स्वचालित प्रोटिओमिक प्रसंस्करण के लिए डिजिटल Microfluidics

Summary

बिजली क्षेत्र के अनुप्रयोग द्वारा इलेक्ट्रोड की एक सरणी पर - डिजिटल Microfluidics एक तकनीक असतत बूंदों (एमएल ~ nl) के हेरफेर की विशेषता है. यह अच्छी तरह से बाहर तेजी से, अनुक्रमिक, छोटी स्वचालित जैव रासायनिक assays ले जाने के लिए अनुकूल है. यहाँ, हम एक कई प्रोटिओमिक प्रसंस्करण कदम को स्वचालित करने में सक्षम मंच की रिपोर्ट.

Abstract

नैदानिक ​​प्रोटिओमिक्स एक महत्वपूर्ण नए अनुशासन के रूप में उभरा है, biomarkers कि जल्दी और रोग के निदान रोग का निदान के लिए उपयोगी हो जाएगा की खोज का वादा. जबकि नैदानिक ​​प्रोटिओमिक तरीकों व्यापक रूप से भिन्न है, एक आम लक्षण (i) के अत्यंत विषम तरल पदार्थ (यानी सीरम, पूरे रक्त, आदि) और (ii) व्यापक जैव रासायनिक विश्लेषण करने के लिए पहले प्रसंस्करण से प्रोटीन की निकासी के लिए की जरूरत है. यहाँ, हम एक नए डिजिटल (DMF) आधारित विधि microfluidics कई प्रसंस्करण नैदानिक ​​प्रोटिओमिक्स में प्रयुक्त कदम एकीकृत रिपोर्ट. यह प्रोटीन निष्कर्षण, resolubilization, कमी, alkylation और enzymatic पाचन शामिल हैं. डिजिटल microfluidics एक microscale तरल पदार्थ से निपटने तकनीक है जिसमें nanoliter microliter आकार बूंदों एक खुली सतह पर चालाकी से कर रहे हैं. बूंदों इलेक्ट्रोड है कि एक ढांकता हुआ परत से लेपित हैं की एक सरणी के शीर्ष पर तैनात कर रहे हैं - जब एक बिजली के संभावित छोटी बूंद के लिए लागू किया जाता है, आरोप ढांकता हुआ की दोनों तरफ जमा. आरोप electrostatic संभालती है कि छोटी बूंद स्थिति को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में सेवा करते हैं, और श्रृंखला में इलेक्ट्रोड की एक अनुक्रम biasing के द्वारा, बूंदों के बग़ैर, ले जाने के लिए, मर्ज, मिश्रण, और सतह पर विभाजित करने के लिए बनाया जा सकता है है. इसलिए, DMF तेजी से, अनुक्रमिक, multistep, छोटी स्वचालित जैव रासायनिक assays ले जाने के लिए एक प्राकृतिक फिट है. यह पारंपरिक तरीकों (पुस्तिका pipetting या रोबोट पर निर्भर) में एक महत्वपूर्ण अग्रिम का प्रतिनिधित्व करता है, और नैदानिक ​​प्रोटिओमिक्स में एक उपयोगी नए उपकरण होने की संभावना है.

Mais जे Jebrail, Vivienne एन Luk, और स्टीव सीसी Shih इस काम के लिए समान रूप से योगदान दिया.

सर्जियो रास Freire वर्तमान पते फिलाडेल्फिया में विज्ञान विश्वविद्यालय में स्थित 600 दक्षिण 43 स्ट्रीट, फिलाडेल्फिया, फिलीस्तीनी अथॉरिटी 19104 पर है.

Protocol

भाग 1: डिवाइस निर्माण

1. पिरान्हा समाधान में स्वच्छ ग्लास substrates (03:01 सान्द्र सल्फ्यूरिक एसिड: 30% हाइड्रोजन पेरोक्साइड). पिरान्हा समाधान के लिए लगातार आंदोलन के साथ 10 मिनट में substrates छोड़ो.
2. विआयनीकृत जल (डीआई) में rinsing और N ₂ गैस के साथ substrates के सुखाने के बाद, क्रोमियम बयान (250 एनएम मोटाई) के लिए इलेक्ट्रॉन बीम कक्ष के अंदर substrates जगह है.
3. क्रोमियम लेपित सब्सट्रेट निर्जलीकरण, isopropanol में कुल्ला और फिर 115 में 5 मिनट के लिए एक गर्म थाली पर सेंकना डिग्री सेल्सियस
4. स्पिन कोटिंग (एस 30, 3000 आरपीएम) द्वारा substrates और hexamethyldisilazane (HMDS) के साथ प्रधानमंत्री सूखी. फिर Shipley S1811 photoresist के साथ स्पिन कोट (समान मापदंडों का उपयोग).
5. पूर्व सेंकना गर्म एक प्लेट (100 डिग्री सेल्सियस, 2 मिनट) पर सब्सट्रेट, तो पैटर्न photomask के माध्यम से 5 एस के लिए पराबैंगनी (यूवी) विकिरण के लिए जोखिम द्वारा photoresist.
6. Shipley 3 और डि पानी में मिनट धोने के लिए म्यूचुअल फंड 321 डेवलपर में यूवी उजागर substrates का विकास. 100 पर एक गर्म थाली पर पोस्ट सेंकना ° 1 मिनट के लिए सी.
7. नक़्क़ाशी एस के लिए 30 क्रोमियम etchant में डुबो द्वारा उजागर क्रोमियम डि पानी में कुल्ला, तो 10 मिनट के लिए AZ300T छंटक में विसर्जित करने के लिए शेष photoresist हटायें. डि पानी में कुल्ला और सूखी N ₂ गैस के साथ .
8. जमा एक सब्सट्रेट क्रोमियम नमूनों असर पर 2-5 सुक्ष्ममापी बयान रासायनिक वाष्प द्वारा Parylene सी (एक इन्सुलेट बहुलक). Teflon वायुसेना के 50 एनएम (सतह हाइड्रोफोबिक बनाने) 60 एस के लिए स्पिन कोटिंग 2000 rpm पर एक समाधान (1% wt / Fluorinert में wt FC-40) द्वारा जमा गर्म एक प्लेट (160 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट) पर पोस्ट सेंकना.
9. शीर्ष प्लेट फार्म, कोट एक संयुक्त राष्ट्र के नमूनों ईण्डीयुम टिन (आईटीओ) ऑक्साइड ग्लास substrates 50 एनएम Teflon वायुसेना, जैसा कि ऊपर.
10. पोस्ट सेंकना गर्म एक प्लेट (160 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट) पर दोनों substrates.

भाग 2: डिवाइस सेट अप और स्वचालन

1. "दो प्लेट" विन्यास में संचालित डिजिटल microfluidic उपकरणों में, ¹ बूंदों नीचे सब्सट्रेट (नमूनों इलेक्ट्रोड के साथ) और एक शीर्ष सब्सट्रेट (एक सन्निहित, पारदर्शी इलेक्ट्रोड, आमतौर पर इतो से गठन के साथ) के बीच तैनात हैं.
2. डिवाइस सेट अप, एक स्केलपेल के साथ कोमल scraping द्वारा नीचे सब्सट्रेट के संपर्क पैड से बहुलक कोटिंग्स हटा दें. दम्पत्ति 40 पिन connectors (चित्रा 1a) के साथ नीचे सब्सट्रेट के पैड उजागर.
3. पावर पर चल रहे कंप्यूटर (नेशनल इंस्ट्रूमेंट्स, ऑस्टिन, TX) LabVIEW, एक घर बनाया नियंत्रण बॉक्स (उच्च वोल्टेज रिले के एक सरणी है कि नेशनल इंस्ट्रूमेंट्स DaqPad से संकेत द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं विशेषता), एक समारोह जनरेटर, और एक एम्पलीफायर . / कंप्यूटर नियंत्रण बॉक्स 100 वी _RMS / 18 40 पिन connectors के माध्यम से डिवाइस kHz संकेतों के आवेदन पर उपयोगकर्ता नियंत्रण की सुविधा है.
4. नीचे सब्सट्रेट के किनारों पर डबल पक्षीय टेप के दो टुकड़े (140 सुक्ष्ममापी कुल मोटाई) की स्थिति के द्वारा युक्ति इकट्ठा और unpatterned इतो स्लाइड्स (ऊपर थाली) के साथ पूरा करें.
5. नियंत्रण प्रणाली को इनिशियलाइज़ करने के लिए, LabVIEW अंशांकन (घर में लिखित) कार्यक्रम के लिए प्रतिक्रिया नियंत्रण जांचना चलाते हैं.
6. लोड उपयुक्त जलाशयों (3 अनुभाग में, नीचे देखें) में नमूना और अभिकर्मकों और उन्हें शीर्ष सब्सट्रेट (Teflon लेपित पक्ष नीचे का सामना करना पड़ रहा) के तहत बंद हैं. जमीन संबंधक ऊपर सब्सट्रेट करने के लिए संलग्न.
7. लोड LabVIEW में actuation कोड (घर में लिखित) और छोटी बूंद actuation आरंभ करने के लिए कार्यक्रम पर अमल करें.

भाग 3: नमूना और अभिकर्मक तैयार

1. 100 मिमी (7.8 पीएच) TrisHCl और 0.08% Pluronic F127 w / v.: काम (पश्चिम बंगाल) बफर तैयार
2. प्रोटीन (ओं) 1 डिवाइस पर (आर -1) जलाशय में पश्चिम बंगाल और विंदुक नमूना में विश्लेषण किया जा भंग, के रूप में चित्रा 1b में दिखाया गया है.
3. R-2 में तेज़, डि पानी में 20% Trichloroacetic एसिड (TCA), और विंदुक तैयार.
4. बफर धोने के लिए तैयार, 70/30 / क्लोरोफॉर्म (ACN) acetonitrile और विंदुक आर 4 में.
5. R-5 में resolubilizing बफर, 100 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट (पीएच 8.0) और 0.08% Pluronic F127 w / ध्, और विंदुक तैयार करें.
6. पश्चिम बंगाल और विंदुक में 10 मिमी पर reductant, (2 carboxyethyl) tris phosphine (TCEP), R-6 में भंग.
7. Alkylating एजेंट iodoacetamide (आई ए एम), पश्चिम बंगाल और विंदुक में 12 मिमी पर R-7 में भंग.
8. पश्चिम बंगाल में कुल प्रोटीन नमूना एकाग्रता (3.1 से ऊपर, देखें) और विंदुक के to1 / 5 R-8 में बराबर एकाग्रता भंग trypsin.

भाग 4: डिजिटल Microfluidic नमूना प्रसंस्करण

1. निम्न कार्यविधि LabVIEW कोड का मतलब घर में लिखा द्वारा स्वचालित रूप से कार्यान्वित किया जाता है. जलाशयों से तिरस्कृत बूंदों की मात्रा इलेक्ट्रोड (इस मामले में, तिरस्कृत बूंदों ~ 600nL) के आयाम के द्वारा परिभाषित किया गया है.
2. R-1 से प्रोटीन युक्त नमूने की एक छोटी बूंद और आर 2 (चित्रा 2, फ़्रेम 1) से तेज़ की एक छोटी बूंद बग़ैर. दो बूंदों मर्ज और संयुक्त छोटी बूंद 5 मिनट के लिए सेते हैं, जनसंपर्क की वर्षा में जिसके परिणामस्वरूप की अनुमतिसतह पर oteins (चित्रा 2, 2-3 फ्रेम्स). सतह पर तैरनेवाला उपजी प्रोटीन से दूर बेकार जलाशय, आर 3 (2 चित्रा, फ़्रेम 4) उकसाना.
3. R-4 से धो बफर के तीन बूंदों बांटना और उपजी प्रोटीन भर में उन्हें बर्बाद जलाशय, आर 3 (2 चित्रा, फ़्रेम 5) करने के लिए ड्राइव.
4. वेग शुष्क करने की अनुमति दें, और R-5 से प्रोटीन resolubilizing बफर की एक छोटी बूंद के बग़ैर. 20 मिनट के लिए बफर सेते हैं जब तक वेग (2 चित्रा, फ़्रेम 6) को भंग कर दिया है की अनुमति दें.
5. R-6 से reductant की एक छोटी बूंद बांटना और यह नमूना छोटी बूंद के साथ विलय. 6 इलेक्ट्रोड भर में यह एक परिपत्र पैटर्न में actuating द्वारा संयुक्त छोटी बूंद मिलाएं. छोटी बूंद एक humidified कक्ष में (चित्रा 3, 1-2 फ्रेम्स) कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते करने की अनुमति दें.
6. R-7 से एजेंट alkylating की एक छोटी बूंद बांटना और यह नमूना छोटी बूंद, मिश्रण (4.5 में) द्वारा पीछा के साथ विलय. छोटी बूंद एक humidified कक्ष में कमरे के तापमान पर 15 मिनट, प्रकाश से सुरक्षित (चित्रा 3, 2-3 फ्रेम्स) के लिए सेते करने की अनुमति दें.
7. R-8 से trypsin की एक छोटी बूंद बांटना, और यह नमूना छोटी बूंद, मिश्रण (4.5 में) द्वारा पीछा के साथ विलय. छोटी बूंद 37 पर 3 घंटे के लिए सेते ° C एक गर्म थाली पर एक humidified चैम्बर (चित्रा 3, 3-4 फ्रेम्स) में की अनुमति दें.

भाग 5: के बाद प्रसंस्करण नमूना तैयार

1. पानी में 2.5% की trifluoroacetic एसिड की 0.6 एमएल जोड़कर शीर्ष सब्सट्रेट और बुझाना पाचन प्रतिक्रिया निकालें.
2. बुझती प्रतिक्रिया उत्पाद निर्माता के निर्देशों के अनुसार C18 ZipTips (Millipore, Billerica, MA) का उपयोग कर शुद्ध.
3. 100 एमएल की एक अंतिम मात्रा डि पानी में नमूना शुद्ध पतला.

भाग 6: मास स्पेक्ट्रोमेट्री

1. नैनो HPLC पर संसाधित नमूना एक अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमीटर के लिए mated का मूल्यांकन. HPLC प्रणाली यहां इस्तेमाल किया Eksigent टेक्नोलॉजीज में से एक है और एक जाल (3 मिमी व्यास C18 मोती, 150 सुक्ष्ममापी ID x 2.5 सेमी.) स्तंभ और एक उलट चरण जुदाई (3 सुक्ष्ममापी व्यास स्तंभ के साथ सुसज्जित है C18 मोती, 75 सुक्ष्ममापी आईडी एक्स. 15 सेमी). मास स्पेक्ट्रोमीटर यहाँ प्रयोग किया जाता एक LTQ थर्मो फिशर साइंटिफिक से है.
2. 5μL/min पर जाल स्तंभ पर एक मोबाइल पानी में 5% acetonitrile शामिल चरण में एक 2 μL नमूना लोड. उलट 0.5μL/min चरण स्तंभ में 20% acetonitrile से 25 मिनट से अधिक 80% acetonitrile एक रैखिक ढाल का उपयोग पर नमूना अलग करें. एक और 10 मिनट के लिए 80% acetonitrile पर चल रहा है जारी रखें.
3. अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा eluting स्तंभ बैंड विश्लेषण. में काम यहाँ की सूचना दी, eluent NewObjective से nanoelectrospray emitter (20 सुक्ष्ममापी 10 सुक्ष्ममापी आईडी पतला आईडी) के माध्यम से मास स्पेक्ट्रोमीटर में नमूना है.
4. एक डेटाबेस खोज SEQUEST के रूप में इस तरह के कार्यक्रम का उपयोग कर नमूने में प्रोटीन की पहचान. इस काम में, हम Bioworks v3.01 (वैज्ञानिक थर्मो फिशर) में शामिल SEQUEST के संस्करण का उपयोग किया है, और पहचान प्रोटीन की संभावना 1.0E-03 की तुलना में कम स्कोर (99.9% विश्वास अंतराल के बराबर), और पर के अनुक्रम कवरेज था कम से कम 30% (चित्रा 4).

चित्रा 1 (क) एक तस्वीर स्वचालित छोटी बूंद actuation के लिए 40 पिन connectors के लिए एक DMF डिवाइस mated. (ख) एक डिवाइस का एक योजनाबद्ध नमूना और एक प्रोटिओमिक workup के लिए आवश्यक अभिकर्मकों की स्थिति का चित्रण है.

एक फिल्म से चित्रा 2 फ्रेम्स स्वचालित और 20% (तेज़) TCA और 70/30% क्लोरोफॉर्म / acetonitrile (कुल्ला समाधान) में BSA के शुद्धि निकासी चित्रण. 6 फ्रेम में, 100 मिमी अमोनियम बिकारबोनिट की एक छोटी बूंद में उपजी प्रोटीन redissolved है.

चित्रा 3 एक अनुक्रमिक कमी, alkylation और resolubilized प्रोटीन की एक छोटी बूंद के पाचन illustrating फिल्म से फ्रेम्स. यह आंकड़ा अभिकर्मकों स्पष्टता के लिए रंगों के साथ रंगीन कर रहे हैं, व्यवहार में, अभिकर्मकों रंग नहीं हैं.

चित्रा 4. गोजातीय सीरम albumin डिजिटल microfluidics द्वारा संसाधित की एक नमूना के एमएस chromatogram. 25 अलग पेप्टाइड्स की (99.9% विश्वास अंतराल) की पहचान की गई 44% की एक अनुक्रम कवरेज इसी.

Discussion

मानकीकृत नमूना हैंडलिंग और प्रोटिओमिक्स में प्रसंस्करण की कमी क्षेत्र के लिए एक प्रमुख सीमा है. इसके अलावा, पारंपरिक macroscale नमूना हैंडलिंग कई कंटेनरों और समाधान स्थानान्तरण है, जो घटाने और संदूषण नमूना नेतृत्व कर सकते हैं शामिल है. इन समस्याओं के लिए एक संभावित हल करने के लिए ^{नमूना} डिजिटल microfluidics 1 (DMF) पर भरोसा प्रसंस्करण के लिए एकीकृत प्रणाली के रूप में है. पिछले काम में, DMF विषम में अवांछित contaminants के कुशल हटाने प्रोटीन युक्त समाधान के लिए उपयोगी होना दिखाया गया था इसी ^तरह 2, DMF के लिए एक एकीकृत multistep प्रसंस्करण समाधान चरण के एकीकरण के (कमी alkylation, और पाचन) के साथ संगत होना दिखाया गया था. युक्ति ³ यहाँ, हम प्रोटीन निकासी के लिए वर्षा द्वारा स्वचालित छोटी बूंद नियंत्रण समाधान चरण प्रसंस्करण द्वारा पीछा के साथ एक पूरी तरह से एकीकृत प्रणाली का प्रदर्शन किया है. हम सोचते हैं कि अगर इस तरह के रूप में इन तरीकों का व्यापक रूप से अपनाया जाता है, प्रोटिओमिक नमूना प्रसंस्करण में निहित मानव त्रुटि काफी हद तक हो सकता है, समाप्त किया जा बेहतर reproducibility के साथ विश्लेषण में जिसके परिणामस्वरूप. संक्षेप में, हम प्रस्ताव है कि DMF आवेदनों की एक व्यापक पार अनुभाग के लिए उपयोगी होने के लिए क्षमता है, के रूप में स्थिति ठीक दुनिया में किसी भी प्रयोगशाला में दोहराया जा सकता है.