Summary
Isolamento de pós-implantação de embriões em estágio permite uma padronização para estudar e analisar genes de células de linhagem processos de decisão durante o desenvolvimento embrionário, mas dissecção adequada do embrião em estágio inicial pode ser um desafio. Este protocolo descreve um método para isolar muito primitiva raia-estágio-embriões (~ 6,5 dias pós coitum [dpc]).
Abstract
Análise dos padrões de expressão genética durante as fases iniciais do desenvolvimento embrionário de mamíferos pode fornecer pistas importantes sobre a interação gene função, célula-célula e mecanismos de sinalização que patterning guia embrionárias. No entanto, a dissecção do embrião de rato a partir da decídua, pouco após o implante pode ser um processo desafiador, e documentação passo-a-passo detalhado desse processo é inexistente.
Aqui demonstramos como pós-implantação (6,5 dpc) embriões são isolados pela primeira dissecando o útero de um rato grávidas (detecção do plug vaginal foi designado coitum poist dias 0,5) e, posteriormente, dissecando o embrião da decídua materna. A dissecção da membrana Reichert é descrito, bem como a remoção do cone ectoplacental.
Protocol
Dissecação de órgãos reprodutivos de uma fêmea
- As fêmeas grávidas são sacrificados por asfixia CO 2, utilizando gás comprimido.
- Coloque o animal em decúbito dorsal almofada absorvente e mergulhe-o em etanol 70% para reduzir o risco de contaminação a dissecção com cabelo mouse.
- Aperte a pele e fazer uma pequena incisão lateral na linha média com tesouras cirúrgicas regulares. Segure a pele firmemente acima e abaixo da incisão e puxar a pele para além em direção à cabeça e cauda para expor o abdômen.
- Segure o peritônio com uma pinça e corte para expor a cavidade abdominal.
- Localize os órgãos reprodutivos na região dorsal da cavidade do corpo: dois cornos uterinos, o oviduto e os ovários.
Primitive Streak estágio Dissection (6,5 dpc)
- Remover o corno uterino, segurando o útero abaixo do oviduto e cortá-la livre ao longo da mesométrio. Lugar útero dissecado em PBS gelado.
Figura 1 - Separe cada embrião cortando entre locais de implantação ao longo corno uterino.
Figura 2 - Segure o revestimento muscular uterina, deslizando forceps relojoeiro entre a camada muscular circunvizinho e do tecido envolvido decídua. Retire a camada muscular, expondo a decídua.
Figura 3 - Clipe de fora de uma parcela da decídua expostas no ápice (aproximadamente 1 / 5 do tecido decídua), que irá expor a ponta midventral ou distal do embrião fechado.
Figura 4 - O embrião pode ser descascado, utilizando as pontas de uma pinça. Pierce a decídua com uma pinça em torno do embrião e uma pinça aberta a lágrima decidua distante.
Figura 5 - Uma vez que embrião é removido, a membrana Reichart ainda pode ser anexado, bem como o cone ectoplacental (trofoblasto). O embrião pode ser dissecada ainda por dissecção cuidadosa.
Figura 6
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Discussion
Pós-implantação em ratos ocorre entre 4,5 dpc e nascimento. Este método de dissecação pode ser aplicada, essencialmente como descrito, para isolar mais cedo ou mais tarde embriões em estágio 5,5-8,5 dpc.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Dissecting Forceps serrated, straight | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5130 | 2 pairs |
| Micro Dissecting Tweezers Pattern #55 INOX | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5010 | 2 pairs |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1x) | Reagent | Invitrogen | 14190 | |
| Fisherbrand Sterile Polysytrene Petri Dish | Tool | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Reagent | |||
| Straight Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Tool | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Pregnant female mice | Animal | |||
| Dissecting Microscope | Microscope |
References
- Nagy, A., et al. Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual third edition. , Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York. (2003).
