Summary
Isolatie van postimplantatie-stage embryo's maakt het mogelijk om genen patronen te bestuderen en cel-afkomst besluitvorming tijdens de embryonale ontwikkeling te analyseren, maar een goede dissectie van het vroege embryo kan een uitdaging zijn. Dit protocol beschrijft een methode voor het isoleren van vroege primitieve-streep-stadium embryo's (~ 6,5 dagen na de coitum [DPC]).
Abstract
Analyse van genexpressie patronen tijdens de vroege stadia van de embryonale ontwikkeling van zoogdieren kan belangrijke aanwijzingen over genfunctie, cel-cel interactie en signaleren mechanismen die leiden embryonale patronen. Echter, dissectie van de muis embryo van de decidua kort na de implantatie een uitdagende procedure, en gedetailleerde stap-voor-stap documentatie van dit proces ontbreekt.
Hier laten we zien hoe de post-implantatie (6,5 dpc) embryo's worden geïsoleerd door eerst het ontleden van de baarmoeder van een zwangere muis (detectie van de vaginale plug was aangewezen dag 0,5 poist coitum) en vervolgens ontleden van het embryo uit het maternale decidua. De ontleding van membraan Reichert is beschreven, evenals de verwijdering van de ectoplacental kegel.
Protocol
Dissectie van de voortplantingsorganen van een vrouwelijke muis
- Drachtige dieren worden gedood door de CO 2 stikken met behulp van samengeperst gas.
- Leg het dier rugligging op absorberend kussen en laat deze in 70% ethanol om het risico van besmetting van de dissectie met de muis haar te verminderen.
- Knijp de huid en maakt een kleine incisie aan de laterale middellijn met regelmatige chirurgische schaar. Houd de huid stevig vast boven en onder de incisie en uit elkaar te trekken van de huid in de richting van het hoofd en staart naar de buik bloot te leggen.
- Pak het buikvlies met een tang en snijd de buikholte bloot te leggen.
- Zoek de voortplantingsorganen in het dorsale gebied van de lichaamsholte: twee baarmoeder hoorns, de eileider en de eierstokken.
Primitieve Streak-fase (6.5 dpc) Dissection
- Verwijder de baarmoeder hoorn van de baarmoeder vast te pakken onder de eileider en snijd het gratis langs de mesometrium. Plaats ontleed baarmoeder in ijskoud PBS.
Figuur 1 - Scheid elk embryo door te snijden tussen de implantatie plaatsen langs de baarmoeder hoorn.
Figuur 2 - Pak de gespierde baarmoederslijmvlies door te schuiven horlogemakerij pincet tussen de omringende spierlaag en gehuld decidua weefsel. Trek de spierlaag, het blootstellen van de decidua.
Figuur 3 - Knip een deel van de blootgestelde decidua aan de top (ongeveer 1 / 5 van de decidua weefsel) die de midventral of distale tip van de bijgevoegde embryo bloot te leggen.
Figuur 4 - Het embryo kan worden beschoten met behulp van de tips van de tang. Doorboren van de decidua met een tang rond de embryo en open tang uit elkaar scheuren decidua.
Figuur 5 - Zodra embryo wordt verwijderd, kan Reichart membraan nog steeds zo goed zijn bevestigd als de ectoplacental kegel (trofoblast). Het embryo kan verder worden ontleed door zorgvuldige dissectie.
Figuur 6
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Postimplantatie in de muis optreedt tussen 4,5 dpc en geboorte. Deze dissectie methode kan worden toegepast, in hoofdzaak zoals beschreven, om eerder of later stadium embryo's te isoleren op 5,5-8,5 DPC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Dissecting Forceps serrated, straight | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5130 | 2 pairs |
| Micro Dissecting Tweezers Pattern #55 INOX | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5010 | 2 pairs |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1x) | Reagent | Invitrogen | 14190 | |
| Fisherbrand Sterile Polysytrene Petri Dish | Tool | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Reagent | |||
| Straight Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Tool | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Pregnant female mice | Animal | |||
| Dissecting Microscope | Microscope |
References
- Nagy, A., et al. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual third edition. , Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York. (2003).
