Microfluídica digitales para el procesamiento automatizado de Proteómica

Summary

Microfluídica digital es una técnica caracterizada por la manipulación de las gotas discretas (~ NL - mL) en una matriz de electrodos en la aplicación de campos eléctricos. Es muy adecuado para llevar a cabo rápida y secuencial, en miniatura ensayos bioquímicos automatizados. Aquí, se presenta una plataforma capaz de automatizar varios pasos de procesamiento de proteómica.

Abstract

Proteómica clínica se ha convertido en una disciplina nueva e importante, con la promesa del descubrimiento de biomarcadores que sean útiles para el diagnóstico precoz y pronóstico de la enfermedad. Mientras que los métodos de proteómica clínica varían mucho, la característica común es la necesidad de (i) la extracción de proteínas a partir de los líquidos extremadamente heterogénea (es decir, suero, sangre, etc) y (ii) procesos de transformación extensiva bioquímicos antes del análisis. Aquí, se presenta un nuevo microfluídica digital (DMF) método basado en la integración de varios pasos de procesamiento utilizadas en proteómica clínica. Esto incluye la extracción de proteínas, resolubilization, reducción, alquilación y digestión enzimática. Digital microfluídica es un micro manejo de fluidos técnica en la cual las gotas de nanolitros microlitros de tamaño se manipulan en una superficie abierta. Las gotas se colocan en la parte superior de una matriz de electrodos que están recubiertas por una capa dieléctrica - cuando un potencial eléctrico se aplica a la gota, los cargos se acumulan a ambos lados del dieléctrico. Los cargos de servir como maneja electrostática que se pueden utilizar para controlar la posición de las gotas y por sesgar una serie de electrodos en serie, las gotas se pueden hacer para dispensar, mover, unir, mezclar y dividir en la superficie. Por lo tanto, DMF es un ajuste natural para la realización rápida de varios pasos secuenciales, ensayos bioquímicos en miniatura automática. Esto representa un avance significativo sobre los métodos convencionales (basándose en pipeteo manual o robots), y tiene el potencial de ser una herramienta útil en la nueva proteómica clínica.

Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk, y Steve CC Shih contribuyeron igualmente a este trabajo.

Dirección actual Sergio LS Freire es de la Universidad de las Ciencias en Filadelfia ubicado en el 600 Sur de la Calle 43, Philadelphia, PA 19104.

Protocol

Parte 1: Fabricación de dispositivos

1. Sustratos de vidrio limpio en una solución Piranha (3:1 ácido sulfúrico concentrado:. 30% de peróxido de hidrógeno). Deja los sustratos en la solución Piranha durante 10 minutos con agitación frecuente.
2. Después de enjuagar en agua desionizada (DI) y el secado de los sustratos con N ₂ gas, colocar los soportes en el interior de la cámara de haz de electrones para la deposición de cromo (espesor de 250 nm).
3. Para deshidratar el sustrato recubierto de cromo, enjuague con isopropanol y luego hornear en una placa caliente durante 5 minutos a 115 ° C.
4. Seque los sustratos e imprima con hexametildisilazano (HMDS) por spin-coating (30 s, 3000 rpm). Spin-abrigo de nuevo (con parámetros idénticos) con Shipley S1811 fotosensible.
5. Pre-hornear el sustrato en un plato caliente (100 ° C, 2 min), entonces el patrón fotosensible por la exposición a los rayos ultravioleta (UV) durante 5 s a través de una fotomáscara.
6. Desarrollar los sustratos UV-expuestos en Shipley MF 321 desarrolladores durante 3 minutos y lavar con agua DI. Después de cocer al horno en un plato caliente a 100 ° C durante 1 min.
7. Grabar el cromo expuestos por inmersión en cromo grabador durante 30 s. Enjuague con agua DI, a continuación, sumergirse en removedor AZ300T durante 10 minutos para eliminar el resto de fotosensible. Enjuague con agua y secar con DI N ₂ gas.
8. Depósito de 2.5 micras Parileno-C (un aislante de polímero) por deposición química de vapor en una relación sustrato patrón de cromo. Depósito de 50 nm de teflón-AF (para hacer la superficie hidrofóbica) por una solución de spin-coating (1% p / p en Fluorinert FC-40) a 2000 rpm durante 60 s. Después de cocer al horno en un plato caliente (160 ° C, 10 min).
9. Para formar la placa superior, una capa. Sin patrón indio de óxido de estaño (ITO) sustratos de vidrio de 50 nm de teflón AF, como el anterior
10. Después de cocer ambos sustratos en un plato caliente (160 ° C, 10 min).

Parte 2: Dispositivo de Configuración y Automatización

1. En los dispositivos digitales de microfluidos funciona en "dos placas" de configuración, ^una gotas se sitúan entre un sustrato de fondo (con electrodos de patrones) y un sustrato superior (con un electrodo contiguos, transparente, normalmente formado por ITO).
2. Para configurar el dispositivo, retire los recubrimientos de polímeros de las almohadillas de contacto de un sustrato de fondo raspando suavemente con un bisturí. Par de la exposición de las pastillas de substrato del fondo con 40 pines (Figura 1a).
3. Energía en un equipo con LabView (National Instruments, Austin, TX), una casa construida caja de control (con una serie de relés de alto voltaje que son controlados por las señales de un DAQPad National Instruments), un generador de funciones, y un amplificador . La caja del equipo / control facilita el control del usuario sobre la aplicación de 100 V _RMS / 18 kHz señales al dispositivo a través de los conectores de 40 pines.
4. Montar el dispositivo mediante la colocación de dos piezas de cinta de doble cara (140 micras de espesor total) en los bordes del substrato del fondo y completa con diapositivas sin patrón ITO (placa superior).
5. Para inicializar el sistema de control, ejecute el programa de calibración LabView (escrito en casa) para calibrar el control de retroalimentación.
6. Cargue la muestra y los reactivos en los depósitos adecuados (véase la sección 3, abajo) y escríbalos en la parte superior del sustrato (con revestimiento de teflón lado que mira hacia abajo). Conecte el conector de tierra en el sustrato superior.
7. Cargar el código de activación en LabView (escrito en casa) y ejecutar el programa para iniciar la actuación de las gotas.

Parte 3: Preparación de la muestra y el reactivo

1. Prepare el buffer de trabajo (WB): 100 mm TrisHCl (pH 7,8) y 0,08% Pluronic F127 w / v.
2. Disolver la proteína (s) para ser analizados en la muestra del Banco Mundial y la pipeta en el depósito 1 (R-1) en el dispositivo, como se muestra en la Figura 1b.
3. Preparar ácido precipitante, el 20% tricloroacético (TCA) en agua DI, y la pipeta en R-2.
4. Prepare el tampón de lavado, 70/30 cloroformo / acetonitrilo (ACN) y pipetear en R-4.
5. Prepare el buffer de resolubilizing, 100 mM de bicarbonato de amonio (pH 8,0) y 0,08% Pluronic F127 w / v, y la pipeta en R-5.
6. Disolver tris reductor, (2-carboxietil) fosfina (TCEP), a 10 mM en el Banco Mundial y la pipeta en R-6.
7. Disolver agente alquilante, yodoacetamida (IAM), de 12 mm en el Banco Mundial y la pipeta en R-7.
8. Disolver la tripsina en el Banco Mundial a una concentración igual a 1 / 5 de la concentración de la muestra de proteína total (véase el apartado 3.1, arriba) y una pipeta en R-8.

Parte 4: Procesamiento Digital de la muestra de microfluidos

1. El siguiente procedimiento se lleva a cabo automáticamente por medio de código de LabVIEW escrito en casa. El volumen de las gotas de prescindir de los embalses está definido por las dimensiones de los electrodos (en este caso, las gotas son dispensados ​​~ 600nL).
2. Prescindir de una gota de proteínas que contiene la muestra de R-1 y una gota de precipitación a partir de R-2 (Figura 2, Cuadro 1). Combinar las dos gotas y permitir que la gota se combinaron para incubar durante 5 min, lo que resulta en la precipitación de los proteins sobre la superficie (Figura 2, Marcos 02.03). Accionar el sobrenadante lejos de la proteína precipitada al depósito de residuos, R-3 (Figura 2, Cuadro 4).
3. Prescindir de tres gotas de solución de lavado de R-4 y llevarlos al otro lado de la proteína precipitada al depósito de residuos, R-3 (Figura 2, Cuadro 5).
4. Permitir que el precipitado se seca, y aplique una gota de tampón resolubilizing de R-5 a la proteína. Deje que el buffer de incubación durante 20 minutos hasta que el precipitado se haya disuelto (Figura 2, Cuadro 6).
5. Prescindir de una gota de reductor de R-6 y fusionarla con la gota de la muestra. Mezclar la gota combinada de accionamiento que a través de 6 electrodos en un patrón circular. Permitir que la gota se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente en una cámara húmeda (Figura 3, Marcos 02.01).
6. Prescindir de una gota de alquilante del R-7 y fusionarla con la gota de la muestra, seguido de la mezcla (como en 4.5). Permitir que la gota se incuba durante 15 min a temperatura ambiente en una cámara húmeda, protegido de la luz (Figura 3, Marcos 03.02).
7. Prescindir de una gota de la tripsina de la I-8, y fusionarla con la gota de la muestra, seguido de la mezcla (como en 4.5). Permitir que la gota se incuba durante 3 horas a 37 ° C en una cámara húmeda en una placa caliente (Figura 3, Marcos 04.03).

Parte 5: Post-proceso de preparación de la muestra

1. Quitar sustrato superior y la reacción de digestión apagar mediante la adición de 0,6 ml de 2,5% de ácido trifluoroacético en agua.
2. Purificar el producto de reacción apagado utilizando ZipTips C18 (Millipore, Billerica, MA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
3. Diluir la muestra en agua purificada DI a un volumen final de 100 ml.

Parte 6: Espectrometría de Masas

1. Evaluar las muestras procesadas en un nano-HPLC acoplado a un espectrómetro de masas en tándem. El sistema HPLC utilizado es de Tecnologías de la Eksigent y está equipado con una columna de la trampa (3 mm de diámetro. Perlas de C18, 150 ID m x 2,5 cm) y una columna de separación en fase reversa (3 micras de diámetro. Perlas de C18, 75 m x ID 15 cm). El espectrómetro de masas se utiliza aquí es un LTQ de Thermo Fisher Scientific-.
2. Cargar una muestra de 2 l en la columna de la trampa en 5μL/min en una fase móvil que contiene 5% de acetonitrilo en agua. Separar la muestra en la columna de fase inversa en 0.5μL/min utilizando un gradiente lineal del 20% de acetonitrilo a acetonitrilo 80% más de 25 min. Continuar funcionando en acetonitrilo al 80% durante otros 10 minutos.
3. Analizar las bandas de elución de la columna por espectrometría de masas en tándem. En el trabajo aquí, el eluyente se recogen en el espectrómetro de masas a través de un emisor Nanoelectrospray (20 micras ID cónico de ID m 10) de NewObjective.
4. Identificar las proteínas en la muestra usando un programa de búsqueda de bases de datos tales como SEQUEST. En este trabajo se utilizó la versión de SEQUEST incorporado en BioWorks v3.01 (Thermo Fisher Scientific-), y las proteínas identificadas tenían puntuaciones de probabilidad de menos del 1,0 E-03 (equivalente al 99,9% intervalo de confianza), y la secuencia de las coberturas en por lo menos el 30% (Figura 4).

Figura 1. (A) La imagen de un dispositivo acoplado a DMF de 40 pines para el accionamiento automático de gota. (B) un esquema de un dispositivo que muestra el posicionamiento de la muestra y los reactivos necesarios para una serie de análisis proteómico.

Marcos Figura 2. A partir de una película que muestra la extracción automatizada y la purificación de la BSA en el 20% de TCA (precipitación) y acetonitrilo 70/30% de cloroformo / (solución de enjuague). En el marco de 6, la proteína precipitada se disolvió de nuevo en una gota de bicarbonato de amonio 100 mM.

Figura 3. Fotogramas de una película que ilustra la reducción secuencial, alquilación, y la digestión de una gota de proteína resolubilizado. En esta figura, los reactivos son coloreados con tintes de claridad, en la práctica, los reactivos no son de colores.

Figura 4. MS cromatograma de una muestra de albúmina sérica bovina procesada por microfluídica digital. 25 péptidos distintos fueron identificados (99,9% intervalo de confianza) correspondiente a una secuencia de la cobertura del 44%.

Discussion

La falta de manejo de las muestras estandarizadas y el procesamiento de la proteómica es una limitación importante para el campo. Además, el manejo convencional de la muestra macroescala implica varios contenedores y las transferencias de solución, que puede conducir a la pérdida de muestra y la contaminación. Una posible solución a estos problemas es la formación de sistemas integrados para el procesamiento de las muestras dependen de microfluidos digitales ¹ (DMF). En trabajos anteriores, DMF ha demostrado ser útil para la eliminación eficiente de contaminantes no deseados en la heterogénea de proteínas que contienen las soluciones. ^{2 Del} mismo modo, el DMF ha demostrado ser compatible con la integración de varios pasos solución en fase de procesamiento (reducción, alquilación y la digestión) en un sistema integrado de dispositivo. ³ Aquí, hemos demostrado que un sistema completamente integrado con control de gota automatizado para la extracción de proteínas por precipitación seguido de solución de procesamiento de fase. Los autores especulan que si los métodos de este tipo son ampliamente adoptado, el error inherente al ser humano en el procesamiento de las muestras de proteómica puede ser eliminado en gran medida, lo que resulta en un mejor análisis de la reproducibilidad. En resumen, proponemos que la DMF tiene el potencial de ser útil para una amplia sección transversal de las aplicaciones, ya que las condiciones pueden ser precisamente a cabo en cualquier laboratorio del mundo.