Microfluidique numérique pour le traitement automatisé protéomiques

Summary

Microfluidique digitale est une technique caractérisée par la manipulation de gouttelettes discrètes (~ nL - ml) sur un réseau d'électrodes par l'application de champs électriques. Il est bien adapté pour la réalisation rapide, séquentielle, miniaturisé automatisé des dosages biochimiques. Ici, nous rapportons une plate-forme capable d'automatiser plusieurs étapes de traitement protéomique.

Abstract

Protéomique clinique est apparue comme une discipline importante nouvelle, promettant la découverte de biomarqueurs qui seront utiles pour le diagnostic précoce et le pronostic de la maladie. Bien cliniques méthodes protéomiques varient largement, une caractéristique commune est le besoin de (i) l'extraction de protéines à partir de liquides extrêmement hétérogènes (c'est à dire le sérum, le sang total, etc) et (ii) un traitement complet avant l'analyse biochimique. Ici, nous rapportons une nouvelle microfluidique digitale (DMF) méthode fondée intégrant plusieurs étapes de traitement utilisées en protéomique clinique. Cela inclut l'extraction des protéines, resolubilisation, la réduction, l'alkylation et la digestion enzymatique. Numérique microfluidique est un micro dynamique des fluides technique dans laquelle des gouttelettes d'nanolitre-microlitre entreprises sont manipulés sur une surface ouverte. Les gouttelettes sont positionnées sur le dessus d'un réseau d'électrodes qui sont recouverts par une couche diélectrique - quand un potentiel électrique est appliqué à la goutte, des charges s'accumulent sur chaque côté du diélectrique. Les charges électrostatiques servent de poignées qui peuvent être utilisés pour contrôler la position des gouttelettes, et par une séquence de polarisation des électrodes en série, des gouttelettes peut être fait pour passer, déplacer, fusionner, mélanger et diviser sur la surface. Par conséquent, le DMF est un choix naturel pour le transport rapide, séquentielle, en plusieurs étapes, miniaturisé automatisé des dosages biochimiques. Cela représente une avancée significative par rapport aux méthodes conventionnelles (en s'appuyant sur pipetage manuel ou des robots), et a le potentiel pour être un outil utile dans la nouvelle protéomique clinique.

Maïs J. Djebrail, Vivienne N. Luk, et Steve CC Shih contribué également à ce travail.

Adresse actuelle Sergio LS Freire est à l'Université des Sciences de Philadelphie situé au 600, rue du Sud 43ème, Philadelphie, PA 19104.

Protocol

Partie 1: fabrication de dispositifs

1. Substrats de verre dans une solution de nettoyage Piranha (3:1 d'acide sulfurique concentré:. Peroxyde d'hydrogène à 30%). Laissez les substrats en solution Piranha pendant 10 min en agitant fréquemment.
2. Après un rinçage à l'eau désionisée (DI) de l'eau et le séchage des substrats avec gaz N _2, place les substrats dans la chambre de faisceau d'électrons pour le dépôt de chrome (épaisseur de 250 nm).
3. Pour déshydrater les substrat chromées, rincer dans de l'isopropanol et ensuite cuire au four sur une plaque chauffante pendant 5 min à 115 ° C.
4. Sécher les substrats et premier avec hexaméthyldisilazane (HMDS) par spin-coating (30 s, 3000 tpm). Spin-coat à nouveau (en utilisant des paramètres identiques) avec Shipley S1811 résine photosensible.
5. Pré-cuire le substrat sur une plaque chaude (100 ° C, 2 min), puis modèle de la résine photosensible par exposition aux rayons ultraviolets (UV) pendant 5 s à travers un photomasque.
6. Développer les substrats UV exposés à Shipley MF 321 développeur pendant 3 min et laver à l'eau DI. Post-Cuire sur une plaque chaude à 100 ° C pendant 1 min.
7. Etch le chrome exposés en l'immergeant dans le chrome gravure de 30 s. Rincer à l'eau DI, puis plonger dans décapant AZ300T pendant 10 min pour enlever la résine photosensible restante. Rincer à l'eau DI et sécher avec un gaz N _2.
8. Dépôt 2-5 um parylène-C (une polymère isolant) par dépôt de vapeur chimique sur un substrat portant motifs de chrome. Dépôt de 50 nm de Téflon AF (pour faire la surface hydrophobe) par spin-coating d'une solution (1% en poids / poids dans Fluorinert FC-40) à 2000 rpm pendant 60 s. Post-Cuire sur une plaque chaude (160 ° C, 10 min).
9. Pour former la plaque supérieure, le manteau une. ONU-motifs d'oxyde d'étain-indium (ITO) substrats de verre de 50 nm de Téflon AF, comme ci-dessus
10. Post-cuire deux substrats sur une plaque chaude (160 ° C, 10 min).

Partie 2: Device Set-up et de l'automatisation

1. En numériques dispositifs microfluidiques exploités dans les "deux-assiette" de configuration, ^une gouttelettes sont positionnés entre un substrat de fond (avec des électrodes à motifs) et un substrat supérieur (avec une contigus, électrode transparente, généralement formé à partir d'ITO).
2. Pour configurer l'appareil en place, enlever les revêtements de polymère de plots de contact d'un substrat de fond en grattant doucement avec un scalpel. Couple de l'exposé des plots du substrat de fond avec 40 broches (figure 1a).
3. Power-sur un ordinateur exécutant LabView (National Instruments, Austin, TX), une maison construite boîte de commande (avec un tableau de haute tension relais qui sont commandés par des signaux à partir d'un DAQPad National Instruments), un générateur de fonctions, et d'un amplificateur . La boîte de l'ordinateur / contrôle facilite le contrôle des utilisateurs sur l'application de 100 V _RMS / 18 kHz signaux à l'appareil via les connecteurs à 40 broches.
4. Monter l'appareil en positionnant deux morceaux de ruban adhésif double face (140 um d'épaisseur au total) sur les bords du substrat en bas et terminer avec des diapositives sans motif ITO (plaque supérieure).
5. Pour initialiser le système de contrôle, exécutez le programme d'étalonnage LabView (écrit en interne) pour calibrer l'asservissement.
6. Charger l'échantillon et des réactifs dans les réservoirs appropriés (voir section 3, ci-dessous) et les enfermer sous le substrat supérieur (téflon tournée vers le bas). Fixez le connecteur de terre au substrat haut.
7. Chargez le code actionnement de LabView (écrit en interne) et exécuter le programme d'initier actionnement des gouttelettes.

Partie 3: Préparation des échantillons et de réactifs

1. Préparer tampon de travail (BM): 100 mm TrisHCl (pH 7,8) et de 0,08% Pluronic F127 w / c.
2. Dissoudre la protéine (s) à analyser dans l'échantillon de la BM et la pipette dans le réservoir 1 (R-1) sur l'appareil, comme le montre la figure 1b.
3. Préparer précipitant, 20% d'acide trichloracétique (TCA) dans de l'eau DI, et la pipette dans la R-2.
4. Préparer le tampon de lavage, 70/30 chloroforme / acétonitrile (ACN) et pipette dans R-4.
5. Préparer un tampon resolubilizing, 100 mM bicarbonate d'ammonium (pH 8,0) et 0,08% Pluronic F127 p / v, et la pipette dans la R-5.
6. Dissoudre réducteur, tris (2-carboxyéthyl) phosphine (PTCE), à 10 mM dans la BM et la pipette dans la R-6.
7. Dissoudre agent d'alkylation, iodoacétamide (IAM), à 12 mM dans la BM et la pipette dans la R-7.
8. Dissoudre la trypsine dans la BM à une concentration égale à 1 / 5 de la concentration de l'échantillon de protéines totales (voir 3.1, ci-dessus) et une pipette en R-8.

Partie 4: Exemple de traitement numérique microfluidiques

1. La procédure suivante est automatiquement mis en oeuvre par le biais du code LabVIEW écrite en interne. Le volume des gouttelettes dispensé de réservoirs est défini par les dimensions des électrodes (dans ce cas, les gouttelettes sont dispensés ~ 600nL).
2. Verser une goutte de protéine contenant de l'échantillon de la R-1 et une goutte de précipitant de R-2 (figure 2, l'image 1). Fusionner les deux gouttelettes et de permettre la gouttelette combinée à incuber pendant 5 min, ce qui entraîne la précipitation de la proteins sur la surface (figure 2, Cadres 2-3). Actionner le surnageant loin de la protéine précipitée dans le réservoir de déchets, R-3 (figure 2, Frame 4).
3. Distribuer trois gouttes de tampon de lavage de la R-4 et les conduire à travers la protéine précipitée dans le réservoir de déchets, R-3 (figure 2, Frame 5).
4. Laisser le précipité à sécher, et dispenser une goutte de tampon resolubilizing de R-5 à la protéine. Laisser le tampon à incuber pendant 20 min jusqu'à ce que le précipité soit dissous (figure 2, cadre 6).
5. Verser une goutte d'un réducteur de la R-6 et la fusionner avec la goutte d'échantillon. Mélanger la gouttelette combinée par l'actionner à travers 6 électrodes dans un modèle circulaire. Autoriser la gouttelette à incuber pendant 1 h à température ambiante dans une chambre humidifiée (Figure 3, Cadres 1-2).
6. Verser une goutte d'agent d'alkylation de la R-7 et la fusionner avec la goutte de l'échantillon, suivie d'un mélange (comme dans 4.5). Autoriser la gouttelette à incuber pendant 15 min à température ambiante dans une chambre humidifiée, protégé de la lumière (figure 3, Cadres 2-3).
7. Verser une goutte de trypsine de la R-8, et la fusionner avec la goutte de l'échantillon, suivie d'un mélange (comme dans 4.5). Autoriser la gouttelette à incuber pendant 3 h à 37 ° C dans une chambre humidifiée sur une plaque chauffante (figure 3, Cadres 3-4).

Partie 5: Préparation des échantillons post-traitement

1. Enlever le substrat supérieur et de la réaction de digestion en ajoutant 0,6 étancher ml d'acide trifluoroacétique 2,5% dans l'eau.
2. Purifier produit de la réaction en utilisant trempé ZipTips C18 (Millipore, Billerica, MA) selon les instructions du fabricant.
3. Diluer l'échantillon dans de l'eau purifiée DI pour un volume final de 100 ml.

Partie 6: Spectrométrie de Masse

1. Évaluer l'échantillon traité sur une nano-HPLC couplé à un spectromètre de masse en tandem. Le système HPLC utilisé ici est de Technologies Eksigent et est équipé d'une colonne piège (3 mm de diamètre. Perles C18, 150 ID um x 2,5 cm) et une colonne de séparation en phase inverse (3 dia um. Perles C18, 75 um x ID 15 cm). Le spectromètre de masse utilisé ici est un LTQ de Thermo Fisher Scientific-.
2. Charger un échantillon de 2 uL sur la colonne piège à 5μL/min dans une phase mobile comprenant 5% d'acétonitrile dans l'eau. Séparer l'échantillon sur la colonne de phase inverse à 0.5μL/min utilisant un gradient linéaire de 20% d'acétonitrile à 80% d'acétonitrile en 25 min. Continuer l'exécution à 80% d'acétonitrile pendant 10 minutes supplémentaires.
3. Analyser les bandes élution de la colonne par spectrométrie de masse en tandem. Dans le travail présenté ici, l'éluant est échantillonné dans le spectromètre de masse via un émetteur nanoélectrospray (20 um ID conique à 10 um ID) de NewObjective.
4. Identifier les protéines de l'échantillon en utilisant un programme de recherche de bases de données telles que SEQUEST. Dans ce travail, nous avons utilisé la version de SEQUEST incorporés dans Bioworks v3.01 (Thermo-Fisher Scientific), et les protéines identifiées ont obtenu des scores probabilité inférieure à 1.0E-03 (équivalent à 99,9% intervalle de confiance), et les couvertures séquence d'au au moins 30% (figure 4).

Figure 1. (A) Une image un dispositif DMF accouplés à 40 broches pour l'actionnement de gouttelettes automatisés. (B) Un schéma d'un dispositif illustrant le positionnement de l'échantillon et les réactifs nécessaires pour un bilan de protéomique.

Cadres Figure 2. Partir d'un film illustrant l'extraction et la purification automatisée de BSA dans 20% de TCA (précipitant) et d'acétonitrile 70/30% de chloroforme / (solution de rinçage). Dans cadre 6, la protéine précipitée est redissous dans une gouttelette de 100 mM de bicarbonate d'ammonium.

Figure 3. Images d'un film illustrant la réduction séquentielle, l'alkylation, et la digestion d'une gouttelette de protéine resolubilisé. Dans cette figure, les réactifs sont colorés avec des teintures pour plus de clarté, dans la pratique, les réactifs ne sont pas colorées.

Figure 4. Chromatogramme MS d'un échantillon de sérum albumine bovine traitée par microfluidique digitale. 25 peptides distincts ont été identifiés (99,9% intervalle de confiance) correspondant une couverture séquence de 44%.

Discussion

Le manque de manipulation des échantillons et le traitement standardisé de la protéomique est une limitation majeure pour le champ. De plus, la manipulation des échantillons conventionnels macroscopique implique plusieurs conteneurs et les transferts de solution, qui peut conduire à des pertes et la contamination de l'échantillon. Une solution potentielle à ces problèmes est de former des systèmes intégrés pour le traitement des échantillons en s'appuyant sur ^​​une microfluidique digitale (DMF). Dans des travaux antérieurs, le DMF a été montré pour être utile à l'élimination efficace des contaminants indésirables dans hétérogènes contenant des protéines de solutions. ² De même, le DMF a été montré pour être compatible avec l'intégration de plusieurs étapes phase solution de traitement (réduction, l'alkylation et la digestion) sur une approche intégrée appareil. ³ Ici, nous avons démontré un système entièrement intégré avec le contrôle automatisé des gouttelettes d'extraction de protéines par précipitation suivie par la solution de la phase de traitement. Nous pensons que si des méthodes comme celles-ci sont largement adoptées, l'erreur humaine inhérents au traitement de l'échantillon protéomique peut être largement éliminé, résultant en des analyses avec une meilleure reproductibilité. En bref, nous proposons que le DMF a le potentiel pour être utile pour un large éventail d'applications, comme les conditions peuvent être précisément reproduite dans n'importe quel laboratoire dans le monde.