Otomatik Proteomik İşleme Dijital Mikroakiskan

Summary

Elektrik alanların uygulama tarafından bir dizi elektrot - Dijital Mikroakiskan ayrık damlacıklar (ml ~ nL) manipülasyon ile karakterize bir tekniktir. Hızlı, sıralı, minyatür otomatik biyokimya testleri yürütmek için çok uygundur. Burada, birkaç proteomik işlem adımlarını otomatik olarak yetenekli bir platform raporu.

Abstract

Klinik proteomik, hastalığın erken tanı ve prognoz için yararlı olacaktır biyobelirteç keşif umut verici, yeni ve önemli bir disiplin olarak ortaya çıkmıştır. Klinik proteomik yöntemleri çok çeşitlilik gösterirken, bir ortak özelliği son derece heterojen sıvıları (örneğin, serum, kan, vs) ve analizden önce, (ii) geniş biyokimyasal işlem proteinlerin ekstraksiyonu (i) ihtiyaç vardır. Burada, klinik proteomik kullanılan birçok işlem adımı birleştirerek yeni bir dijital Mikroakiskan (DMF) tabanlı yöntemi raporu. Bu, protein ekstraksiyon, resolubilization, azaltma, alkilleme ve enzimatik sindirim içerir. Dijital Mikroakiskan nanoliter mikrolitrelik ölçekli damlacıkları açık bir yüzey üzerine manipüle edildiği bir microscale sıvı-işleme tekniği. Damlacıkları dielektrik tabakası ile kaplı elektrotlar bir dizinin üstüne konumlandırılmış bir elektrik potansiyeli damlacık uygulandığında, masraflar dielektrik her iki tarafında birikir. Suçlamalar damlacık konumunu kontrol etmek için kullanılan elektrostatik kolları olarak hizmet ve seri bir dizi elektrot kutuplama damlacıkları dağıtmak, hareket, birleştirme, mix ve yüzey üzerinde bölünmüş yapılabilir. Bu nedenle, DMF, hızlı, sıralı, çok adımlı, minyatür otomatik biyokimya testleri taşımak için, doğal bir uyum. Bu, geleneksel yöntemler (elle pipetleme veya robotlar dayanarak) üzerinde önemli bir ilerlemeyi temsil eder ve klinik proteomik yararlı bir yeni bir araç olma potansiyeline sahiptir.

Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk, ve Steve CC Shih, bu çalışmaya eşit katkıda bulundu.

Sergio LS Freire mevcut adresi 600 Güney 43rd Street, Philadelphia, PA 19.104 bulunan Philadelphia Bilimler Üniversitesi.

Protocol

Bölüm 1: Cihaz Fabrikasyon

1. Piranha çözüm temiz bir cam yüzeyler (3:1 kons sülfürik asit:% 30 hidrojen peroksit). Piranha çözümü için sık sık ajitasyon ile 10 dakika Yüzeyin bırakın.
2. Deiyonize (DI) su ile durulama ve N ₂ gazı ile substratlar kurutma sonra, elektron ışını odasının içine, krom birikimi (250 nm kalınlığı) substratları yerleştirin .
3. Krom kaplı substrat kurutmak için, sonra 115, 5 dakika sıcak bir plaka üzerinde fırında isopropanol yıkayın ve ° C
4. Spin kaplama (30 s, 3000 rpm) yüzeylerde ve prime hexamethyldisilazane (HMDS) ile kurulayın. Shipley S1811 fotorezist ile yeniden Spin-kat (aynı parametreleri kullanarak).
5. Ön fırında sıcak bir tabak (100 ° C, 2 dak) substrat, daha sonra desen bir photomask üzerinden 5 sn ışınlama için ultraviyole (UV) maruz kalma fotorezist.
6. Shipley MF 321 geliştirici DI suda 3 dakika ve yıkama UV ışınlarına maruz kalan yüzeylerde geliştirin. 100 sıcak bir tabak Post-fırında ° C 1 dak.
7. 30 saniye krom asitlenmesi daldırma Asitli maruz krom Kalan fotorezist kaldırmak için, 10 dakika AZ300T striptizci sonra batırmayın, DI su ile durulayın. DI suyla durulayın ve N ₂ gazı ile kurulayın.
8. Mevduat 2-5 mikron krom desenli bir substrat yatak üzerine kimyasal buhar Parylene-C (bir yalıtkan polimer) birikimi. Mevduat 60 s 2000 rpm'de spin kaplama çözeltisi (% 1 ağırlık / ağırlık Fluorinert de FC-40) ile 50 nm (yüzeyini hidrofobik yapmak için Teflon-AF) Post-sıcak bir tabak (160 ° C, 10 dakika) pişirin.
9. Üst plaka formu için, bir kat yukarıda un desenli indiyum kalay oksit (ITO) cam yüzeylerde 50 nm Teflon-AF.
10. Sıcak bir tabak (160 ° C, 10 dk) hem substratlar Post-pişirin.

Bölüm 2: Cihaz Set-up ve Otomasyon

1. "Iki-plate" yapılandırma işletilen dijital mikroakışkan cihazlarda bir alt yüzey (desenli elektrotlar) ve bir üst substrat (genellikle İTO oluşan bir bitişik, şeffaf elektrot,), ¹ damlacıkları arasında konumlandırılmış.
2. Cihazı kurmak için, bir bistüri ile nazik kazıma tarafından bir alt substrat temas pedleri polimer kaplamalar çıkarın. Çift, 40-pin konnektör (Şekil 1a) ile alt zemin pedleri maruz.
3. Power-on LabView (National Instruments, Austin, Teksas), bir ev inşa edilmiş bir kontrol kutusu (National Instruments DaqPad gelen sinyaller tarafından kontrol edildiği bir dizi yüksek gerilim röleleri), bir fonksiyon jeneratör ve bir amplifikatör çalıştıran bir bilgisayara . Bilgisayar / kontrol kutusu, 100 _V RMS / 18 kHz sinyaller 40-pin konnektörü üzerinden cihaza uygulama üzerinde kullanıcı kontrolü kolaylaştırır .
4. Alt yüzey kenarları çift taraflı bant ile iki adet (140 mikron toplam kalınlığı) konumlandırma cihazı birleştirin ve unpatterned İTO slaytlar (üst plaka) ile tamamlandı.
5. Kontrol sistemi başlatmak için, geri beslemeli kontrol kalibre için LabView kalibrasyon programı (in-house yazılı) çalıştırın.
6. Numune ve reaktiflerin uygun rezervuarlar (bkz. aşağıdaki bölüm 3) içine yerleştirin ve en substrat (Teflon kaplamalı yüzü aşağı bakacak şekilde) içine alın. Üst yüzey toprak fişini takın.
7. LabView kumanda kodu (in-house yazılı) yükleyin ve damlacık harekete başlatmak için programı çalıştırmak.

Bölüm 3: Numune ve Reaktif Hazırlama

1. 100 mM TrisHCl (pH 7.8) ve% 0.08 Pluronic F127 w / v: çalışma tamponu (WB) hazırlayın
2. Şekil 1b gösterildiği gibi WB ve pipetle numune cihaz üzerindeki rezervuar 1 (R-1) analiz edilecek protein (ler), çözülür.
3. R-2 Yağışlı,% 20 Trikloroasetik DI su asit (TCA), pipet hazırlayın.
4. Tampon yıkama hazırlayın, 70/30 Kloroform / R-4 asetonitril (ACN) ve pipet içine.
5. R-5 resolubilizing tampon, 100 mM Amonyum Bikarbonat (pH 8.0) ve% 0,08 Pluronic F127 w / v ve pipet hazırlayın.
6. R-6 içine indirgeyici, tris (2-carboxyethyl) fosfin (TCEP), DB ve pipet 10 mM eritin.
7. Alkilleyici ajan, iodoacetamide (IAM), R-7 WB ve pipet 12 mM eritin.
8. WB R-8, total protein örneği konsantrasyonu (yukarıda 3.1 'e bakın) ve pipet 1'e / 5 eşit bir konsantrasyonda tripsin çözülür.

Bölüm 4: Dijital mikroakışkan Örnek İşleme

1. Aşağıdaki yordam, in-house yazılı LabView kodu sayesinde otomatik olarak gerçekleştirilir. Rezervuarları dağıtılır damlacıklarının hacmi elektrotlar (bu durumda, reçete damlacıkları ~ 600nL) boyutları ile tanımlanır.
2. R-1 protein içeren örnek bir damlacık ve R-2 (Şekil 2, Kare 1) Yağışlı bir damlacık koyun. Iki damlacıkları Birleştirme ve kombine damlacık pr yağış sonucu, 5 dakika boyunca inkübeyüzeye oteins (Şekil 2, Çerçeveler 2-3). Atık deposu, R-3 (Şekil 2, Çerçeve 4) çöktürülmüş protein uzak süpernatant şarjörü.
3. R-4 yıkama tamponu üç damlacıkları dağılır ve atık deposu, R-3 (Şekil 2, Çerçeve 5) çöktürülmüş protein üzerinden sürücü.
4. Çökelti kurumasını bekleyin, ve R-5 protein resolubilizing tampon bir damlacık dağıtmak. Çökelti (Şekil 2, Çerçeve 6) eriyene kadar tampon 20 dakika inkübe izin verin.
5. R-6 indirgeyici bir damlacık Uygulama ve örnek damlacık ile birleştirmek. Dairesel bir desen 6 elektrotlar arasında harekete geçirerek, kombine damlacık karıştırın. Damlacık nemlendirilmiş bir odası (Şekil 3, Çerçeveler 1-2) oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe izin verin.
6. R-7 ajan alkilleyici bir damlacık koyun ve karıştırma (4,5) takip örnek damlacık ile birleştirmek. Damlacık nemlendirilmiş bir odasında oda sıcaklığında ışıktan koruyarak 15 dakika, (Şekil 3, Çerçeveler 2-3) inkübe izin verin.
7. R-8 tripsin Bir damla koyun ve karıştırma (4,5) takip örnek damlacık ile birleştirmek. Damlacık 37, 3 saat süreyle inkübe ° C sıcak bir plaka üzerinde nemlendirilmiş bir odası (Şekil 3, Çerçeveler 3-4) izin verin.

Bölüm 5: Post-İşleme Numune Hazırlama

1. 0.6 mL% 2.5 trifloroasetik asit su ekleyerek üst yüzey ve quench sindirim reaksiyonu çıkarın.
2. Üreticinin talimatlarına göre C18 ZipTips (Millipore, Billerica, MA) ile söndürülür reaksiyon ürünü arındırın.
3. DI su son hacim 100 mL örnek saflaştırılmış seyreltilir.

Bölüm 6: Kütle Spektrometresi

1. Tandem kütle spektrometre evlendirilen bir nano-HPLC işlenmiş örnek değerlendirin. Burada kullanılan HPLC sistemi Eksigent Teknolojileri ve bir tuzak sütun (3 mm çap. C18 boncuk, 150 mikron ID x 2,5 cm) ve bir ters-faz ayrılması sütun (3 mikron çap ile donatılmıştır. C18 boncuk, 75 mikron ID x 15 cm). Burada kullanılan kütle spektrometresi Thermo Fisher Scientific bir LTQ.
2. % 5 su asetonitril oluşan bir mobil faz 2 mcL örnek 5μL/min tuzak sütun üzerine yükleyin. 0.5μL/min az% 20 asetonitrilden 25 dk% 80 asetonitril doğrusal bir degrade kullanarak ters faz sütun örnek ayırın. Başka bir 10 dakika süreyle% 80 asetonitril çalıştırmaya devam edin.
3. Tandem kütle spektrometresi sütun salınımlı bantları analiz edin. Burada bildirilen çalışma, Eluent NewObjective nanoelectrospray yayıcı (20 mikron ID 10 mikron ID konik) ile kütle spektrometresi örneklenir.
4. SEQUEST gibi bir veritabanı programı kullanılarak örnek proteinler belirleyin. Bu çalışmada, biz Bioworks v3.01 (Thermo Fisher Scientific) dahil SEQUEST sürümünü tespit proteinler 1.0E-03 daha az olasılık puanları (99.9% güven aralığı eşdeğer), ve az bir sıra coverages en az 30% (Şekil 4).

Şekil 1 (a) Bir resim, bir DMF cihaz, otomatik damlacık kumanda için 40-pin konnektörler çiftleş. (B) bir cihaz şematik bir örnek ve proteomik tetkikleri için gerekli reaktiflerin konumlandırma tasvir.

Şekil 2 bir film. Çerçeveler% 20 TCA (Yağışlı) ve 70/30% kloroform / asetonitril (çözüm durulayın) otomatik ekstraksiyon ve saflaştırma BSA tasvir. 6 çerçeve, çöktürülmüş protein 100 mM amonyum bikarbonat bir damlacık çözünene.

Şekil 3 sıralı azaltma, alkilleme ve protein resolubilized bir damlacık sindirimi gösteren bir film Çerçeveler. Bu rakam, reaktifler netlik için boya ile renkli, pratikte, reaktifler renkli değildir.

Şekil 4 dijital Mikroakiskan tarafından işlenmiş sığır serum albümini bir örnek MS kromatogram. 25 farklı peptidler bir dizi kapsama karşılık% 44 (% 99.9 güven aralığı) tespit edilmiştir.

Discussion

Proteomik standart numune alma ve işleme eksikliği alan için önemli bir sınırlama yoktur. Buna ek olarak, geleneksel macroscale numune alma, örnek kaybı ve kirlenmeye yol açabilecek birden fazla kaplar ve çözüm transferleri içerir. Bu sorunlara olası bir çözüm, dijital ^{Mikroakiskan 1} (DMF) dayanarak örnek işleme için entegre sistemler oluşturmaktır . Önceki çalışmada, DMF heterojen istenmeyen kirleticiler verimli çıkarılması protein içeren solüsyonlar için yararlı olduğu gösterilmiştir. Aynı şekilde ^2, DMF entegre bir adımlı çözüm faz işleme entegrasyonu (azaltma, alkilleme ve sindirim) ile uyumlu olduğu gösterilmiştir cihaz. Burada ^3, çözüm aşaması işleme ile takip yağış protein çıkarılması için otomatik damlacık kontrolü ile tam entegre bir sistemi ortaya koymuştur. Bu gibi yöntemler yaygın olarak kabul edilmiştir, insan hatası proteomik örnek işleme doğasında büyük ölçüde daha iyi tekrarlanabilirlik analizlerde elimine edilebilir olduğunu speküle. Kısacası, koşullar tam da dünyanın herhangi bir laboratuvar çoğaltılamaz DMF, uygulamaların geniş bir kesiti için faydalı olmak için bir potansiyele sahip olduğunu öneriyoruz.