Summary
Isolamento di post-impianto di embrioni allo stadio permette di studiare e analizzare patterning gene cellulari lignaggio processi decisionali durante lo sviluppo embrionale, ma corretta dissezione dell'embrione precoce può essere difficile. Questo protocollo descrive un metodo per isolare primi primitivo-striscia-stadio embrioni (~ 6,5 giorni post coitum [dpc]).
Abstract
Analisi dei modelli di espressione genica durante le prime fasi di sviluppo embrionale dei mammiferi in grado di fornire importanti indizi circa la funzione del gene, l'interazione cellula-cellula e meccanismi di segnalazione che patterning guida embrionale. Tuttavia, la dissezione dell'embrione mouse dal decidua poco dopo l'impianto può essere un procedimento impegnativo e dettagliato passo-passo la documentazione di questo processo è carente.
Qui mostriamo come post-impianto (6,5 DPC) sono isolate da embrioni prima dissezione nell'utero di un topo gravide (rilevamento del tappo vaginale è stato designato giorni 0,5 coitum poist) e poi sezionare l'embrione da decidua materna. La dissezione della membrana Reichert è descritto così come la rimozione del cono ectoplacental.
Protocol
Dissezione di organi riproduttivi di un topo femmina
- Animali gravidi sono eutanasia da CO 2 asfissia con gas compresso.
- L'animale giaceva supino sul tampone assorbente e immergerlo in etanolo al 70% per ridurre il rischio di contaminare la dissezione con i capelli del mouse.
- Pizzicare la pelle e fare una piccola incisione laterale alla linea mediana con regolare forbici chirurgiche. Tenere la pelle saldamente sopra e sotto l'incisione e tirare la pelle a parte verso la testa e la coda per esporre l'addome.
- Afferrare il peritoneo con una pinza e taglio per esporre la cavità addominale.
- Individuare gli organi riproduttivi nella regione dorsale della cavità del corpo: due corna uterine, l'ovidotto e le ovaie.
Primitivo Streak stadi (6,5 DPC) Dissection
- Rimuovere il corno uterino afferrando l'utero al di sotto del ovidotto e tagliarlo libero lungo il mesometrium. Luogo utero sezionato in ghiaccio PBS freddo.
Figura 1 - Separare ogni embrione, tagliando tra siti d'impianto lungo corno uterino.
Figura 2 - Afferrare il rivestimento uterino muscolare facendo scorrere orologiaio pinza tra lo strato muscolare e il tessuto circostante decidua avvolto. Staccare lo strato muscolare, esponendo il decidua.
Figura 3 - Clip di una porzione della decidua esposti al vertice (circa 1 / 5 del tessuto decidua), che esporrà la punta midventral o distale dell'embrione racchiuso.
Figura 4 - L'embrione può essere sborsato con le punte delle pinze. Pierce decidua con una pinza che circonda l'embrione e pinze aperto a strappare decidua a parte.
Figura 5 - Una volta embrione viene rimosso, membrana Reichart può essere ancora attaccato così come il cono ectoplacental (trofoblasto). L'embrione può essere ulteriormente sezionato da dissezione accurata.
Figura 6
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Discussion
Post-impianto nel topo si verifica tra 4,5 dpc e la nascita. Questo metodo può essere applicato dissezione, essenzialmente come descritto, per isolare prima o dopo gli embrioni scena al 5,5-8,5 dpc.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Dissecting Forceps serrated, straight | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5130 | 2 pairs |
| Micro Dissecting Tweezers Pattern #55 INOX | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5010 | 2 pairs |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1x) | Reagent | Invitrogen | 14190 | |
| Fisherbrand Sterile Polysytrene Petri Dish | Tool | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Reagent | |||
| Straight Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Tool | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Pregnant female mice | Animal | |||
| Dissecting Microscope | Microscope |
References
- Nagy, A., et al. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual third edition. , Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York. (2003).
