Dissection von 6,5 dpc muriner Embryonen

Summary

Isolation der Einnistung-Embryonen erlaubt es, Gen-Mustern zu studieren und zu analysieren Zell-Linie Entscheidungsprozesse während der embryonalen Entwicklung, aber richtigen Zergliederung des frühen Embryos kann schwierig sein. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von Anfang primitive-Streifen-Embryonen (~ 6,5 Tage post coitum [DPC]).

Abstract

Die Analyse der Genexpression während der frühen Stadien der embryonalen Entwicklung von Säugetieren kann wichtige Hinweise auf die Funktion von Genen, Zell-Zell-Interaktion und Signalisierung Mechanismen, die Führung embryonalen Musterbildung. Allerdings kann Dissektion der Maus-Embryo aus der Dezidua kurz nach der Implantation eine herausfordernde Prozedur sein, und detaillierte Schritt-für-Schritt-Dokumentation dieses Prozesses fehlt.

Hier zeigen wir, wie nach der Implantation (6,5 DPC) Embryonen, indem Sie zuerst Sezieren der Gebärmutter einer schwangeren Maus (Erkennung des vaginalen Stecker wurde als Tag 0,5 Poist coitum) und anschließend seziert der Embryo vom mütterlichen Dezidua isoliert sind. Die Zerlegung der Reichert-Membran ist ebenso wie die Entfernung der ectoplacental Kegel beschrieben.

Protocol

Dissection der Geschlechtsorgane aus einer weiblichen Maus

1. Trächtige Tiere werden durch CO ₂ Ersticken mit Druckgas eingeschläfert.
2. Legen Sie das Tier in Rückenlage auf saugfähige Unterlage und legen Sie ihn in 70% Ethanol, um das Risiko einer Kontamination der Präparation mit Maus Haare zu reduzieren.
3. Pinch die Haut und machen Sie einen kleinen seitlichen Einschnitt an der Mittellinie mit regelmäßigen chirurgische Scheren. Halten Sie die Haut fest oberhalb und unterhalb des Schnittes und ziehen die Haut auseinander auf den Kopf und Schwanz auf den Bauch freizulegen.
4. Fassen Sie das Bauchfell mit einer Pinzette und schneiden in die Bauchhöhle aussetzen.
5. Suchen Sie die Fortpflanzungsorgane im dorsalen Bereich der Leibeshöhle: zwei Uterushörner, der Eileiter und der Eierstöcke.

Primitive Streak-Bühne (6,5 DPC) Dissection

1. Entfernen Sie die Uterushorn durch Ergreifen der Gebärmutter unter der Eileiter und schneiden Sie es kostenlos an der Mesometrium. Legen Sie seziert Gebärmutter in eiskaltem PBS.
   
   
   
   Abbildung 1
   
   
2. Trennen Sie die einzelnen Embryo, indem zwischen Nidationsstellen entlang Uterushorn.
   
   
   
   Abbildung 2
   
   
   
3. Fassen Sie den muskulösen Gebärmutterschleimhaut, indem Uhrmacher-Pinzette zwischen den umgebenden Muskulatur und hüllte decidua Gewebe. Ziehen Sie die Muskelschicht, Freilegung der decidua.
   
   
   
   Abbildung 3
   
   
4. Clip aus einem Teil der exponierten decidua an der Spitze (ca. 1 / 5 der Dezidua Gewebe), die die midventral oder distalen Spitze des geschlossenen Embryo ausgesetzt wird.
   
   
   
   Abbildung 4
   
   
5. Der Embryo kann berappt mit den Spitzen der Pinzette. Pierce der Dezidua mit einer Pinzette um den Embryo und offenen Pinzette decidua zerreißen.
   
   
   
   Abbildung 5
   
   
6. Sobald Embryo entfernt wird, kann Reichart-Membran noch ebenso wie die ectoplacental Kegel (Trophoblast) angebracht werden. Der Embryo kann durch sorgfältige Präparation seziert werden.
   
   
   Abbildung 6
   

Discussion

Einnistung in der Maus tritt zwischen 4,5 DPC und Geburt. Diese Zerlegung Verfahren kann angewendet werden, im wesentlichen wie beschrieben, werden früher oder später zu isolieren Embryonen bei 5,5-8,5 dpc.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Micro Dissecting Forceps serrated, straight	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5130	2 pairs
Micro Dissecting Tweezers Pattern #55 INOX	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5010	2 pairs
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1x)	Reagent	Invitrogen	14190
Fisherbrand Sterile Polysytrene Petri Dish	Tool	Fisher Scientific	08-757-12
4% Paraformaldehyde in PBS	Reagent
Straight Sharp-Pointed Dissecting Scissors	Tool	Fisher Scientific	08-940
Pregnant female mice	Animal
Dissecting Microscope	Microscope