Digital Mikrofluidik för automatiserad proteomik Processing

Summary

Digital Mikrofluidik är en teknik som kännetecknas av manipulation av diskreta droppar (~ NL - mL) på en array av elektroder genom tillämpning av elektriska fält. Det är väl lämpad för att utföra snabba, sekventiell, miniatyriserade automatiserade biokemiska analyser. Här redovisar vi en plattform som kan automatisera flera proteomik processteg.

Abstract

Klinisk proteomik har vuxit fram som en viktig ny disciplin, lovande upptäckten av biomarkörer som kommer att vara användbar för tidig diagnos och prognos av sjukdomen. Medan klinisk proteomik metoder varierar kraftigt, är ett gemensamt drag behovet av (i) utvinning av proteiner från extremt heterogena vätskor (dvs. serum, helblod, etc.) och (ii) en omfattande biokemisk behandling före analys. Här redovisar vi en ny digital mikrofluidik (DMF) baserad metod som flera processteg används i klinisk proteomik. Detta inkluderar protein utvinning, resolubilization, minskning, alkylering och enzymatisk spjälkning. Digital mikrofluidik är en mikroskala fluid-hantering teknik där metod i nanoliter-mikroliter stora droppar är manipulerade på en öppen yta. Droppar är placerad på toppen av en matris av elektroder som är belagda med ett dielektriskt skikt - när en elektrisk potential tillämpas på droppen, avgifter samlas på vardera sidan av dielektrikum. Avgifterna utgör elektrostatisk handtag som kan användas för att styra droppsmitta position, och genom förspänns en sekvens av elektroder i serien, kan droppar göras för att avstå, flytta, slå ihop, blanda och dela på ytan. Därför är DMF en naturlig plats för att genomföra en snabb, sekventiell, flerstegsprocess, miniatyriserade automatiserade biokemiska analyser. Detta är ett stort framsteg jämfört med konventionella metoder (att förlita sig på manuell pipettering eller robotar) och har potential att vara ett användbart nytt verktyg i klinisk proteomik.

Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk, och Steve CC Shih bidragit lika för detta arbete.

Sergio LS Freire nuvarande adress är University of the Sciences i Philadelphia ligger på 600 South 43:e Street, Philadelphia, PA 19104.

Protocol

Del 1: Komponentframställning

1. Rengör glas substrat i Piranha-lösning (3:1 konc svavelsyra:. 30% väteperoxid). Lämna substrat i Piranha lösningen i 10 min med täta agitation.
2. Efter sköljning i avjoniserat (DI) vatten och torkning av substrat med N _2-gas, placera substraten inne i elektronstrålen kammare för krom deponering (tjocklek av 250 nm).
3. Att torka av krom-belagda substrat, skölj i isopropanol och sedan baka på en värmeplatta i 5 min vid 115 ° C.
4. Torka av substrat och Grunda med hexamethyldisilazane (HMDS) genom spin-beläggning (30 s, 3000 rpm). Spin-päls igen (med samma parametrar) med Shipley S1811 fotoresist.
5. Förgrädda underlaget på en värmeplatta (100 ° C, 2 min), då mönstret fotoresist av exponering för ultraviolett (UV) strålning i 5 s via en fotomask.
6. Utveckla UV-exponerade substrat i Shipley MF 321 utvecklare för 3 min och tvätta i DI-vatten. Post-baka på en värmeplatta vid 100 ° C i 1 min.
7. Etsa exponerad krom genom att sänka ner i krom ETCHANT i 30 s. Skölj i DI vatten och sedan doppa i AZ300T strippa i 10 minuter för att ta bort de kvarvarande fotoresist. Skölj i DI vatten och torka med N ₂ gas.
8. Deposition 2-5 ìm Parylen-C (ett isolerande polymer) genom kemisk förångning på ett substrat med mönstrad krom. Deposition 50 nm av teflon-AF (för att göra ytan hydrofob) genom spin-beläggning en lösning (1% vikt / vikt i Fluorinert FC-40) vid 2000 rpm i 60 s. Post-baka på en värmeplatta (160 ° C, 10 min).
9. Att bilda topplattan, päls en FN-mönstrade indiumtennoxid (ITO) glasunderlag 50 nm Teflon-AF, enligt ovan.
10. Post-baka både substrat på en värmeplatta (160 ° C, 10 min).

Del 2: Enhet Set-up och Automation

1. I digitala mikroflödessystem enheter drivs i "två-tallrik" konfiguration, är ^ett droppar placerade mellan ett bottensubstrat (med mönstrade elektroder) och en topp substrat (med en sammanhängande, öppen elektrod, vanligtvis bildas från ITO).
2. Vill att enheten upp, ta bort polymerskikt från kontakten kuddar av ett bottensubstrat genom att försiktigt skrapa med en skalpell. Par den exponerade kuddar av bottensubstratet med 40-stiftskontakter (Figur 1a).
3. Ström på en dator med LabView (National Instruments, Austin, TX), en hembyggda kontroll box (med en matris av högspänd reläer som styrs av signaler från en National Instruments DaqPad), en funktion generator och en förstärkare . Datorn / styrenhet till användarnas kontroll över tillämpningen av ₁₀₀ volt / 18 signaler kHz till enheten via 40-stifts kontaktdon.
4. Montera enheten genom att placera två bitar av dubbelhäftande tejp (140 ìm totala tjocklek) på kanterna av bottensubstratet och komplett med omönstrad ITO diabilder (topplattan).
5. För att initiera styrsystemet, kör LabView kalibrering programmet (skrivet i-huset) för att kalibrera återkopplade reglersystem.
6. Ladda provet och reagens i lämpliga behållare (se avsnitt 3 nedan) och bifoga dem under Top grundmaterial (teflonbelagd nedåt). Fäst marken kontakten till toppen underlaget.
7. Ladda igångsättning koden i LabVIEW (skriven in-house) och kör programmet för att initiera droppe aktivering.

Del 3: Prov och Reagensberedning

1. Förbered arbetar buffert (WB): 100 mm TrisHCl (pH 7,8) och 0,08% Pluronic F127 w / v.
2. Lös protein (er) som skall analyseras i WB och pipettera provet i reservoaren 1 (R-1) på enheten som visas i Figur 1b.
3. Förbered fällningsmedel, 20% triklorättiksyra (TCA) i DI-vatten, och pipettera till R-2.
4. Förbered tvättbuffert, 70/30 kloroform / acetonitril (ACN) och pipettera till R-4.
5. Förbered resolubilizing buffert, 100 mm Bikarbonatlösning (pH 8,0) och 0,08% Pluronic F127 w / v, och pipettera till R-5.
6. Lös reduktionsmedel, tris (2-carboxyethyl) fosfin (TCEP), vid 10 mm i WB och pipett till R-6.
7. Lös alkylerare, iodoacetamide (IAM), vid 12 mm i WB och pipett till R-7.
8. Lös trypsin i WB vid en koncentration lika till1 / 5 av koncentrationen av det totala proteinet urvalet (se 3.1 ovan) och pipettera till R-8.

Del 4: Digital Mikroflödessystem provbearbetning

1. Följande procedur genomförs automatiskt med hjälp av LabView kod skriven i egen regi. Volymen av droppar doseras från reservoarer definieras av dimensioner elektroder (i detta fall, dispenseras dropparna ~ 600nL).
2. Tillsätt en droppe av protein som innehåller prov från R-1 och en droppe fällningsmedel från R-2 (Figur 2, bildruta 1). Slå ihop de två droppar och låt den kombinerade droppen att inkubera i 5 min, vilket resulterar i utfällning av proteins på ytan (figur 2, Ramar 2-3). Aktivera supernatanten bort från fälls protein för att det avfall som reservoar, R-3 (figur 2, Frame 4).
3. Tillsätt tre droppar av tvättbuffert från R-4 och kör dem över fälls protein för att det avfall som reservoar, R-3 (figur 2, Frame 5).
4. Låt fällningen torka, och lämna ut en droppe resolubilizing buffert från R-5 till proteinet. Låt buffert för att inkubera i 20 minuter tills fällningen har lösts upp (Figur 2, Frame 6).
5. Tillsätt en droppe reduktionsmedel från R-6 och slå samman den med provet droppen. Blanda den kombinerade droppen genom aktivering det över 6 elektroder i ett cirkulärt mönster. Låt droppen att inkubera i 1 timme i rumstemperatur i en fuktig kammare (Figur 3, Ramar 1-2).
6. Tillsätt en droppe alkylerare från R-7 och slå samman den med provet droppe, följt av blandning (som i 4.5). Låt droppen att inkubera i 15 min i rumstemperatur i en fuktig kammare, skyddas mot ljus (Figur 3, Ramar 2-3).
7. Tillsätt en droppe av trypsin från R-8, och slå samman den med provet droppe, följt av blandning (som i 4.5). Låt droppen att inkubera i 3 h vid 37 ° C i en fuktig kammare på en värmeplatta (Figur 3, Ramar 3-4).

Del 5: efterbearbetning Provberedning

1. Ta bort toppen substrat och släcka matsmältningen reaktionen genom att tillsätta 0,6 ml 2,5% trifluorättiksyra i vatten.
2. Rena kylda reaktionsprodukt med hjälp av C18 ZipTips (Millipore, Billerica, MA) enligt tillverkarens anvisningar.
3. Späd renade provet i DI vatten till en slutlig volym av 100 ml.

Del 6: masspektrometri

1. Utvärdera den bearbetade prov på en nano-HPLC parat sig till en tandem masspektrometer. HPLC-system som används här är från Eksigent Technologies och är utrustad med en fälla kolumn (3 mm dia. C18 pärlor, 150 ìm ID x 2,5 cm) och en omvänd fas separering kolumn (3 ìm diam. C18 pärlor, 75 ìm ID x 15 cm). En masspektrometer som används här är en LTQ från Thermo-Fisher Scientific.
2. Ladda en 2 mikroliter prov på fällan kolonnen vid 5μL/min i en mobil fas bestående av 5% acetonitril i vatten. Separata provet på omvänd fas kolonnen vid 0.5μL/min hjälp av en linjär gradient från 20% acetonitril till 80% acetonitril över 25 min. Fortsätt kör på 80% acetonitril i ytterligare 10 min.
3. Analysera banden eluerande från kolonnen med tandem masspektrometri. I arbetet redovisas här är eluenten samlas upp i masspektrometern via en nanoelectrospray sändare (20 ìm ID sjunkit till 10 mikrometer-ID) från NewObjective.
4. Identifiera proteiner i provet med ett program databassökning som SEQUEST. I detta arbete använde vi den version av SEQUEST ingår i Bioworks v3.01 (Thermo-Fisher Scientific), och identifierat proteinerna hade sannolikheten poäng på mindre än 1,0 E-03 (motsvarande 99,9% konfidensintervall), och omfattningar sekvens på minst 30% (Figur 4).

Figur 1. (A) En bild en DMF enhet paras med 40-stiftskontakter för automatiserad droppe aktivering. (B) En schematisk av en enhet som skildrar placering av prov och reagenser som krävs för en proteomik workup.

Figur 2. Bildrutor från en film som skildrar den automatiserade extraktion och rening av BSA i 20% TCA (fällningsmedel) och 70/30% kloroform / acetonitril (skölj lösning). I ram 6, är det fälls proteinet lösts upp igen i en droppe på 100 mm ammoniumbikarbonat.

Figur 3. Bildrutor från en film som illustrerar sekventiell minskning, alkylering och rötning av en droppe resolubilized protein. I denna figur är de reagenser färgade med färgämnen för klarhet, i praktiken, reagenser är inte färgad.

Figur 4. MS kromatogram av ett urval av bovint serumalbumin bearbetas av digitala mikrofluidik. 25 olika peptider identifierades (99,9% konfidensintervall) motsvarande en sekvens täckning av 44%.

Discussion

Bristen på standardiserade prov hantering och bearbetning inom proteomik är en stor begränsning för fältet. Dessutom innebär konventionella makroskala provhantering flera containrar och överföringar lösning, vilket kan leda till prov förlust och föroreningar. En möjlig lösning på dessa problem är att skapa integrerade system för provbearbetning att förlita sig på digital mikrofluidik ¹ (DMF). I tidigare arbete, var DMF visat sig vara användbart för effektiv borttagning av oönskade ämnen i heterogena protein-lösningar. ² Likaså var DMF visat sig vara kompatibel med integration av flerstegsprocess lösning-fas bearbetning (minskning, alkylering och matsmältning) på ett integrerat enhet. ³ Här har vi visat ett helt integrerat system med automatisk droppe kontroll för protein utvinning genom fällning följt av lösning-fas bearbetning. Vi spekulerar att om metoder som dessa är allmänt antagits, kan den mänskliga fel inneboende i proteomik provbearbetning stor del elimineras, vilket resulterar i analyser med bättre reproducerbarhet. I korthet föreslår vi att DMF har potential för att vara användbar för ett brett tvärsnitt av ansökningar villkoren kan bli exakt dupliceras på alla laboratorier i världen.