Summary
בידוד של postimplantation בשלב עוברי מאפשר ללמוד דפוסים גן ולנתח התא השושלת תהליכי קבלת ההחלטות במהלך ההתפתחות העוברית, אבל לנתיחה תקין של העובר מוקדם יכול להיות מאתגר. פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד מוקדם פס פרימיטיבי, בשלב עוברי (~ 6.5 ימים הודעה coitum [DPC]).
Abstract
ניתוח דפוסי ביטוי גנים במהלך השלבים המוקדמים של ההתפתחות העוברית יונקים יכולים לספק רמזים חשובים על תפקוד אינטראקציה גן תאים תאים, מנגנוני איתות כי דפוסים מדריך עובריים. עם זאת, דיסקציה של העובר עכבר decidua זמן קצר אחרי ההשתלה יכול להיות הליך מאתגר, ותיעוד מפורט צעד אחר צעד של תהליך זה הוא חסר.
כאן אנו מדגימים כיצד שלאחר ההשתלה (6.5 DPC) עוברים מבודדים תחילה לנתח את הרחם של עכבר בהריון (זיהוי של coitum את התקע הנרתיק יועד 0.5 poist יום) ולאחר מכן לנתח את העובר מן decidua אימהית. דיסקציה של הממברנה של רייכרט מתואר כמו גם הסרה של חרוט ectoplacental.
Protocol
Dissection של איברי הרבייה של העכבר נקבה
- חיות בהריון מומתים בחנק CO 2 באמצעות גז דחוס.
- הנח את פרקדן בעלי חיים על משטח סופג ולטבול אותו אתנול 70% כדי להפחית את הסיכון של זיהום דיסקציה עם שיער העכבר.
- לצבוט את העור לעשות חתך לרוחב קטן קו האמצע עם מספריים כירורגי רגיל. מתחי את העור היטב מעל ומתחת החתך ומושכים את העור כלפי חוץ הראש והזנב לחשוף את הבטן.
- אחוז הצפק עם מלקחיים ולחתוך לחשוף את חלל הבטן.
- אתר את איברי הרבייה באזור הגבי של חלל הגוף: שתי קרניים הרחם, oviduct ואת השחלות.
Streak בשלב פרימיטיבי (6.5 DPC) Dissection
- הסר את קרן הרחם ידי אחיזה הרחם להלן oviduct ופצע אותו בחינם יחד mesometrium. המקום הרחם גזור בקרח קר PBS.
איור 1 - הפרד העובר על ידי חיתוך בין אתרים ההשתלה יחד קרן הרחם.
איור 2 - תפוס את רירית הרחם שרירים ידי הזזה מלקחיים של שען בין שכבת השריר שמסביב רקמת decidua אפוף. מקלפים את שכבת השריר האחורי, חשיפת decidua.
איור 3 - קליפ את חלק decidua נחשף בפסגת (כ 1 / 5 של הרקמה decidua) אשר יחשוף את קצה midventral או דיסטלי של העובר סגורה.
איור 4 - העובר יכול להיות הפגיזו מחוץ באמצעות קצות מלקחיים. פירס decidua עם מלקחיים המקיפים את העובר ואת מלקחיים לפתוח decidua לקרוע לגזרים.
איור 5 - לאחר העובר מוסר, קרום של רייכרט, עדיין עשויים להיות מצורפים, כמו גם חרוט ectoplacental (trophoblast). העובר יכול להיות גזור נוספת על ידי דיסקציה זהירה.
איור 6
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Postimplantation בעכבר מתרחשת בין 4.5 DPC והלידה. שיטה זו דיסקציה יכול להיות מיושם, למעשה כמתואר, כדי לבודד מוקדם או מאוחר יותר עוברים לשלב ב 5.5-8.5 DPC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
Micro Dissecting Forceps serrated, straight | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5130 | 2 pairs |
Micro Dissecting Tweezers Pattern #55 INOX | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5010 | 2 pairs |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1x) | Reagent | Invitrogen | 14190 | |
Fisherbrand Sterile Polysytrene Petri Dish | Tool | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
4% Paraformaldehyde in PBS | Reagent | |||
Straight Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Tool | Fisher Scientific | 08-940 | |
Pregnant female mice | Animal | |||
Dissecting Microscope | Microscope |
References
- Nagy, A., et al. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual third edition. , Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York. (2003).