Digitale Mikrofluidik für die automatisierte Verarbeitung Proteomic

Summary

Digitale Mikrofluidik ist eine Technik, durch die Manipulation von diskreten Tröpfchen (~ nL - mL) charakterisiert auf eine Reihe von Elektroden, die durch die Anwendung von elektrischen Feldern. Es ist für die Durchführung schnelle, sequentielle, miniaturisierte automatische biochemische Assays gut geeignet. Hier berichten wir über eine Plattform, die die Automatisierung von mehreren Proteom Verarbeitungsschritte.

Abstract

Klinische Proteomics ist eine wichtige neue Disziplin entstanden, viel versprechende Entdeckung von Biomarkern, die nützlich für die frühe Diagnose und Prognose von Krankheiten wird. Während in der klinischen Proteomik Methoden sehr unterschiedlich sind, ist ein gemeinsames Merkmal der Notwendigkeit (i) Extraktion von Proteinen aus äußerst heterogenen Flüssigkeiten (zB Serum, Vollblut, etc.) und (ii) umfassende biochemische Verarbeitung vor der Analyse. Hier berichten wir über eine neue digitale Mikrofluidik (DMF) basierende Methode der Integration mehrerer Prozessschritte in der klinischen Proteomik eingesetzt. Dazu gehören Proteinextraktion, Resolubilisierung, Reduktion, Alkylierung und enzymatische Verdauung. Digitale Mikrofluidik ist ein mikro-Fluid-Handling-Technik, bei der Nanoliter-Mikroliter-Tröpfchen auf einer offenen Fläche manipuliert werden. Tröpfchen auf der Oberseite aus einem Array von Elektroden, die durch eine dielektrische Schicht beschichtet sind, positioniert sind - wenn ein elektrisches Potential an den Tropfen angelegt wird, sammeln sich Ladungen auf beiden Seiten des Dielektrikums. Die Gebühren dienen als elektrostatische Griffe, die verwendet werden, um Tropfen Lageregelung werden können, und durch Vorspannen einer Folge von Elektroden in Serie, Tropfen gemacht zu verzichten, verschieben, zusammenführen, Mix-und Split auf der Oberfläche sein. Daher ist DMF eine natürliche Ergänzung für die Durchführung schneller, sequentiell, mehrstufige, miniaturisierte automatische biochemische Assays. Dies stellt einen bedeutenden Fortschritt gegenüber herkömmlichen Methoden (unter Berufung auf manuelles Pipettieren oder Roboter), und hat das Potenzial, ein nützliches neues Werkzeug in der klinischen Proteomik werden.

Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk und Steve CC Shih trugen gleichermaßen zu dieser Arbeit.

Sergio LS Freire die aktuelle Adresse an der Universität der Wissenschaften in Philadelphia auf 600 South 43rd Street, Philadelphia, PA 19104 gelegen.

Protocol

Teil 1: Geräte-Fertigung

1. Saubere Glas-Substraten in Piranha-Lösung (3:1 conc Schwefelsäure:. 30% iges Wasserstoffperoxid). Verlassen Sie die Substrate in Piranha-Lösung für 10 min mit häufigem Rühren.
2. Nach dem Spülen in deionisiertem Wasser (DI) und Trocknen der Substrate mit N _2-Gas, statt der Substrate innerhalb des Elektronenstrahls Kammer für Chrom-Abscheidung (Dicke von 250 nm).
3. Zur Dehydratisierung der Chrom-beschichteten Substrat, in Isopropanol spülen und dann backen auf einer heißen Platte für 5 min bei 115 ° C.
4. Trocknen Sie die Substrate und prime mit Hexamethyldisilazan (HMDS) durch Spin-Coating (30 s, 3000 rpm). Spin-Mantel wieder (mit identischen Parametern) mit Shipley S1811 Fotolack.
5. Pre-Bake das Substrat auf einer Heizplatte (100 ° C, 2 min), dann Muster der Fotolack durch Bestrahlung mit ultraviolettem (UV) Bestrahlung für 5 s durch eine Photomaske.
6. Entwickeln Sie die UV-exponierten Substraten in Shipley MF 321 Entwickler für 3 min waschen in VE-Wasser. Post-Bake auf einer Heizplatte bei 100 ° C für 1 min.
7. Etch die exponierte Chrom durch Eintauchen in Chrom Ätzmittel für 30 s. Spülen in DI-Wasser, dann tauchen in AZ300T Stripperin für 10 min auf die verbleibenden Fotolack entfernen. Spülen in DI Wasser abspülen und mit N _2-Gas.
8. Kaution 2-5 um Parylene-C (ein isolierendes Polymer) durch chemische Gasphasenabscheidung auf ein Substrat mit gemusterten Chrom. Kaution 50 nm von Teflon-AF (an die Oberfläche hydrophob zu machen) durch Spin-Coating eine Lösung (1% wt / wt in Fluorinert FC-40) bei 2000 rpm für 60 s. Post-Bake auf einer Heizplatte (160 ° C, 10 min).
9. Zur Bildung der oberen Platte, Mantel ein un-gemusterten Indium-Zinn-Oxid (ITO) Glassubstrate 50 nm Teflon-AF, wie oben beschrieben.
10. Post-backen beide Substrate auf einer Heizplatte (160 ° C, 10 min).

Teil 2: Geräte-Set-up und Automation

1. In der digitalen Mikrofluidik-Geräte in "Zwei-Teller"-Konfiguration betrieben werden ¹ Tropfen zwischen einem unteren Substrat (mit gemusterten Elektroden) und ein oberes Substrat (mit einer zusammenhängenden, transparenten Elektrode, die typischerweise aus ITO gebildet) positioniert.
2. Um das Gerät so auf, entfernen Polymerbeschichtungen von den Kontaktstellen des unteren Substrats durch vorsichtiges Schaben mit einem Skalpell. Paar der exponierten Pads des unteren Substrats mit 40-poliger Stecker (Abbildung 1a).
3. Power-auf einem Computer mit LabView (National Instruments, Austin, TX), ein Haus gebaut Schaltkasten (mit einer Reihe von Hochspannungs-Relais, die durch Signale von einem National Instruments DAQPad gesteuert), einen Funktionsgenerator und einen Verstärker . Der Computer / Schaltkasten erleichtert dem Anwender die Kontrolle über die Anwendungsbereitstellung von 100 V _RMS / 18 kHz-Signale an das Gerät über den 40-poligen Stecker.
4. Montieren Sie das Gerät durch Positionierung von zwei Stücken doppelseitigem Klebeband (140 mu m Gesamtdicke) an den Rändern der unteren Substrat und komplett mit unstrukturierten ITO Dias (Deckplatte).
5. Zur Initialisierung der Steuerung, führen Sie das LabView Kalibrierung Programm (geschrieben in-house), um den Regelkreis zu kalibrieren.
6. Legen Sie die Probe und Reagenzien in den entsprechenden Behältern (siehe Abschnitt 3 unten) aus und legen sie unter die Top-Substrat (Teflon-beschichteten Seite nach unten). Befestigen Sie die Erdungsklemme an die Spitze Substrat.
7. Laden Sie die Betätigung Code in LabView (geschrieben in-house) und das Programm ausführen zu Tröpfchen Betätigung einzuleiten.

Teil 3: Probe und Reagenz-Vorbereitung

1. Bereiten Sie arbeiten Puffer (WB): 100 mM Tris-HCl (pH 7,8) und 0,08% Pluronic F127 w / v.
2. Lösen Protein (e) in WB und Pipette Probe in den Behälter 1 (R-1) auf dem Gerät analysiert werden, wie in Abbildung 1b gezeigt.
3. Bereiten Fällungsmittel, 20% Trichloressigsäure (TCA) in DI-Wasser und Pipette in R-2.
4. Bereiten Waschpuffer, 70/30 Chloroform / Acetonitril (ACN) und Pipette in R-4.
5. Bereiten Umsolubilisieren Puffer, 100 mM Ammoniumbicarbonat (pH 8,0) und 0,08% Pluronic F127 w / v, und Pipette in R-5.
6. Lösen Reduktionsmittel, Tris (2-carboxy) phosphin (TCEP), bei 10 mM in WB und Pipette in R-6.
7. Lösen Sie Alkylierungsmittel iodoacetamide (IAM), bei 12 mM in WB und Pipette in R-7.
8. Lösen Trypsin in WB bei einer Konzentration gleich zu 1 / 5 der Konzentration des Gesamt-Protein-Probe (siehe 3.1, oben) und Pipette in R-8.

Teil 4: Digitale Mikrofluidik Sample Processing

1. Das folgende Verfahren wird automatisch mittels LabVIEW-Code in-house geschrieben implementiert. Das Volumen der Tröpfchen aus Stauseen verzichtet wird durch die Abmessungen der Elektroden (in diesem Fall verzichtet wird Tröpfchen ~ 600nL) definiert.
2. Dispense ein Tröpfchen von Protein-haltige Probe von R-1 und einem Tropfen Fällungsmittel von R-2 (Abbildung 2, Frame 1). Merge der beiden Tröpfchen und ermöglicht die kombinierte Tropfen für 5 min inkubieren, wodurch die Ausscheidung von proteins auf der Oberfläche (Abb. 2, Frames 2-3). Betätigen Sie den Überstand vom ausgefallenen Proteins an die Abfallbehälter, R-3 (Abbildung 2, Frame 4).
3. Dispense drei Tropfen Waschpuffer aus R-4 und fahren sie über die gefällten Proteins an die Abfallbehälter, R-3 (Abbildung 2, Frame 5).
4. Nachdem sich der Niederschlag zu trocknen, und verzichten einen Tropfen Umsolubilisieren Puffer von R-5 an das Protein. Lassen Sie den Puffer für 20 min inkubieren, bis der Niederschlag gelöst hat (Abbildung 2, Frame 6).
5. Dispense ein Tröpfchen Reduktionsmittel aus R-6 und verschmelzen sie mit der Probe Tropfen. Mix der kombinierten Tröpfchen durch Betätigen es über 6 Elektroden in einem kreisförmigen Muster. Lassen Sie die Tropfen für 1 h bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer (Abbildung 3, Frames 1-2) inkubieren.
6. Dispense ein Tröpfchen Alkylierungsmittel aus R-7 und verschmelzen sie mit der Probe Tröpfchen, durch Mischen (wie in 4,5) gefolgt. Lassen Sie die Tropfen für 15 min bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer, vor Licht geschützt (Abbildung 3, Frames 2-3) inkubieren.
7. Dispense ein Tropfen Trypsin aus R-8, und führen Sie sie mit der Probe Tröpfchen, durch Mischen (wie in 4,5) gefolgt. Lassen Sie die Tropfen für 3 h bei 37 ° C in einer feuchten Kammer auf einer heißen Platte (Abbildung 3, Frames 3-4).

Teil 5: Post-Processing-Probenvorbereitung

1. Entfernen Sie die obere Substrat und stillen Verdauung Reaktion durch Zugabe von 0,6 ml 2,5% Trifluoressigsäure in Wasser.
2. Purify abgeschreckt Reaktionsprodukt mit C18 ZipTips (Millipore, Billerica, MA) nach den Anweisungen des Herstellers.
3. Verdünnen gereinigte Probe in VE-Wasser auf ein Endvolumen von 100 mL.

Teil 6: Massenspektrometrie

1. Beurteilen Sie die bearbeitete Probe auf einem Nano-HPLC gepaart mit einem Tandem-Massenspektrometer. Das HPLC-System verwendet hier aus Eksigent Technologies und ist mit einem Trap-Säule (3 mm Durchmesser. C18 Perlen, 150 pm ID x 2,5 cm) und eine Reversed-Phase-Trennsäule (3 mm Durchmesser ausgestattet. C18 Perlen, 75 pm ID x 15 cm). Das Massenspektrometer dient hier ein LTQ von Thermo-Fisher Scientific.
2. Legen Sie eine 2 ul Probe auf die Trap-Säule bei 5μL/min in einer mobilen Phase aus 5% Acetonitril in Wasser. Trennen Sie die Probe auf der Reversed-Phase-Säule an 0.5μL/min mit einem linearen Gradienten von 20% Acetonitril bis 80% Acetonitril über 25 min. Weiter läuft bei 80% Acetonitril für weitere 10 min.
3. Analysieren Sie die Bänder eluting aus der Säule durch Tandem-Massenspektrometrie. In die Arbeit hier berichtet, ist das Elutionsmittel in das Massenspektrometer über eine Nanoelektrospray Emitter (20 um ID konisch bis 10 um-ID), NewObjective abgetastet.
4. Identifizieren Sie die Proteine ​​in der Probe mit Hilfe einer Datenbank-Suchprogramm wie SEQUEST. In dieser Arbeit haben wir die Version von SEQUEST in Bioworks v3.01 (Thermo-Fisher Scientific) aufgenommen, und identifizierten Proteine ​​hatten Wahrscheinlichkeit Punktzahl von weniger als 1,0 E-03 (entspricht 99,9% Konfidenzintervall), und die Reihenfolge Bedeckungen von mindestens 30% (Abbildung 4).

Abbildung 1. (A) Ein Bild einer DMF-Gerät auf 40-Pin-Anschlüsse für die automatisierte Tropfen Betätigung gepaart. (B) Eine schematische Darstellung einer Vorrichtung der Darstellung der Positionierung der Probe und Reagenzien für eine Proteomanalyse Aufarbeitung erforderlich.

Abbildung 2. Frames aus einem Film der Darstellung der automatisierten Extraktion und Reinigung von BSA in 20% TCA (Fällungsmittel) und 70/30% Chloroform / Acetonitril (Spüllösung). In Rahmen 6, wird das ausgefallene Protein in einem Tropfen 100 mM Ammoniumbicarbonat gelöst.

Abbildung 3. Frames aus einem Film illustriert sequentielle Reduktion, Alkylierung und Verdauung von einem Tropfen resolubilisiert Protein. In dieser Figur sind die Reagenzien mit Farbstoffen für Klarheit gefärbt; in der Praxis sind die Reagenzien nicht gefärbt.

Abbildung 4. MS-Chromatogramm einer Probe von Rinderserumalbumin durch die digitale Mikrofluidik verarbeitet. 25 unterschiedliche Peptide identifiziert wurden (99,9% Konfidenzintervall) entspricht einer Sequenz Abdeckung von 44%.

Discussion

Der Mangel an standardisierten Probe Handhabung und Verarbeitung in der Proteomik ist eine große Einschränkung für das Feld. Darüber hinaus beinhaltet konventionellen makroskopischen Probe Umgang mit mehreren Containern und Lösung Transfers, die zur Zerstörung und Verschmutzung Probe kann. Eine mögliche Lösung für diese Probleme ist es, integrierte Systeme für die Probenaufbereitung sich auf digitale Mikrofluidik ¹ (DMF) zu bilden. In früheren Arbeiten wurde DMF gezeigt, dass für die effiziente Entfernung von unerwünschten Verunreinigungen in heterogenen proteinhaltigen Lösungen sinnvoll. ² ebenfalls, wurde DMF ist deren Kompatibilität mit der Integration von mehrstufigen Lösung-Phasen-Verarbeitung (Reduktion, Alkylierung und Verdauung) auf einem integrierten Gerät. ³ Hier haben wir ein voll integriertes System mit automatisierter Tropfen Kontrolle für Proteinextraktion durch Fällung durch eine lösungsorientierte Phase der Verarbeitung folgten unter Beweis gestellt. Wir spekulieren, dass, wenn Methoden wie diese allgemein angenommen werden, die menschliche Fehler innewohnt Proteomik Probenvorbereitung weitgehend eliminiert werden kann, was in Analysen mit einer besseren Reproduzierbarkeit. In kurzen, schlagen wir vor, dass DMF das Potential, für einen breiten Querschnitt von Anwendungen nützlich ist, da die Bedingungen genau in jedem Labor der Welt kopiert werden.