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Biology

光度計2000C分光光度計を使った微量タンパク質の濃度測定

doi: 10.3791/1610 Published: November 4, 2009

Summary

微量のサンプルをキュベットまたは毛細血管を使用せずに試料を保持する天然の表面張力を使用する分光光度計システムにより定量化されています。それらを測定できるようにするためのタンパク質濃度と速度のダイナミックレンジが大幅にこの方法で増加している。

Abstract

従来の分光光度計は、キュベットやキャピラリーにサンプルを配置する必要があります。これが原因で、しばしばタンパク質の解析に使用される限られたサンプル量にしばしば非現実的です。サーモ科学光度計2000C分光光度計では0.5〜2μLの低ボリュームで試料の定量を可能にする、液体の表面張力のプロパティを使用して2つの測定面の間に微量の試料を保持している革新的なサンプル保持システムでこの問題を解決します。キュベットやキャピラリーの除去は、大幅に測定可能なタンパク質濃度のダイナミックレンジを増加させながら測定時間を短縮経路長のリアルタイムの変化を、可能です。希釈の必要性も排除し、測定面が単にラボ用ワイプで拭くことができるようにサンプルの定量化のための準備が比較的容易であるされています。このビデオの記事では、A280吸光度またはBCA比色アッセイを用いてタンパク質の微量な量の定量化のための伝統的なタンパク質濃度の決定方法に変更を提示。

Protocol

I.光度計2000C分光

光度計の技術は、キュベットやキャピラリーを使用せずに2つの光学面の間微量のサンプルを保持して測定する表面張力を使用している革新的なサンプル保持システムに基づいています。光度計2000C分光光度計は、迅速かつ容易にタンパク質、DNA、RNA、および他の生体分子0.5〜2μLの液滴を測定するためにこの技術を使用しています。分子生物学的手法が継続的に分析するための材料の少量を使用するために進化しているため、この機能はますます重要になっています。サンプルが限られている条件のための微量分光光度計の理想。サンプルの十分な量が利用可能な場合、しかし、使い易さ、高速の測定サイクルとし、広範な濃度範囲はまた、分光光度計が適しています。測定サイクルも大幅に科学者がワークフロー全体の効率を高める支援、低減されます。

マイクロサンプルは、検出面の上に直接配置され、液柱は、表面張力により光ファイバの両端の間に作成されます。この液柱は垂直方向の光路を形成している。キセノン​​フラッシュランプは、光源を提供し、リニアCCDアレイを利用した分光計は、試料を通過する光を分析するために使用されます。

このようなシステムからキュベットなどの伝統的な封じ込めのデバイスを削除すると、いくつかの利点があります:サンプルの非常に少量の測定に必要とされる、クリーンアップは、単にラボペーパーで光学面を拭くことが必要であり、パスの長さは、測定中にリアルタイムで変更することができます。

光度計2000Cは、希釈することなく可能なタンパク質濃度の測定値の最も広範な範囲を提供し、(0.05 mmまで1mm)を自動的に最適なパスの長さを決定します。パスの長さを短くすることで、タンパク質のより高い濃度を測定することができます。これは事実上ほとんどのタンパク質サンプルの希釈を実行する必要がなくなります。例えば、光度計2000Cは400 mg / mLのと同じくらい高いBSAの濃度を測定することができます。

光度計2000C分光光度計ではDNA、RNA、タンパク質、および他の生体分子の吸光度を測定するための完全なスペクトルを分光光度計です。このビデオプロトコルは、タンパク質の測定に焦点を当てます。

II。 A280吸光度測定を用いた微量タンパク質の濃度測定

A. A280測定の原理

タンパク質A280法は、280 nmにおけるトリプトファン、チロシン、フェニルアラニン残基またはシステイン - システインジスルフィド結合と展示吸光度を含む精製タンパク質に適用可能である。このメソッドは、精製タンパク質の濃度を計算するための吸光係数またはモル吸光係数のどちらかと組み合わせてA280の吸光度値を使用しています。直接A280測定の利点は、標準曲線の生成はタンパク質濃度を決定するために必要とされていないことです。サンプルは、そのようなBCA、ピアース660nmの、ブラッドフォード、およびローリーアッセイとして光度計2000/2000cで利用可能な事前構成さ比色法、のいずれかを使用して、未知のタンパク質溶液、細胞溶解液、または粗タンパク質抽出物である場合は、お勧め。

B.微量タンパク質A280測定 - スタートアップ

  1. メインメニューからタンパク質A280アプリケーションを選択します。
  2. ドロップダウンリストから、測定する試料の種類を選択します。デフォルト設定は1 ABS = 1 mg / mLと最も未知のタンパク質の混合物をお勧めします。以前に特徴付け精製したタンパク質を測定する場合は、吸光係数またはモル吸光係数と分子量のどちらがより正確にタンパク質濃度を決定するために入力することができます。
  3. ドロップダウンリストから濃度の単位を選択してください。

C.微量タンパク質A280測定 - ブランキング

  1. 適切なバッファを使用して空白を確立する。タンパク質を停止しているバッファを使用することが重要です。使用されるバッファは、同じpHと試料溶液と同様のイオン強度のはずです。注:RIPAバッファーは、280 nmであまりにも多くの吸光度を貢献するため、直接A280のタンパク質の測定値と互換性がありません。 RIPA緩衝液に懸濁してタンパク質においては、タンパク質濃度がRIPAバッファー互換性のある比色アッセイを用いて決定することをお勧めします。
  2. ピペット下部の台座の上に適切なブランク溶液2μL、アームを下げ、空白]をクリック。
  3. 乾いたラボ用ワイプを使用して下限と上限の測定面からブランク溶液を拭き取ります。

D.測定微量タンパク質A280測定

重要な考慮事項:サンプルの均質性は極めてですこのような小さな音量から重要が測定されている。静かに、試料が均質であることを確認し、徹底的に測定するための一定分量を服用する前に、直ちに試料を混合する。ミキシングとピペッティング時に気泡を導入することは避けてください。

異なるタンパク質間の表面張力の変動に起因する、我々は、適切な列の形成を確保するためにサンプルを2μLをロードすることをお勧めします。低リテンションピペットチップを必ず使用してください。ピペットチップの外側に付着するソリューションを防ぐために、ソリューションを追放しながらサンプルをロードするには、低い光学台座の表面にピペットの先端に触れる。パンクと試料中の気泡の侵入を防ぐため、サンプルの完全な量よりも少ない者を追放。

  1. 適切なフィールドでのサンプルIDを入力し、ブランクとクリックして測定のために説明したように、最初のサンプルの負荷2μL。サンプルの新鮮な2μlのアリコートを各測定に使用する必要があります。
  2. 乾いたラボ用ワイプを使用して下限と上限の台座からサンプルを削除します。

E.クリーニング微量タンパク質A280測定

通常、リントフリー、ラボペーパーでは、多くの場合、測定値間の光台座を掃除するのに十分です。

F.再調整タンパク質A280測定の操作

界面活性剤を含む溶液や試薬は、フォームにサンプル液のカラムを防止する、時間をかけて測定部の表面を無条件性があります。下の台座の上に液滴の平坦化は、光学面は、無条件になることを示している。表面特性が危険にさらされている場合、台座を再調整すると、サンプルの列の形成を確保することが重要です。この問題が発生した場合、バフ精力的に実験室を使用して光学面は、指示通り光度計台座コンディショニング化合物(PR - 1)を拭いたり、使用してください。

III。比色定量法を用いた微量タンパク質の濃度測定

A.比色検出の原理

光度計2000Cの分光光度計は、比色アッセイを用いて未知タンパク質溶液、細胞ライセート、および粗タンパク質抽出物を測定するために使用することができます。

比色法は、可視波長範囲の光を吸収する新しい複合体をサンプルのタンパク質成分と色素の相互作用を伴う間接的な方法です。

光度計2000C分光光度計は、BCA、ピアース660、ブラッドフォード、およびローリーの方法を含むいくつかの事前設定済みの比色定量法を持っています。 BCAアッセイは、微量分光光度計を使用して例比色アッセイとして実証される。 (スクリーンショット)

BCA(ビシンコニン酸)アッセイは、しばしば重要なUV(280 nm)の吸光度を有する成分の存在下で希釈タンパク質溶液と蛋白質のために使用される一般的な比色法です。タンパク質A280法とは異なり、タンパク質BCA法は、サンプルのタンパク質濃度を測定する前に、検量線の作成が必要となります。

方法は、検出試薬としてビシンコニン酸(BCA)を使用します。タンパク質の存在下で形成された銅- BCAキレートは、562 nmで測定し、750 nmでノーマライズされます。

B.微量BCAアッセイ測定BCAアッセイの準備

  1. BCA試薬、BCA試薬B、互換性の試薬、再構成バッファ、およびアルブミン(BSA)の規格:必要な試薬は還元剤と互換性キット(。。サーモサイエンティフィックピアスカタログ番号23250)に含まれています。
  2. 室温にすべての未知の蛋白質と蛋白質の基準を平衡化し、よく混ぜる。
  3. 試薬の50:1比率を使用して測定する基準とサンプルのために十分な新鮮な作業試薬を準備します。B
  4. マイクロアッセイのために、サンプルに試薬を作業の1:1の比率を使用してください。すべてのサンプルおよび標準をカバーするのに十分な管で各試験管に試薬を、作業の10μLを追加。高域のアッセイのために、サンプルに試薬を作業の20:1の比率を使用してください。すべてのサンプルおよび標準をカバーするのに十分な管で各試験管に試薬を働くの190μLを加える。あなたのサンプルに適している比率を決定するピアースBCAキット文献を参照してください。
  5. 試薬を含む各チューブに標準またはサンプル10μLを加える。穏やかにボルテックスでよく混ぜる。
  6. 37チューブをインキュベート℃で30分間。
  7. 反応は室温(〜10分)に平衡させる。

C.検量線を作成する微量BCAアッセイの測定

  1. メインメニューからのタンパク質BCA法を選択してください。波長の確認ウィンドウが表示された場合は、腕がダウンしていることを確認してください。
  2. 右ペインのテーブル内の各標準濃度の値を入力します。ソフトウェアは、基準と最大7 additすることができますional規格。リファレンスおよび/または基準を複製するに測定する必要があります。
    注:標準曲線を生成するための最小要件は、2つの規格の測定やゼロ基準と少なくとも1つの標準の測定値です。それは、追加の基準が期待されるアッセイの濃度範囲をカバーするために、必要に応じて含まれることをお勧めします。
  3. 空白を確立する。比色アッセイのための空白は、一般的にH 2 Oを脱イオン
  4. ピペット下部の台座の上にのdH 2 O 2μL、アームを下げ、空白]をクリック。唯一の空白は、基準や規格のすべての測定をカバーする必要があります。
  5. 下の台座の上にタンパク質を持つ唯一の作業試薬およびバッファーを含む2μLアリコートをピペッティングすることにより基準を確立する。腕とクリックの測定を下げます。
  6. 標準のタブの下に、下の台座上に所望の標準の必要な標準とピペット2μLを強調表示します。腕とクリックの測定を下げます。すべての規格のためのプロセスを繰り返します。測定サンプルの前にすべての基準を測定してください。標準曲線を表示するには、標準曲線の表示]をクリックします。

D.微量BCAアッセイ測定の実行2μLタンパク質測定

  1. 規格のすべてが測定された後、サンプルのボタンをクリックしてください。サンプルIDを入力してください。下の台座の上に試料2μLをロードし、メジャー]をクリックします。サンプルの新鮮な2μLアリコートを各測定に使用する必要があります。
  2. 乾いたラボ用ワイプを使用して下限と上限の台座からサンプルを拭き取ります。

E.微量BCAアッセイ測定クリーニングと再調整

クリーニングと直接A280吸光度測定で説明されているように再調整を行います。

代表的な結果:

微量タンパク質の濃度測定は、直接A280測定または間接的な比色アッセイのいずれかで実行されます。 A280測定例では、目的のタンパク質の吸光係数に基づいてタンパク質濃度を決定する。 BCA比色アッセイの例は、既知のタンパク質濃度の標準曲線ベースのタンパク質濃度を決定する。

Discussion

微量定量には2つの測定面の間に液柱を形成するために、試料の固有の表面張力のプロパティを使用しています。封じ込め装置がない場合は、パスの長さが本質的に希釈を行うために必要がなくなり、リアルタイムで変更することができます。この機能により、タンパク質濃度のダイナミックレンジだけでなく、測定の速度が向上します。サンプルの最小限の量を使用することにより、多数のサンプルは、科学者はより多くの測定を行い、より良い品質管理を達成できるよう、迅速かつ正確に分析することができます。さらに、必要に応じて、貴重なサンプルが測定を受けた後、回復することができます。このような小さなボリュームが測定されているときに、サンプルの均一性は、サンプリングエラーを回避することが非常に重要です。ローリテンションピペットチップは、常にロードするサンプルを使用する必要がありますとヒントはサンプル複製の間で変更する必要があります。台座の表面は適切に洗浄し、最も正確な結果を確保するために条件付けされている必要があります。最後に、サンプルが限られているときに微量分光光度計が理想です、しかし、使い易さ、速度、および分光器の広ダイナミックレンジは、サンプルが十分にあるときに適しています。

Disclosures

著者は、この記事で使用される試薬やツールを生成するサーモフィッシャーサイエンティフィックの従業員です。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NanoDrop 2000c Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific, Inc.
Laboratory wipes
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Inc. 23250 Reducing agent compatible
PR-1 Reconditioning Kit Thermo Fisher Scientific, Inc.

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References

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光度計2000C分光光度計を使った微量タンパク質の濃度測定
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Cite this Article

Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), e1610, doi:10.3791/1610 (2009).More

Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), e1610, doi:10.3791/1610 (2009).

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