Digitale Microfluidics voor Geautomatiseerde Proteoom verwerking

Summary

Digitale Microfluidics is een techniek die gekenmerkt wordt door de manipulatie van discrete druppels (~ nL - ml) op een reeks van elektroden door de toepassing van elektrische velden. Het is goed geschikt voor het uitvoeren van een snelle, sequentiële, geminiaturiseerde geautomatiseerde biochemische assays. Hier melden wij een platform in staat is het automatiseren van een aantal proteoomanalyse processtappen.

Abstract

Klinische proteomics heeft zich ontpopt als een belangrijke nieuwe discipline, veelbelovende de ontdekking van biomarkers die nuttig zullen zijn voor een vroege diagnose en prognose van de ziekte. Hoewel uit klinische proteomics methoden variëren sterk, een gemeenschappelijk kenmerk is de behoefte aan (i) de extractie van proteïnen van zeer heterogene vloeistoffen (dwz serum, volbloed, etc.) en (ii) een uitgebreide biochemische processen voorafgaand aan de analyse. Hier melden wij een nieuwe digitale microfluidics (DMF) methode op basis van het integreren van verschillende processtappen gebruikt in de klinische proteomics. Dit omvat eiwitextractie, resolubilization, reductie, alkylering en enzymatische spijsvertering. Digitale microfluidics is een microschaal industriële slangen techniek waarbij nanoliter-microliter grote druppels worden gemanipuleerd op een open oppervlak. Druppels worden geplaatst op de top van een reeks van elektroden die zijn bekleed met een diëlektrische laag - wanneer een elektrische potentiaal wordt toegepast op de druppel, lasten zich ophopen aan weerszijden van het diëlektricum. De kosten dienen als elektrostatische handles die kunnen worden gebruikt om de druppel positie controle, en door vertekenende een opeenvolging van elektroden in serie, druppels kan worden gemaakt af te zien, verplaatsen, samenvoegen, mengen, en split aan de oppervlakte. Daarom, DMF is een natuurlijke pasvorm voor het vervoer van een snelle, sequentiële, multistep, geminiaturiseerde geautomatiseerde biochemische assays. Dit vertegenwoordigt een belangrijke stap vooruit ten opzichte van conventionele methodes (vertrouwen op handmatige pipetteren of robots), en heeft het potentieel om een ​​nuttig nieuw instrument in de klinische proteomics worden.

Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk, en Steve CC Shih droegen ook voor dit werk.

Huidige adres Sergio LS Freire is aan de Universiteit van de Sciences in Philadelphia bevindt zich op 600 South 43e Street, Philadelphia, PA 19104.

Protocol

Deel 1: Apparaat Fabrication

1. Schoon glas substraten in Piranha-oplossing (3:1 conc zwavelzuur:. 30% waterstofperoxide). Laat de substraten in Piranha-oplossing gedurende 10 min met frequente agitatie.
2. Na het afspoelen in gedeïoniseerd (DI) water en het drogen van de substraten met N ₂ gas, plaats de substraten in de elektronenbundel kamer voor chroom depositie (dikte van 250 nm).
3. Om uitdrogen van de chroom-gecoate substraat, spoelen in isopropanol en dan bakken op een hete plaat gedurende 5 minuten op 115 ° C.
4. Droog de substraten en prime met hexamethyldisilazaan (HMDS) door spin-coating (30 s, 3000 rpm). Spin-coat opnieuw (met dezelfde parameters) met Shipley S1811 fotolak.
5. Pre-bakken de ondergrond op een hete-plaat (100 ° C, 2 min), dan is patroon van de fotolak door blootstelling aan ultraviolet (UV) straling gedurende 5 s via een fotomasker.
6. De ontwikkeling van de UV-blootstelling substraten in Shipley MF 321 developer voor 3 minuten en was in DI water. Post-bakken op een hete-plaat bij 100 ° C gedurende 1 minuut.
7. Etch de blootgestelde chroom door onderdompeling in chroom etsmiddel voor 30 s. Spoel in DI water, vervolgens onder te dompelen in AZ300T stripper gedurende 10 min om de resterende fotolak te verwijderen. Spoel in DI water en droog met N ₂ gas.
8. Borg 2-5 um parylene-C (een isolerende polymeer) door chemical vapour deposition op een substraat met patroon chroom. Borg 50 nm van Teflon-AF (om het oppervlak hydrofoob te maken) door spin-coating een oplossing (1% gew / gew in Fluorinert FC-40) bij 2000 rpm voor 60 s. Post-bakken op een hete-plaat (160 ° C, 10 min).
9. Naar vormen de bovenplaat, jas een niet-patroon indium tin oxide (ITO) glas substraten 50 nm Teflon-AF, zoals hierboven.
10. Post-bakken beide substraten op een hete-plaat (160 ° C, 10 min).

Deel 2: Apparaat Set-up en Automatisering

1. In digitale microfluïdische apparaten gebruikt in "twee-plate"-configuratie, zijn ^een druppeltjes gepositioneerd tussen een bodem substraat (met gedessineerde elektroden) en een top substraat (met een aaneengesloten, transparante elektrode, meestal gevormd uit ITO).
2. Voor het instellen van het apparaat omhoog, verwijder polymeer coatings van de contactpunten van een bodem substraat door voorzichtig te schrapen met een scalpel. Koppel de blootgestelde pads van de bodem substraat met 40-pins connectors (figuur 1a).
3. Power-over een computer met LabView (National Instruments, Austin, TX), een zelfgebouwde control box (die een serie van high-voltage relais die worden bestuurd door signalen van een National Instruments DaqPad), een functie generator en een versterker . De computer / regelkast faciliteert de gebruiker controle over de toepassing van de 100 V _RMS / 18 kHz signalen naar het apparaat via de 40-pins aansluitingen.
4. Monteer het apparaat door het plaatsen van twee stukjes dubbelzijdig tape (140 um totale dikte) op de randen van de onderste substraat en compleet met unpatterned ITO slides (topplaat).
5. Te initialiseren het besturingssysteem, voert u het LabView calibratie-programma (geschreven in-house) aan de terugkoppeling te kalibreren.
6. Belasting van het monster en de reagentia in de juiste reservoirs (zie hoofdstuk 3, hieronder) en omsluiten ze onder de bovenste substraat (Teflon-coating zijde naar beneden). Bevestig de grond-aansluiting naar de top substraat.
7. Laad de bediening code in LabView (geschreven in-house) en voer het programma druppel bediening te starten.

Deel 3: Steekproef en Bereiding van het reagens

1. Bereid te werken buffer (WB): 100 mm TrisHCl (pH 7,8) en 0,08% Pluronic F127 w / v.
2. Los eiwit (s) worden geanalyseerd in WB en pipet monster af in een reservoir (R-1) op het apparaat, zoals weergegeven in Figuur 1b.
3. Bereid neerslag, 20% trichloorazijnzuur (TCA) in DI-water, en pipet in de R-2.
4. Bereid wasbuffer, 70/30 Chloroform / acetonitril (ACN) en pipet in de R-4.
5. Bereid resolubilizing buffer, 100 mM ammoniumbicarbonaat (pH 8,0) en 0,08% Pluronic F127 w / v, en pipet in de R-5.
6. Los reductant, tris (2-carboxyethyl) fosfine (TCEP), op 10 mM in WB en pipet in de R-6.
7. Los alkyleringsmiddel, joodacetamide (IAM), op 12 mm in WB en pipet in de R-7.
8. Los trypsine in WB in een concentratie gelijk tot1 / 5 van de concentratie van het totale eiwit steekproef (zie 3.1, hierboven) en pipet in de R-8.

Deel 4: Digital Microfluïdische Sample Processing

1. De volgende procedure wordt automatisch uitgevoerd door middel van LabView code geschreven in huis. Het volume van de druppels vrijgesteld van reservoirs wordt bepaald door de afmetingen van de elektroden (in dit geval, afgezien druppels zijn ~ 600nL).
2. Doseer een druppel van eiwit-bevattende monster uit R-1 en een druppel neerslag van R-2 (Figuur 2, Frame 1). Samenvoegen van de twee druppels en laat de gecombineerde druppel te incuberen gedurende 5 minuten, wat resulteert in het neerslaan van proteins op het oppervlak (figuur 2, Frames 2-3). Bedien het supernatans weg van de neergeslagen eiwit om het afval reservoir, R-3 (figuur 2, Frame 4).
3. Doseer drie druppels wasbuffer van R-4 en rijden ze over de neergeslagen eiwit aan het afval reservoir, R-3 (figuur 2, Frame 5).
4. Laat het neerslag te drogen, en afzien van een druppel van resolubilizing buffer van R-5 aan het eiwit. Laat de buffer te incubeer gedurende 20 minuten totdat een neerslag is opgelost (zie figuur 2, Frame 6).
5. Doseer een druppel reductiemiddel van R-6 en samenvoegen met het monster druppel. Meng de gecombineerde druppel door het bedienen van het over zes elektroden in een cirkelvormig patroon. Laat de druppel om gedurende 1 uur bij kamertemperatuur incuberen in een vochtige kamer (Figuur 3, Frames 1-2).
6. Doseer een druppel van alkylerende middel van R-7 en samenvoegen met het monster druppel, gevolgd door het mengen (zoals in 4.5). Laat de druppel om te incuberen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in een vochtige kamer, beschermd tegen licht (figuur 3, Frames 2-3).
7. Doseer een druppel van trypsine van R-8, en deze samenvoegen met het monster druppel, gevolgd door het mengen (zoals in 4.5). Laat de druppel om voor 3 uur incuberen bij 37 ° C in een bevochtigde kamer op een hete plaat (Figuur 3, Frames 3-4).

Deel 5: Post-Processing Monstervoorbereiding

1. Verwijder de top ondergrond en lessen spijsvertering reactie door het toevoegen van 0,6 ml van 2,5% trifluorazijnzuur in water.
2. Zuiver uitgeblust reactie product met behulp van C18 ZipTips (Millipore, Billerica, MA) volgens de instructies van de fabrikant.
3. Verdunnen gezuiverd monster in DI-water tot een eindvolume van 100 ml.

Deel 6: massaspectrometrie

1. Evalueren van de verwerkte monster op een nano-HPLC gekoppeld aan een tandem massaspectrometer. Het HPLC-systeem dat gebruikt wordt is hier uit Eksigent Technologies en is uitgerust met een trap kolom (3 mm dia. C18 kralen, 150 um ID x 2,5 cm) en een reversed-fasescheiding kolom (3 um dia. C18 kralen, 75 um ID x 15 cm). De massaspectrometer die hier gebruikt is een LTQ van Thermo Fisher Scientific-.
2. Laad een 2 pl monster op de trap kolom op 5μL/min in een mobiele fase bestaande uit 5% acetonitril in water. Scheid de monster op de reversed-phase kolom op 0.5μL/min met behulp van een lineaire gradiënt van 20% acetonitril tot 80% acetonitril meer dan 25 minuten. Blijven werken op 80% acetonitril voor nog eens 10 minuten.
3. Analyseer de bands elueren uit de kolom door tandem massaspectrometrie. In het werk hier gerapporteerd, is het eluent bemonsterd in de massa-spectrometer via een nanoelectrospray emitter (20 urn ID taps tot 10 urn ID) van NewObjective.
4. Identificeer de eiwitten in het monster met behulp van een database programma zoals Sequest. In dit werk, gebruikten we de versie van Sequest opgenomen in BioWorks v3.01 (Thermo-Fisher Scientific) en geïdentificeerde eiwitten hadden kans scores van minder dan 1,0 E-03 (gelijk aan 99,9%-betrouwbaarheidsinterval), en de volgorde dekkingen van ten minste 30% (figuur 4).

Figuur 1. (A) Een foto een DMF-apparaat gekoppeld aan 40-pins connectoren voor geautomatiseerde druppel bediening. (B) Een schema van een apparaat beeltenis van de positionering van het monster en reagentia die nodig zijn voor een proteomics workup.

Figuur 2. Frames uit een film beeltenis van de automatische extractie en zuivering van de BSA in 20% TCA (neerslag) en 70/30% chloroform / acetonitril (spoelen oplossing). In frame 6, wordt de neergeslagen eiwit opnieuw opgelost in een druppel van 100 mM ammoniumbicarbonaat.

Figuur 3. Frames uit een film illustreert sequentiële reductie, alkylering, en de spijsvertering van een druppel resolubilized eiwit. In deze figuur zijn de reagentia gekleurd met kleurstoffen voor de duidelijkheid, in de praktijk, de reagentia zijn niet gekleurd.

Figuur 4. MS chromatogram van een steekproef van runderserumalbumine verwerkt door digitale microfluidics. 25 verschillende peptiden werden geïdentificeerd (99,9% betrouwbaarheidsinterval) met betrekking tot een reeks dekking van 44%.

Discussion

Het ontbreken van gestandaardiseerde monsters behandeling en verwerking in proteomics is een grote beperking voor het veld. Daarnaast, conventionele macroschaal behandelen van het monster bestaat uit meerdere containers en oplossing transfers, wat kan leiden tot verlies en vervuiling monster. Een mogelijke oplossing voor deze problemen is om geïntegreerde systemen vormen voor het monster verwerking vertrouwen op digitale microfluidics ¹ (DMF). In eerdere werk, werd DMF aangetoond dat nuttig zijn voor het efficiënt verwijderen van ongewenste contaminanten in heterogene eiwit-bevattende oplossingen. ² Op dezelfde manier werd DMF aangetoond dat compatibel is met de integratie van meerstaps oplossing fase verwerking (reductie, alkylering en de spijsvertering) worden op een geïntegreerde het apparaat. ³ Hier hebben we aangetoond een volledig geïntegreerd systeem met automatische controle voor droplet eiwitextractie door precipitatie, gevolgd door oplossing-fase verwerking. We speculeren dat als methoden, zoals deze zijn ingang vindt, de menselijke fouten die inherent zijn aan de verwerking van proteomics monster kan grotendeels worden geëlimineerd, wat resulteert in analyses met een betere reproduceerbaarheid. In het kort stellen wij voor dat DMF het potentieel voor die nuttig zijn voor een brede dwarsdoorsnede van toepassingen heeft, zoals de voorwaarden nauwkeurig kan worden gedupliceerd in een laboratorium in de wereld.