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Biology

Microvolume determinação da concentração de proteína utilizando o NanoDrop 2000c Espectrofotômetro

doi: 10.3791/1610 Published: November 4, 2009

Summary

Microvolume amostras são quantificados por um sistema de espectrofotômetro que utiliza tensão superficial natural para manter as amostras sem o uso de tinas ou capilares. A gama dinâmica das concentrações de proteína e velocidade, que pode ser medido aumentam consideravelmente com este método.

Abstract

Espectrofotometria tradicional exige colocar amostras em tinas ou capilares. Isso é muitas vezes impraticável devido aos volumes de amostra limitada frequentemente utilizado para análise de proteínas. A Thermo Scientific NanoDrop 2000c Espectrofotômetro resolve este problema com um inovador sistema de retenção de amostra que contém amostras microvolume entre duas superfícies de medição usando as propriedades da tensão superficial de líquidos, permitindo a quantificação de amostras em volumes tão baixo quanto 0,5-2 mL. A eliminação de tinas ou capilares permite alterações em tempo real no comprimento do caminho, o que reduz o tempo de medição, enquanto aumenta muito a gama dinâmica das concentrações de proteína que pode ser medido. A necessidade de diluições também é eliminada, e os preparativos para a quantificação da amostra são relativamente fáceis como as superfícies de medição pode ser simplesmente eliminado com laboratório wipe. Este artigo vídeo apresenta modificações aos tradicionais métodos de determinação de concentração de proteína para a quantificação dos valores microvolume de proteínas usando A280 leituras de absorbância ou o BCA ensaio colorimétrico.

Protocol

I. O NanoDrop 2000c Espectrofotômetro

NanoDrop tecnologia é baseada em um sistema inovador de retenção de amostra que usa a tensão de superfície para segurar e medir amostras microvolume entre dois pedestais óptica sem o uso de tinas ou capilares. O NanoDrop 2000c espectrofotômetro utiliza esta tecnologia de forma rápida e facilmente medir gotas 0,5-2 mL de proteínas, DNA, RNA, e outras biomoléculas. Esta capacidade tornou-se cada vez mais importante como técnicas moleculares evoluir continuamente para usar pequenas quantidades de material para análise. O ideal espectrofotômetro microvolume para as condições em que amostra é limitada. No entanto, a facilidade de uso, ciclo de medição rápida e, e extensa faixa de concentração também fazer o espectrofotômetro adequado quando grandes quantidades de amostra estão disponíveis. O ciclo de medição também é bastante reduzido, ajudando os cientistas a aumentar a eficiência em todo o seu fluxo de trabalho.

O microsample é colocado diretamente em cima da superfície de detecção e uma coluna de líquido é criado entre as extremidades das fibras ópticas pela tensão superficial. Esta coluna de líquido forma um caminho vertical óptico. A lâmpada de flash xenon fornece a fonte de luz e um espectrômetro utilizando um sensor CCD linear é utilizado para analisar a luz que passa através da amostra.

Remoção de dispositivos de contenção tradicionais, como tinas do sistema tem várias vantagens: pequenas quantidades de amostras são necessários para a medição, a limpeza requer simplesmente limpando as superfícies ópticas com um laboratório de wipe, eo comprimento do caminho pode ser alterado em tempo real durante a medição.

O 2000c NanoDrop determina o comprimento do caminho ideal automaticamente (1 mm a 0,05 mm), proporcionando a mais ampla gama de medições de concentração de proteína possível sem diluições. Encurtando o comprimento do caminho, maiores concentrações de proteína pode ser medido. Isso efetivamente remove a necessidade de realizar diluições de amostras mais proteína. Por exemplo, o 2000c NanoDrop pode medir as concentrações de BSA tão alto quanto 400 mg / mL.

O NanoDrop 2000c espectrofotômetro é um espectrofotômetro de espectro total para medir a absorção de DNA, RNA, proteínas e outras biomoléculas. Este protocolo de vídeo irá focar-se na medição de proteínas.

II. Microvolume determinação da concentração de proteína A280 Usando as medidas de absorbância

a. Princípio da A280 Medições

O método A280 Protein é aplicável a proteínas purificadas que contêm triptofano, tirosina, fenilalanina resíduos ou obrigações Cisteína Cisteína dissulfeto e exibem absorbância a 280 nm. Este método utiliza o valor de absorbância A280 em combinação com o coeficiente de extinção a massa ou o coeficiente de extinção molar para calcular a concentração da proteína purificada. A vantagem de medições diretas A280 é que a geração de uma curva padrão não é necessário para determinar a concentração de proteína. Se a amostra é uma solução de proteína descaracterizados, lisado celular, ou extrato de proteína bruta, em seguida, usando um dos métodos pré-configurados colorimétrico disponível no 2000/2000c NanoDrop, como BCA, 660 Pierce nm, Bradford, Lowry e ensaios, é recomendado.

b. Microvolume Protein A280 Medidas - Startup

  1. Selecione o aplicativo A280 Protein a partir do menu principal.
  2. Selecione o tipo de amostra a ser medida a partir da lista drop-down. A configuração padrão é recomendado para a maioria das misturas de proteína desconhecida, na qual um Abs = 1 mg / mL. Se a medição de uma proteína purificada previamente caracterizada, então, ou o coeficiente de extinção em massa ou coeficiente de extinção molar e massa molecular pode ser inserida para determinar a concentração de proteína mais precisamente.
  3. Escolha as unidades de concentração a partir da lista drop-down.

c. Proteína Microvolume Medidas A280 - Blanking

  1. Estabelecer um espaço em branco usando um tampão apropriado. É importante usar o buffer em que a proteína está suspenso. O buffer usado deve ser o mesmo pH e de uma força semelhante iônicos como a solução amostra. Nota: buffers RIPA contribuir absorbância muito em 280 nm e, portanto, incompatível com as proteínas direta A280. Para proteínas suspensos em tampão RIPA, recomenda-se a concentração de proteína ser determinado usando um tampão RIPA ensaio colorimétrico compatível.
  2. Pipeta mL 2 da solução adequada para a estampagem pedestal baixo, abaixe o braço e clique em branco.
  3. Limpe a solução em branco, os pedestais inferior e superior utilizando um laboratório seco wipe.

d. Proteína Microvolume Medidas A280 medição

Considerações importantes: A homogeneidade da amostra é extremamenteimportante, pois um volume tão pequeno está sendo medido. Para garantir que as amostras são homogêneas, suavemente, mas misturar as amostras imediatamente antes de tomar uma alíquota para a medição. Evitar a introdução de bolhas quando mistura e pipetagem.

Devido à variabilidade da tensão superficial entre proteínas diferentes, recomendamos carregar 2 mL de amostras para garantir a formação de coluna adequada. Sempre usar ponteiras de baixa retenção. Para carregar uma amostra, toque a ponta da pipeta na superfície pedestal inferior óptico durante a expulsar a solução para evitar a solução de aderir a parte externa da ponta da pipeta. Expelir menos do que o valor total da amostra para evitar blowout e introdução de bolhas na amostra.

  1. Digite um ID da amostra no campo apropriado, carga 2 mL da primeira amostra como descrito para a Medida em branco e clique em. Uma nova porção 2μL da amostra deve ser usado para cada medição.
  2. Retirar a amostra da pedestais inferior e superior utilizando um laboratório seco wipe.

e. Microvolume Protein A280 Medidas de limpeza

Um ordinário, que não solte fiapos de laboratório, limpe freqüentemente é suficiente para a limpeza do pedestais óptica entre as medidas.

f. Fazendo Protein A280 Medidas Recondicionamento

Soluções e reagentes contendo surfactantes pode descondicionar as superfícies pedestal de medição ao longo do tempo, impedindo que a coluna de líquido da amostra para se formar. Um achatamento da gota na parte inferior do pedestal é um indicativo da superfície óptica tornando-se incondicionada. Se as propriedades da superfície ter sido comprometida, os pedestais de recondicionamento é importante para garantir a formação de coluna de amostra. Se isso ocorrer, buff as superfícies ópticas vigorosamente usando limpe laboratório ou uso Compound Pedestal NanoDrop Recondicionamento (PR-1) como indicado.

III. Microvolume determinação da concentração de proteína através de teste colorimétrico

a. Princípio da detecção colorimétrica

O NanoDrop espectrofotômetro 2000c também pode ser usado para medir soluções de proteína descaracterizados, lisados ​​celulares, e extratos de proteína bruta através de teste colorimétrico.

Métodos colorimétricos são métodos indiretos que envolvem a interação de um corante com o componente de proteína da amostra para a produção de um novo complexo que absorve luz na faixa de comprimento de onda visível.

O NanoDrop espectrofotômetro 2000c tem vários pré-configurados, incluindo ensaios colorimétricos BCA, 660 Pierce, Bradford, e métodos de Lowry. O ensaio BCA será demonstrado como um ensaio colorimétrico exemplo usando um espectrofotômetro microvolume. (Screenshot)

O BCA ensaio (Ácido Bicinchoninic) é um método colorimétrico comum muitas vezes usado para diluir soluções de proteína e proteínas na presença de componentes que têm UV significativa (280 nm) absorbância. Ao contrário do método A280 Protein, a Proteína método BCA exige que uma curva padrão antes de ser gerado concentração de proteínas da amostra pode ser medido.

O método utiliza ácido bicinchoninic (BCA) como reagente de detecção. O quelato Cu-BCA formado na presença de proteínas é medido em 562 nm e 750 nm em normalizado.

b. Microvolume Assay BCA Medidas Preparação de Ensaio BCA

  1. Os reagentes necessários estão contidos no kit agente redutor compatível (Thermo Scientific gato Pierce não 23250..): BCA reagente A, B BCA reagente, reagente de compatibilidade, tampão de reconstituição, e albumina (BSA) padrões.
  2. Equilibrar todas as proteínas desconhecidas e padrões de proteína à temperatura ambiente e misture bem.
  3. Prepare o suficiente reagente de trabalho nova para os padrões e amostras a medida usando uma proporção de 50:1 de reagente A: B
  4. Para o ensaio micro, use uma proporção de 1:1 do reagente de trabalho para amostra. Adicionar 10 mL de Reagente de Trabalho a cada tubo com tubos suficiente para cobrir todas as amostras e padrões. Para o ensaio de alta gama, use uma proporção de 20:1 de reagente de trabalho para amostra. Adicionar 190 mL de Reagente de Trabalho a cada tubo com tubos suficiente para cobrir todas as amostras e padrões. Consulte o BCA Pierce kit de literatura para determinar que proporção é adequado para as suas amostras.
  5. Adicionar 10 mL de padrão ou amostra a cada tubo contendo reagente. Misture bem delicadamente vórtex.
  6. Incubar os tubos a 37 ° C por 30 minutos.
  7. Permitir que as reações a atingir a temperatura ambiente (~ 10 minutos).

c. Microvolume BCA Medidas Assay Gerar Curva Padrão

  1. Selecione o método BCA Protein a partir do menu principal. Se a janela de verificação comprimento de onda aparece, certifique-se o braço é baixo.
  2. Digite os valores para cada concentração padrão no painel de tabela à direita. O software permite a referência e até 7 additpadrões ional. A referência e / ou padrões deve ser medido em repetições.
    Nota: O requisito mínimo para a geração de curva padrão é a medida de duas normas ou a medição da referência zero e pelo menos um padrão. Recomenda-se que os padrões adicionais sejam incluídos como necessário para cobrir a faixa de concentração esperada ensaio.
  3. Estabelecer um em branco. O branco para ensaios colorimétricos geralmente é deionizada H 2 O.
  4. Pipeta mL 2 de dH 2 O sobre o pedestal baixo, mais baixo do braço e clique em branco. Apenas um em branco é necessário para cobrir todas as medições subseqüentes da referência e padrões.
  5. Estabelecer a referência pipetando uma alíquota de 2 mL, contendo apenas o reagente de trabalho e buffer com nenhuma proteína para o menor pedestal. Abaixe o braço e Medida clique.
  6. Sob a guia Padrões, selecione o padrão desejado e pipetar 2 mL do padrão desejado para o menor pedestal. Abaixe o braço e Medida clique. Repita o processo para todos os padrões. Certifique-se de medida de todas as normas antes de amostras de medição. Para ver curva padrão clique em Exibir curva padrão.

d. Medidas Microvolume BCA Protein Assay duas Medidas mL

  1. Afinal de contas das Normas foram medidos, clique no botão amostras. Digite o ID da amostra. Carga de 2 mL de amostra para o pedestal inferior e clique em Medida. A alíquota de 2 mL de amostra fresca deve ser usado para cada medição.
  2. Limpe a amostra da pedestais inferior e superior utilizando um laboratório seco wipe.

e. Medidas Assay Microvolume BCA Limpeza e Recondicionamento

Realizar a limpeza e recondicionamento, como descrito na direta A280 medições de absorbância.

Resultados representativos:

Microvolume determinação da concentração de proteínas é realizada por qualquer um A280 medição direta ou indireta de um ensaio colorimétrico. O exemplo a medição A280 determina a concentração de proteína com base no coeficiente de extinção da proteína de interesse. O BCA exemplo ensaio colorimétrico determina a concentração de proteína baseada em uma curva padrão de concentrações de proteína conhecida.

Discussion

Quantificação Microvolume usa as propriedades de superfície intrínseca a tensão de uma amostra para formar uma coluna de líquido entre duas superfícies de medição. A ausência de um dispositivo de contenção, permite que o comprimento do caminho para a mudança em tempo real, eliminando essencialmente a necessidade de realizar diluições. Esta capacidade aumenta dramaticamente a gama dinâmica das concentrações de proteínas, bem como a velocidade de medição. Utilizando quantidades mínimas de amostra, um grande número de amostras podem ser analisadas com rapidez e precisão, permitindo aos cientistas fazer medições mais e obter um melhor controlo de qualidade. Além disso, e se necessário, as amostras preciosas podem ser recuperados depois de tomar uma medida. Quando tais pequenos volumes estão sendo medidos, homogeneidade da amostra é extremamente importante para evitar erros de amostragem. Ponteiras de baixa retenção deve ser sempre utilizado para as amostras de carga e as dicas devem ser alteradas entre a amostra repetições. As superfícies pedestal devem ser limpos e condicionados para garantir os resultados mais precisos. Finalmente, o espectrofotômetro microvolume é ideal quando a amostra é limitada, no entanto, a facilidade de uso, velocidade e faixa dinâmica ampla do espectrômetro de torná-lo adequado quando a amostra é abundante.

Disclosures

Os autores são funcionários da Thermo Fisher Scientific, que produz os reagentes e as ferramentas usadas neste artigo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NanoDrop 2000c Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific, Inc.
Laboratory wipes
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Inc. 23250 Reducing agent compatible
PR-1 Reconditioning Kit Thermo Fisher Scientific, Inc.

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References

  1. Aitken, A., Learmonth, M. Protein determination by UV absorption. (1996).
  2. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  3. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951).
  4. Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. Use of Coomassie Brilliant Blue G250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrilamide gels. Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).
  5. Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. 10:1A.17. (2006).
  6. Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, F. ujimoto, Goeke, E. K., Olson, N. M., J, B., Klenk, D. C. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
  7. Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Meth. Enzymol. 182, 50-68 (1990).
Microvolume determinação da concentração de proteína utilizando o NanoDrop 2000c Espectrofotômetro
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Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), e1610, doi:10.3791/1610 (2009).More

Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), e1610, doi:10.3791/1610 (2009).

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