מיקרופלואידיקה דיגיטלי עבור עיבוד אוטומטי proteomic

Summary

Digital מיקרופלואידיקה היא טכניקה מאופיין מניפולציה של טיפות בדידים (~ NL - מ"ל) על מערך של אלקטרודות על ידי יישום של שדות חשמליים. הוא מתאים היטב בביצוע מהיר, רציף, מבחני מיניאטורי ביוכימיים אוטומטיות. כאן אנו מדווחים פלטפורמה מסוגל מיכון כמה מדרגות עיבוד proteomic.

Abstract

Proteomics קלינית התפתחה כדיסציפלינה חדשה חשוב, המבטיח גילוי סמנים כי יהיה שימושי עבור אבחון מוקדם הפרוגנוזה של המחלה. בעוד שיטות proteomic קליניים להשתנות במידה רבה, מאפיין משותף הוא הצורך (i) מיצוי של חלבונים מן נוזלים הטרוגנית מאוד (כלומר, בסרום, דם מלא, וכו ') וכן (ii) עיבוד ביוכימיים מקיף לפני הניתוח. כאן, אנו דו"ח חדש דיגיטלי מיקרופלואידיקה (DMF) שיטה המבוססת שילוב מדרגות עיבוד מספר proteomics בשימוש קליני. זה כולל מיצוי חלבון, resolubilization, הפחתה, אלקילציה עיכול אנזימטי. Digital מיקרופלואידיקה היא טכניקה microscale נוזל הטיפול בהם טיפות nanoliter-microliter בגודל הם מניפולציה על משטח פתוח. טיפות ממוקמים על גבי מערך של אלקטרודות כי הם מצופים בשכבת דיאלקטרי - כאשר הפוטנציאל החשמלי מוחל על אגל, חיובים מצטברים משני צדי דיאלקטרי. האישומים לשמש מטפל אלקטרוסטטי שניתן להשתמש בהם כדי לשלוט בעמדה רביב, ועל ידי הטיית רצף של אלקטרודות בסדרה, טיפות ניתן לוותר, להזיז, למזג, לערבב, ולפצל על פני השטח. לכן, DMF הוא בכושר טבעי לביצוע מהיר, רציף רב שלבי, מיניאטורי מבחני ביוכימיים אוטומטיות. זה מייצג התקדמות משמעותית לעומת שיטות קונבנציונליות (בהסתמך על pipetting רובוטים או ידנית), ויש לו פוטנציאל להיות כלי חדש שימושי proteomics קליניים.

מאיס ג'Jebrail, ויויאן נ 'לוק, וסטיב CC שי תרמו באופן שווה על עבודה זו.

הכתובת הנוכחית סרג'יו LS של פריירה הוא באוניברסיטת למדעי בפילדלפיה הממוקם 600 דרום רחוב 43, פילדלפיה, פנסילבניה 19104.

Protocol

חלק 1: ייצור המכשיר

1. זכוכית מצעים נקיים בפתרון Piranha (03:01 קונצרט כלשהו חומצה גופרתית:. חמצן 30%). השאירו את מצעים בפתרון Piranha דקות 10 בהתרגשות תכופים.
2. לאחר שטיפה במים (DI) deionized וייבוש מצעים עם גז ₂ N, המקום מצעים בתוך החדר אלומת אלקטרונים בתצהיר כרום (עובי של 250 ננומטר).
3. כדי ליבש את המצע מצופה כרום, לשטוף ב isopropanol ואז לאפות על פלטה חשמלית במשך 5 דקות ב 115 ° C.
4. יבש מצעים וראש עם hexamethyldisilazane (HMDS) על ידי ציפוי ספין (30 s, 3,000 סל"ד). ספין מעיל שוב (באמצעות פרמטרים זהים) עם photoresist S1811 שיפלי.
5. טרום לאפות את המצע בצלחת חם (100 ° C, 2 דקות), ואז התבנית photoresist על ידי חשיפה לקרינה אולטרה סגולה (UV) על דרך של 5 photomask.
6. פיתוח UV-חשופה מצעים ב מפתח שיפלי 321 MF 3 דקות ולשטוף במים DI. פוסט לאפות על צלחת חמה ב 100 מעלות צלזיוס במשך דקות 1.
7. כרום Etch שנחשפו על ידי טבילה כרום etchant עבור 30 s. לשטוף במים DI, לטבול אז חשפנית AZ300T עבור 10 דקות להסיר את photoresist הנותרים. לשטוף במים DI ויבש עם גז ₂ N.
8. הפקדה 2-5 Parylene-C (פולימר בידוד) על ידי אדים כימיים מיקרומטר בתצהיר על נושא המצע בדוגמת כרום. הפקדה של 50 ננומטר טפלון AF (על מנת להפוך את פני השטח הידרופובי) על ידי פתרון ספין ציפוי (1% wt / wt ב Fluorinert FC-40) ב 2000 סל"ד במשך 60 s. פוסט לאפות בצלחת חם (160 ° C, 10 דקות).
9. כדי ליצור את הצלחת העליונה, מעיל בלתי בדוגמת תחמוצת אינדיום בדיל (איטו) זכוכית מצעים 50 ננומטר טפלון AF, כאמור לעיל.
10. פוסט לאפות גם מצעים בצלחת חם (160 ° C, 10 דקות).

חלק 2: Device Set-up and Automation

1. בשנת מכשירים microfluidic דיגיטלי פעלו בתצורת "שתי צלחת", טיפות ¹ ממוקמים בין המצע לתחתית (עם אלקטרודות בדוגמת) ואת המצע העליונה (עם אלקטרודה, רציף שקוף, נוצר בדרך כלל מ איטו).
2. כדי להגדיר את המכשיר למעלה, להסיר ציפוי פולימר מן רפידות קשר של מצע התחתונה על ידי גירוד עדין עם אזמל. זוג רפידות החשוף של המצע לתחתית עם 40 פינים (איור 1 א).
3. Power-במחשב שבו פועל LabVIEW (National Instruments, אוסטין, טקסס), בית בנוי קופסת הבקרה (שמציעות מערך של מתח גבוה ומשדר כי נשלטים על ידי אותות מכשירים הלאומי DaqPad), גנרטור פונקציה, מגבר . תיבת מחשב / שליטה מאפשר למשתמש שליטה על היישום של 100 V _RMS / 18 kHz אותות אל המכשיר דרך 40 פינים.
4. להרכיב את המכשיר על ידי הצבת שתי חתיכות של נייר דו צדדית (140 מיקרומטר עובי סה"כ) בשולי המצע התחתונה להשלים עם מגלשות unpatterned איטו (ציור למעלה).
5. כדי לאתחל את מערכת הבקרה, להפעיל את התוכנית כיול LabVIEW (שנכתב in-house) כדי לכייל את בקרת משוב.
6. טען את המדגם ריאגנטים לתוך מאגרי מתאים (ראה סעיף 3, להלן) לצרף אותם תחת המצע העליונה (מצופה טפלון צד פונה כלפי מטה). חבר את מחבר הקרקע המצע העליונה.
7. טען את הקוד actuation ב LabVIEW (שנכתב in-house) ולבצע את התוכנית ליזום actuation רביב.

חלק 3: הכנת המדגם ו מגיב

1. הכנת מאגר עובדים (WB): 100 מ"מ TrisHCl (pH 7.8) ו Pluronic 0.08% F127 w / נ
2. ממיסים חלבון (ים) להיות מנותח במדגם WB ו פיפטה לתוך מאגר 1 (R-1) על המכשיר, כפי שמוצג באיור 1b.
3. הכן חומצה נמהר, Trichloroacetic 20% (TCA) במים DI, ו פיפטה לתוך R-2.
4. הכן לשטוף חיץ, 70/30 כלורופורם / אצטוניטריל (ACN) ו פיפטה לתוך R-4.
5. הכן חיץ resolubilizing, 100 mM אמוניום ביקרבונט (pH 8.0) ו 0.08% Pluronic F127 w / v ו פיפטה לתוך R-5.
6. ממיסים reductant, טריס (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP), ב 10 מ"מ ב WB ו פיפטה לתוך R-6.
7. ממיסים סוכן אלקילציה, iodoacetamide (IAM), ב 12 מ"מ ב WB ו פיפטה לתוך R-7.
8. ממיסים טריפסין ב WB בריכוז שווה to1 / 5 ריכוז של המדגם הכולל חלבון (ראה 3.1, לעיל) פיפטה לתוך R-8.

חלק 4: דוגמה עיבוד דיגיטלי Microfluidic

1. ההליך הבא מיושם באופן אוטומטי באמצעות קוד LabVIEW בכתב בתוך הבית. היקף טיפות לוותר ממאגרים מוגדר על ידי הממדים של אלקטרודות (במקרה זה, טיפות חילק הם ~ 600nL).
2. לוותר על טיפה של מדגם המכיל חלבון מן R-1 ו - טיפה של נמהר מ R-2 (איור 2, פריים 1). מיזוג שתי טיפות ולאפשר אגל בשילוב כדי לדגור במשך 5 דקות, וכתוצאה מכך כמות המשקעים של יחסי ציבורoteins על פני השטח (איור 2, מסגרות 2-3). להניע supernatant הרחק החלבון זירז למאגר הפסולת, R-3 (איור 2, מסגרת 4).
3. לוותר three טיפות של חיץ לשטוף מ R-4 ו להסיע אותם על פני החלבון זירז למאגר הפסולת, R-3 (איור 2, מסגרת 5).
4. אפשר לזרז עד יבש, לוותר על טיפה של חיץ resolubilizing של R-5 לחלבון. אפשר למאגר כדי לדגור במשך 20 דקות עד המשקע נמס (איור 2, מסגרת 6).
5. לוותר על טיפה של reductant מ R-6 ולמזג אותה עם טיפה את המדגם. מערבבים את אגל בשילוב ידי actuating אותו על פני 6 אלקטרודות בתבנית מעגלית. אפשר אגל כדי לדגור על h 1 בטמפרטורת החדר בתא humidified (איור 3, מסגרות 1-2).
6. לוותר על טיפה של אלקילציה סוכן מ-R-7 ולמזג אותה עם טיפה המדגם, ואחריו ערבוב (כמו 4.5). אפשר אגל כדי לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בתא humidified, מוגן מפני אור (איור 3, מסגרות 2-3).
7. לוותר על טיפה של טריפסין מ R-8, ולמזג אותו עם טיפה המדגם, ואחריו ערבוב (כמו 4.5). אפשר אגל כדי לדגור במשך 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס בתא humidified על פלטה חשמלית (איור 3, מסגרות 3-4).

חלק 5: שלאחר עיבוד הכנת המדגם

1. הסר המצע העליון העיכול התגובה להרוות ידי הוספת 0.6 מ"ל של חומצה trifluoroacetic 2.5% במים.
2. לטהר המוצר התגובה הרווה באמצעות ZipTips C18 (Millipore, Billerica, MA) בהתאם להוראות היצרן.
3. מדולל במים מטוהרים מדגם DI לנפח סופי של 100 מ"ל.

חלק 6: המוניים ספקטרומטריית

1. הערכת מדגם מעובד על ננו HPLC הזדווגו כדי ספקטרומטר מסה טנדם. מערכת HPLC משמש כאן הוא מתוך טכנולוגיות Eksigent והוא מצויד עם טור מלכודת (3 מ"מ קוטר. חרוזים C18, 150 מיקרומטר מזהה x 2.5 ס"מ) טור הפוך שלב ההפרדה (3 מיקרומטר קוטר. חרוזים C18, 75 מיקרומטר מזהה x 15 ס"מ). ספקטרומטר מסה משמש כאן הוא LTQ מ-Thermo Fisher Scientific.
2. טען מדגם 2 μL על הטור מלכודת בבית 5μL/min בשלב ניידים הכוללים אצטוניטריל 5% מים. הפרד את הדוגמה על העמודה שלב התהפכה על 0.5μL/min באמצעות שיפוע ליניארית מ אצטוניטריל 20% עד 80% אצטוניטריל מעל 25 דקות. המשך לפעול בשעה אצטוניטריל 80% עבור 10 דקות אחר.
3. ניתוח להקות משחררי את הטור על ידי ספקטרומטריית מסה טנדם. בעבודה דיווחו כאן, eluent היא שנדגמו לתוך ספקטרומטר מסה באמצעות פולט nanoelectrospray (20 מיקרומטר מזהה התחדד מזהה 10 מיקרומטר) מתוך NewObjective.
4. זהה את החלבונים במדגם באמצעות חיפוש באתר התוכנית כגון SEQUEST. בעבודה זו, היינו את גירסת SEQUEST שולבו Bioworks v3.01 (Thermo-פישר סיינטיפיק), וחלבונים זיהו היו ציונים הסתברות של פחות מ 1.0e-03 (שווה ערך ל מרווח ביטחון 99.9%), ואת הכיסויים רצף ב לפחות 30% (איור 4).

באיור 1. (א) תמונה מכשיר DMF הזדווגו עד 40 פינים עבור actuation אגל אוטומטיות. (ב) סכימטי של מכשיר המתאר את המיקום של המדגם ריאגנטים הנדרש הבדיקות proteomic.

איור 2. מסגרות מסרט המתאר את מיצוי אוטומטיות טיהור BSA ב TCA 20% (נמהר) ו אצטוניטריל% 70/30 כלורופורם / (לשטוף פתרון). במסגרת 6, החלבון הוא זירז redissolved ב אגל של אמוניום ביקרבונט 100 מ"מ.

איור 3. מסגרות מסרט הממחישות הפחתה אלקילציה רציפים, ועיכול אגל של חלבון resolubilized. בנתון זה, ריאגנטים נצבעים בצבעי לבהירות; בפועל, ריאגנטים אינם צבעוניים.

4. איור MS chromatogram מדגם של אלבומין בסרום שור מעובד על ידי מיקרופלואידיקה דיגיטלית. 25 פפטידים שונים זוהו (99.9% מרווח ביטחון) המקביל כיסוי רצף של 44%.

Discussion

חוסר טיפול מדגם עיבוד סטנדרטי ב proteomics היא מגבלה עיקרית עבור השדה. בנוסף, מדגם טיפול קונבנציונלי macroscale כרוך containers רבים והעברות פתרון, אשר יכול להוביל לאובדן מדגם וזיהום. פתרון אפשרי לבעיות אלו היא ליצור מערכות משולבות לעיבוד דיגיטלי מדגם להסתמך על מיקרופלואידיקה ¹ (DMF). בעבודה הקודמת, DMF הוצגה להיות שימושי עבור סילוק יעיל של מזהמים לא רצויים הטרוגנית חלבון המכיל פתרונות. ² כמו כן, DMF הוצגה להיות תואם עם שילוב של פתרון עיבוד שלב רב שלבי (הפחתה אלקילציה ועיכול) על משולב המכשיר. ³ כאן, יש לנו הפגינו המערכת משולבת במלואה עם שליטה אגל אוטומטיות להפקת חלבון על ידי משקעים ואחריו עיבוד פתרון שלב. אנו משערים כי אם שיטות כגון אלה לאימוץ נרחב, טעות אנוש הטמון עיבוד המדגם proteomic ניתן למנוע במידה רבה, וכתוצאה מכך ניתוחים עם שחזור טוב יותר. בקיצור, אנחנו מציעים כי DMF יש פוטנציאל להיות שימושי עבור חתך רוחב רחב של יישומים, כמו התנאים אפשר להעתיק במדויק במעבדה אחרת בעולם.