Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Microvolume تحديد تركيز البروتين باستخدام 2000c NanoDrop الطيف

doi: 10.3791/1610 Published: November 4, 2009

Summary

وكميا عينات Microvolume بواسطة نظام يستخدم معمل الطبيعية التوتر السطحي للاحتفاظ عينات من دون استخدام cuvettes أو الشعيرات الدموية. وزيادة كبيرة في مجموعة ديناميكية من تركيزات البروتين والسرعة التي يمكن قياسها مع هذا الأسلوب.

Abstract

القياس الطيفي التقليدية يتطلب وضع العينات في cuvettes أو الشعيرات الدموية. هذا هو في كثير من الأحيان غير عملي نظرا لحجم عينة محدودة غالبا ما تستخدم لتحليل البروتين. العلمية الحرارية NanoDrop 2000c الطيف يحل هذه المشكلة مع نظام العينة الاحتفاظ المبتكرة التي تحمل عينات microvolume بين السطوح اثنين باستخدام قياس خصائص التوتر السطحي للسوائل ، مما يمكن القياس الكمي للعينات في أحجام منخفضة تصل إلى 0،5-2 ميكرولتر. التخلص من الشعيرات الدموية يسمح cuvettes أو التغييرات في الوقت الحقيقي في طول الطريق ، مما يقلل من الوقت مع زيادة كبيرة قياس دينامية مجموعة من تركيزات البروتين التي يمكن قياسها. يتم القضاء أيضا على الحاجة إلى التخفيفات ، والاستعدادات لتقدير حجم العينة هي سهلة نسبيا حيث يمكن قياس السطوح محو ببساطة مع مختبر المسح. هذا المقال يعرض الفيديو تعديلات على الطرق التقليدية لتحديد تركيز البروتين الكمي لكميات من البروتين microvolume باستخدام قراءات الامتصاصية A280 أو مقايسة اللونية BCA.

Protocol

أولا : 2000c NanoDrop الطيف

ويستند NanoDrop التكنولوجيا على نظام العينة الاحتفاظ المبتكرة التي تستخدم التوتر السطحي لعقد وقياس العينات microvolume بين اثنين من الركائز البصرية من دون استخدام cuvettes أو الشعيرات الدموية. و2000c NanoDrop معمل يستخدم هذه التقنية بسرعة وسهولة قياس 0،5-2 قطرات ميكرولتر من البروتينات والحمض النووي ، والجيش الملكي النيبالي ، والجزيئات الحيوية الأخرى. وقد أصبحت هذه القدرة أهمية متزايدة مع التقنيات الجزيئية تتطور باستمرار لاستخدام كميات صغيرة من المواد لتحليلها. المثل الأعلى للمعمل microvolume الظروف التي يقتصر العينة. ومع ذلك ، وسهولة الاستخدام ، ودورة سريعة والقياس ، واسعة النطاق تركز أيضا أن يجعل من مناسبة عندما معمل كميات وافرة من العينة المتاحة. هو أيضا دورة قياس تقلص إلى حد كبير ، مما يساعد العلماء في جميع أنحاء زيادة كفاءة سير العمل الخاصة بهم.

يتم وضع microsample مباشرة في أعلى سطح الكشف ويتم إنشاء عمود السائل بين طرفي الألياف الضوئية التوتر السطحي. هذا العمود السائل يشكل المسار الرأسي البصرية. وفلاش زينون مصباح يوفر مصدر الضوء واستخدام مطياف يستخدم مجموعة CCD الخطية لتحليل الضوء الذي يمر عبر العينة.

إزالة أجهزة الاحتواء التقليدية مثل cuvettes من نظام له مزايا عدة : هناك حاجة لكميات صغيرة جدا من العينة للقياس ، ويتطلب تنظيف ببساطة مسح السطوح البصرية مع مختبر المسح ، ويمكن أن يتغير طول المسار في الوقت الحقيقي أثناء القياس.

و2000c NanoDrop يحدد طول المسار الأمثل تلقائيا (1 ملم إلى 0.05 ملم) ، وتوفير مجموعة واسعة أكثر من ممكن قياسات تركيز البروتين دون التخفيفات. بتقصير طول المسار ، يمكن قياس تركيزات مرتفعة من البروتين. هذا فعال يزيل الحاجة إلى إجراء التخفيفات لمعظم عينات البروتين. على سبيل المثال ، يمكن لل2000c NanoDrop قياس تركيزات BSA تصل إلى 400 ملغ / مل.

و2000c NanoDrop الطيف هو معمل الطيف الكامل لقياس الامتصاصية من الحمض النووي ، والجيش الملكي النيبالي ، والبروتينات ، والجزيئات الحيوية الأخرى. وهذا البروتوكول الفيديو التركيز على قياس البروتينات.

II. Microvolume تحديد تركيز البروتين باستخدام قياسات امتصاص A280

أ. مبدأ القياسات A280

الأسلوب A280 البروتين ينطبق على تنقية البروتينات التي تحتوي ، التيروسين تريبتوفان ، فينيلالاناين مخلفات أو السندات ثاني كبريتيد سيستين سيستين ، ويحمل الامتصاصية عند 280 نانومتر. يستخدم هذا الأسلوب قيمة الامتصاصية A280 في تركيبة مع أي كتلة معامل الانقراض أو معامل الانقراض المولي لحساب تركيز البروتين النقي. ميزة قياسات A280 المباشر هو أن ليس مطلوبا من توليد منحنى القياسية لتحديد تركيز البروتين. إذا كانت العينة هو الحل البروتين uncharacterized ، lysate الخلية ، أو استخراج البروتين الخام ، ثم استخدام إحدى الطرق التي تم تكوينها مسبقا اللونية المتاحة على 2000/2000c NanoDrop ، مثل BCA ، بيرس 660 نانومتر ، وبرادفورد ، والمقايسات لوري ، هي الموصى بها.

ب. Microvolume البروتين قياسات A280 -- بدء التشغيل

  1. حدد التطبيق A280 البروتين من القائمة الرئيسية.
  2. تحديد نوع العينة المراد قياسها من القائمة المنسدلة. ينصح الإعداد الافتراضي لمعظم خلائط البروتين الذي غير معروف في عبس 1 = 1 ملغ / مل. إذا كان قياس البروتين المنقى يتميز سابقا ، قد دخلت بعد ذلك إما الانقراض الجماعي للمعامل أو المولي معامل الانقراض والوزن الجزيئي لتحديد تركيز البروتين بشكل أكثر دقة.
  3. اختيار وحدات التركيز من القائمة المنسدلة.

ج. قياسات Microvolume A280 البروتين -- تقطيع

  1. إنشاء فارغة باستخدام العازلة المناسبة. من المهم استخدام العازلة التي علقت البروتين. ينبغي أن تكون عازلة تستخدم نفس درجة الحموضة وجود قوة مماثلة الأيونية هو الحل العينة. ملاحظة : المخازن RIPA الامتصاصية تسهم كثيرا في 280 نانومتر ، وبالتالي فهي تتعارض مع القياسات المباشرة البروتين A280. عن البروتينات علقت في منطقة عازلة RIPA ، فمن المستحسن أن يتم تحديد تركيز البروتين باستخدام العازلة RIPA مقايسة اللونية متوافق.
  2. 2 ميكرولتر ماصة للتقطيع الحل المناسب على قاعدة التمثال أسفل ، وانخفاض الذراع وفوق فارغ.
  3. مسح حل فارغة من الركائز العليا والسفلى باستخدام المختبر الجاف محو.

د. قياسات Microvolume A280 قياس البروتين

اعتبارات هامة : إن تجانس العينة للغايةيتم قياس حجم مهم من هذا القبيل منذ الصغيرة. للتأكد من أن عينات متجانسة ، ولكن بلطف مزيج دقيق العينات فورا قبل أخذ قسامة للقياس. تجنب إدخال فقاعات عند خلط وpipetting.

بسبب التباين في حدة التوتر بين مختلف البروتينات السطحية ، نوصي التحميل 2 ميكرولتر من العينات المناسبة لضمان تشكيل العمود. دائما قلة استخدام ماصة نصائح الاحتفاظ بهم. لتحميل عينة ، تلمس طرف الماصة على السطح السفلي رمى الضوئية بينما طرد الحل لمنع حل من الالتزام من طرف خارج ماصة. طرد أقل من المبلغ الكامل لنموذج لمنع الانفجار وإدخال فقاعات في العينة.

  1. أدخل رقم العينة في الحقل المناسب ، تحميل 2 ميكرولتر من العينة الأولى كما هو موضح في قياس فارغة وانقر فوق موافق. وينبغي استخدام قسامة الطازجة 2μL من العينة لكل قياس.
  2. إزالة عينة من الركائز العليا والسفلى باستخدام المختبر الجاف محو.

ه. Microvolume البروتين A280 قياسات التنظيف

عادية ، خالية من الوبر ، والمختبرات القضاء في كثير من الأحيان ما يكفي لتنظيف الركائز البصرية بين القياسات.

ف. صنع البروتين A280 قياسات تجديد

قد تحتوي على حلول والكواشف السطحي uncondition السطوح رمى القياس على مر الزمن ، ومنع عمود السائل العينة إلى النموذج. وتسطيح الحبرية على أقل رمى يدل على السطح البصري تصبح دون شروط. إذا كان قد تم المساس خصائص السطح ، وتجديد والركائز مهم لضمان عينة تشكيل العمود. إذا كان هذا يحدث ، برتقالي السطوح البصرية باستخدام بقوة يمسح المختبر أو استخدام NanoDrop مجمع الركيزة تجديد (PR - 1) وفقا لتوجيهات.

III. Microvolume تحديد تركيز البروتين عن طريق فحوصات اللونية

أ. مبدأ الكشف اللونية

يمكن أيضا معمل 2000c NanoDrop يمكن استخدامها لقياس البروتين حلول uncharacterized ، lysates الخلية ، ومقتطفات من البروتين الخام باستخدام المقايسات اللونية.

الأساليب اللونية هي طرق غير المباشرة التي تنطوي على التفاعل مع صبغة البروتين المكون من العينة لانتاج المجمع الجديد الذي يمتص الضوء في النطاق الموجي مرئية.

في معمل 2000c NanoDrop ديها عدة فحوصات ما قبل تكوين اللونية بما BCA ، بيرس 660 ، برادفورد ، وأساليب لوري. وسوف أثبت الفحص BCA باعتبارها مقايسة المثال اللونية باستخدام معمل microvolume. (الصورة)

و(Bicinchoninic حمض) BCA مقايسة هو طريقة شائعة اللونية غالبا ما تستخدم لإيجاد حلول تخفف من البروتين والبروتينات في وجود مكونات الأشعة فوق البنفسجية التي لها كبير (280 نانومتر) الامتصاصية. خلافا للبروتين طريقة A280 ، الأسلوب BCA البروتين يتطلب أن يتم إنشاء منحنى قياسي قبل أن تتمكن من قياس تركيزات البروتين العينة.

الأسلوب يستخدم حمض bicinchoninic (BCA) ، والكاشف الكشف. يقاس كلاب النحاس ، BCA شكلت في وجود البروتين في 562 نانومتر ، وتطبيع في 750 نانومتر.

ب. Microvolume BCA الفحص الفحص BCA إعداد قياسات

  1. ترد الكواشف المطلوبة في الحد من عوامل عدة متوافقة (الحرارية القط بيرس العلمية لم 23250.) : BCA كاشف A ، B BCA كاشف ، كاشف التوافق ، العازلة إعادة إعماره ، والزلال (BSA) المعايير.
  2. يوازن جميع البروتينات غير معروفة ومعايير البروتين إلى درجة حرارة الغرفة وتخلط جيدا.
  3. يعد يكفي جديدة كاشف يعمل لحساب المعايير والعينات المراد قياسها باستخدام نسبة 50:1 من كاشف A : B
  4. لمقايسة الدقيقة ، واستخدام نسبة 1:1 من كاشف تعمل على العينة. أضف 10 ميكرولتر من العمل كاشف لكل أنبوب مع أنابيب كافية لتغطية جميع العينات والمعايير. لمقايسة عالية المدى ، واستخدام نسبة 20:01 من كاشف تعمل على العينة. إضافة 190 ميكرولتر من العمل كاشف لكل أنبوب مع أنابيب كافية لتغطية جميع العينات والمعايير. الرجوع إلى الأدب بيرس BCA عدة لتحديد النسبة التي هي مناسبة للعينات الخاصة بك.
  5. أضف 10 ميكرولتر من معيار أو نموذج يحتوي على كل أنبوب كاشف. مزيج جيد من قبل vortexing بلطف.
  6. احتضان الأنابيب في 37 دقيقة لمدة 30 درجة مئوية.
  7. السماح لردود الفعل للتوازن في درجة حرارة الغرفة (~ 10 دقيقة).

ج. قياسات Microvolume الفحص BCA توليد منحنى قياسي

  1. حدد أسلوب BCA البروتين من القائمة الرئيسية. إذا كان الطول الموجي يظهر إطار التحقق ، وضمان الذراع إلى الأسفل.
  2. أدخل القيم لكل تركيز القياسية في الجدول الجزء الأيسر. البرنامج يسمح للمرجعية وaddit تصل إلى 7IONAL المعايير. يجب أن تقاس مرجع و / أو معايير متماثلة في.
    ملاحظة : الحد الأدنى المطلوب لتوليد المنحنى هو معيار قياس معيارين أو قياس مستوى الصفر ، وإشارة واحدة على الأقل. فمن المستحسن أن يتم تضمين معايير إضافية حسب الضرورة لتغطية تركيز مقايسة المتوقع النطاق.
  3. إنشاء فارغة. غير منزوع الأيونات عموما فارغة لفحوصات اللونية H 2 O.
  4. ماصة 2 ميكرولتر من DH 2 O على قاعدة التمثال أسفل ، وانخفاض الذراع وفوق فارغ. واحد فقط فارغ اللازمة لتغطية جميع القياسات اللاحقة من المرجعية والمعايير.
  5. إنشاء إشارة pipetting a قسامة 2 ميكرولتر تحتوي على كاشف الوحيدة التي تعمل والعازلة مع عدم وجود بروتين على أقل رمى. انخفاض الذراع وقياس فوق.
  6. تحت علامة التبويب معايير ، تسليط الضوء على المعايير المطلوبة وماصة ميكرولتر 2 من المعيار المطلوب على أقل رمى. انخفاض الذراع وقياس فوق. تكرار هذه العملية لجميع المعايير. تأكد من قياس جميع المعايير السابقة لقياس العينات. انقر فوق عرض قياسي عرض المنحنى منحنى قياسي.

د. قياسات Microvolume الفحص BCA 2 قياسات البروتين ميكرولتر

  1. بعد أن تم قياس كل من المعايير ، انقر على زر العينات. أدخل رقم العينة. تحميل 2 ميكرولتر من العينة على الدنيا ورمى فوق القياس. وينبغي استخدام الطازجة 2 قسامة ميكرولتر من العينة لكل قياس.
  2. مسح عينة من الركائز العليا والسفلى باستخدام المختبر الجاف محو.

ه. قياسات Microvolume الفحص BCA تنظيف وتجديد

تنفيذ تنظيف وتجديد كما هو موضح في القياسات المباشرة الامتصاصية A280.

ممثل النتائج :

يتم تنفيذ Microvolume تحديد تركيز البروتين إما من خلال قياس A280 مباشرة أو غير مباشرة مقايسة اللونية. مثال قياس تركيز البروتين A280 يحدد على أساس معامل الانقراض من البروتين من الفائدة. على سبيل المثال الفحص اللونية BCA يحدد تركيز البروتين القائمة على منحنى مستوى تركيزات بروتين معروف.

Discussion

Microvolume الكميات يستخدم التوتر السطحي الجوهرية خصائص عينة لتشكيل العمود السائل قياس السطوح بين البلدين. غياب جهاز الاحتواء ، ويسمح طول الطريق إلى التغيير في الوقت الحقيقي ، والقضاء اساسا على الحاجة إلى إجراء التخفيفات. هذا يزيد بشكل كبير من قدرة دينامية مجموعة من تركيزات البروتين وكذلك سرعة القياس. باستخدام كميات ضئيلة من العينة ، يمكن تحليل عدد كبير من العينات بسرعة وبدقة ، مما يسمح للعلماء لاتخاذ مزيد من القياسات وتحقيق أفضل مراقبة الجودة. بالإضافة إلى ذلك ، وإذا لزم الأمر ، يمكن استرداد العينات الثمينة بعد أخذ القياس. عندما يتم قياس كميات صغيرة من هذا القبيل ، والتجانس عينة من المهم للغاية لتجنب أخطاء أخذ العينات. وينبغي دائما منخفضة نصائح ماصة الاحتفاظ تستعمل لعينات التحميل وينبغي تغيير نصائح بين عينة يتطابق. يجب أن تكون السطوح رمى تنظيفها بشكل صحيح ومكيفة لضمان الحصول على النتائج الأكثر دقة. أخيرا ، معمل microvolume مثالية عند عينة محدودة ، ومع ذلك ، وسهولة الاستخدام والسرعة واسعة النطاق الديناميكي لمطياف تجعلها مناسبة عند عينة وفيرة.

Disclosures

المؤلفون هم موظفون من الحرارية فيشر العلمية التي تنتج الكواشف والأدوات المستخدمة في هذه المقالة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NanoDrop 2000c Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific, Inc.
Laboratory wipes
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Inc. 23250 Reducing agent compatible
PR-1 Reconditioning Kit Thermo Fisher Scientific, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aitken, A., Learmonth, M. Protein determination by UV absorption. (1996).
  2. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  3. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951).
  4. Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. Use of Coomassie Brilliant Blue G250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrilamide gels. Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).
  5. Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. 10:1A.17. (2006).
  6. Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, F. ujimoto, Goeke, E. K., Olson, N. M., J, B., Klenk, D. C. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
  7. Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Meth. Enzymol. 182, 50-68 (1990).
Microvolume تحديد تركيز البروتين باستخدام 2000c NanoDrop الطيف
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), e1610, doi:10.3791/1610 (2009).More

Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), e1610, doi:10.3791/1610 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter