указано выше.
10. После выпекать как субстратов на горячую плиту (160 ° C, 10 мин).

Часть 2: устройства Настройка и автоматизация

1. В цифровом микрожидкостных устройств работает в "двухдисковое" конфигурации, ¹ капли, расположенный между нижней подложке (с узорной электродов) и верхней подложки (с одним непрерывным, прозрачный электрод, как правило, формируются из ITO).
2. Для настройки устройства, достаньте полимерных покрытий с контактным площадкам нижней подложки нежной выскабливание с помощью скальпеля. Пара подвергается подушечки нижней подложке с 40-контактными разъемами (рис. 1а).
3. На включение питания компьютера под управлением LabVIEW (National Instruments, Остин, Техас), самодельный блок управления (с участием массив высоковольтных реле, которые управляются сигналами от National Instruments DaqPad), функциональный генератор и усилитель . Компьютер / пульт управления облегчает пользователю контроль над применением 100 В _RMS / 18 кГц сигналы на устройства через 40-контактный разъемы.
4. Соберите устройство позиционирования две части двусторонней ленты (140 мкм общей толщины) по краям нижней подложки и в комплекте с unpatterned слайды ITO (верхняя пластина).
5. Для инициализации системы управления, запустите программу LabView калибровки (написана в-дом) для калибровки с обратной связью.
6. Нагрузка образца и реагентов в соответствующих водохранилищ (см. раздел 3 ниже) и вложите их под верхней подложки (с тефлоновым покрытием лицевой стороной вниз). Прикрепить заземления к верхней поверхности.
7. Нагрузка срабатывания кода в LabView (написана в доме) и запустите программу инициировать срабатывание капли.

Часть 3: Примеры и подготовке реагентов

1. Подготовить рабочий буфер (ВБ): 100 мм TrisHCl (рН 7,8) и 0,08% Pluronic F127 мас. /
2. Растворите белка (ы) должны быть проанализированы в образце ВБ и пипеткой в ​​емкость 1 (R-1) на устройстве, как показано на рисунке 1b.
3. Подготовка осадителя, 20% трихлоруксусной кислоты (ТСА) в воде Д.И., и пипетки в R-2.
4. Подготовка промывочного буфера, 70/30 хлороформ / ацетонитрил (ACN) и пипетки в R-4.
5. Подготовка resolubilizing буфера, 100 мМ бикарбоната аммония (рН 8,0) и 0,08% Pluronic F127 м / о, и пипетки в Р-5.
6. Растворите восстановителя, трис (2-карбоксиэтил) фосфин (TCEP), в 10 мМ в ВБ и пипетки в R-6.
7. Растворите алкилирующих агентов, iodoacetamide (IAM), в 12 мМ в ВБ и пипетки в Р-7.
8. Растворите трипсина в ВБ в концентрации, равной ТО1 / 5 от концентрации белка общей выборки (см. 3.1, выше) и пипетки в R-8.

Часть 4: Цифровая обработка Пример микрожидкостных

1. Следующая процедура осуществляется автоматически с помощью кода LabView написаны на дом. Объем капель обойтись из водохранилищ определяется размерами электродов (в данном случае обойтись капли ~ 600nL).
2. Внесите капель белково-содержащих образец из Р-1 и капли осадителя из Р-2 (рис. 2, Рамка 1). Слияние двух капель и позволяет комбинированный капли для инкубации в течение 5 мин, в результате осаждения пр.oteins на поверхность (рис. 2, Рамки 2-3). Нажать супернатант от осажденного белка отходов водохранилище, R-3 (рис. 2, Рамка 4).
3. Внесите три капли буфера для промывки от R-4 и вести их через осажденного белка отходов водохранилище, R-3 (рис. 2, Frame 5).
4. Разрешить осадок, чтобы высохнуть, и обойтись без капли resolubilizing буфер из Р-5 с белком. Разрешить буфера для инкубации в течение 20 мин, пока осадок не растворится (рис. 2, Frame 6).
5. Внесите капли восстановителя от R-6 и объединить его с образцом капли. Смешайте комбинированные капли к сварке это на 6 электродов в круговой схеме. Разрешить капли для инкубации в течение 1 часа при комнатной температуре во влажной камере (рис. 3, Кадры 1-2).
6. Внесите капли алкилирующих агентов с Р-7 и объединить его с образцом капли, после смешивания (как в 4.5). Разрешить капли для инкубации в течение 15 мин при комнатной температуре во влажной камере, защищенном от света (рис. 3, Кадры 2-3).
7. Внесите капли трипсина из R-8, и объединить его с образцом капли, а затем путем смешивания (как в 4.5). Разрешить капли для инкубации в течение 3 часов при 37 ° С во влажной камере на горячей плите (рис. 3, Кадры 3-4).

Часть 5: Пост-обработка Подготовка образцов

1. Снимите верхнюю подложку и реакции утолить пищеварения, добавляя 0,6 мл 2,5% трифторуксусной кислоты в воде.
2. Purify закаленных продуктов реакции с помощью С18 ZipTips (Millipore, Billerica, MA) в соответствии с инструкциями производителя.
3. Развести очищенного образца в воде DI для конечного объема 100 мл.

Часть 6: Масс-спектрометрия

1. Оценка обработку образца на нано-ВЭЖХ повязана с масс-спектрометра тандеме. Система ВЭЖХ используется здесь составляет от Eksigent технологий и оснащен ловушку столбце (3 мм. C18 бусы, 150 мкм ID х 2,5 см) и обращенно-фазового разделения столбце (3 мкм диаметром. C18 бусы, 75 мкм х ID 15 см). Масс-спектрометр, используемая здесь LTQ от Thermo Fisher Scientific-.
2. Нагрузка 2 мкл образца на колонку в ловушку 5μL/min в мобильной фазой, содержащей 5% ацетонитрила в воде. Отдельные пробы на обращенной фазой колонки при использовании 0.5μL/min линейный градиент от 20% ацетонитрила до 80% ацетонитрила в течение 25 мин. Продолжить работу на 80% ацетонитрила в течение еще 10 мин.
3. Анализ полосы элюирования из колонки по масс-спектрометрии тандеме. В работе сообщается здесь, элюент пробы в масс-спектрометр через nanoelectrospray излучатель (20 мкм ID конические до 10 мкм ID) из NewObjective.
4. Определение белка в образце с помощью программы поиска в базах данных, таких как SEQUEST. В этой работе мы использовали версию SEQUEST включены в Bioworks v3.01 (Thermo Fisher Scientific-), и определили белки были вероятности оценки менее 1,0 E-03 (эквивалентно 99,9% доверительного интервала), а последовательность покрытий на не менее 30% (рис. 4).

Рисунок 1. () Картина устройством DMF паре с 40-контактными разъемами для автоматического срабатывания капли. (Б) схема устройства изображением позиционирования образца и реагентов, необходимых для протеомных проработки.

Рисунок 2. Кадры из фильма изображением автоматизированного извлечения и очистки БСА в 20% ТСА (осадок) и 70/30% хлороформ / ацетонитрил (полоскание раствором). В рамках 6, осажденный белок снова растворяют в капле 100 мМ бикарбоната аммония.

Рисунок 3. Кадры из фильма иллюстрирующие последовательное снижение, алкилирования, и переваривания капли resolubilized белка. На этом рисунке реагентов окрашиваются красителями для ясности, на практике, реагенты не окрашиваются.

Рисунок 4. MS хроматограмме образца бычьего сывороточного альбумина обрабатывается цифровым микрофлюидики. 25 различных пептидов были определены (99,9% доверительный интервал), соответствующая последовательность охват 44%.

Discussion

Отсутствие стандартизированных обработки образцов и обработки в протеомики является основным ограничением для поля. Кроме того, обычные макромасштабе обработки образцов включает в себя несколько контейнеров и решение переводы, которые могут привести к потере образца и загрязнения. Потенциальное решение этих проблем является формирование интегрированных систем для обработки образцов, опираясь на цифровые микрофлюидики ¹ (DMF). В предыдущей работе, DMF было показано, что полезно для эффективного удаления нежелательных загрязняющих веществ в гетерогенных белковых растворов. ² Аналогично, DMF было показано, чтобы быть совместимым с интеграцией многоступенчатого решение фазы обработки (сокращения, алкилирования и пищеварение) на комплексном устройства. ³ Здесь мы продемонстрировали полностью интегрированную систему с автоматическим контролем капли для белка добычи осадков затем решение фазы обработки. Мы предполагаем, что, если такие методы, как это широко принято, человеческой ошибки присущи протеомных обработка образца может быть в значительной степени устранены, в результате анализа с лучшей воспроизводимости. Короче говоря, мы полагаем, что DMF имеет потенциал для полезна для широких слоев приложений, так как условия могут быть точно повторяются в любой лаборатории в мире.