Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Микрообъеме концентрации белка Определение использованием NanoDrop 2000c Спектрофотометр

doi: 10.3791/1610 Published: November 4, 2009

Summary

Микрообъеме образцы количественно с помощью спектрофотометра система, которая использует природный поверхностного натяжения, чтобы сохранить образцы без использования кювет или капилляров. Динамический диапазон белков концентрации и скорость, с которой они могут быть измерены значительно повышаются с этим методом.

Abstract

Традиционные спектрофотометрии требует размещения образцов в кювет или капилляров. Это часто нецелесообразно из-за ограниченных объемов проб часто используется для анализа белков. Thermo Scientific NanoDrop 2000c Спектрофотометр решает этот вопрос с инновационной системой удержания образца, который содержит образцы микрообъеме между двумя измерения поверхностей с использованием поверхностного натяжения свойства жидкостей, что позволяет количественно образцов в объемах ниже, чем 0.5-2 мкл. Устранение кювет или капилляров позволяет в режиме реального времени изменения в длине пути, который уменьшает время измерения при значительном увеличении динамического диапазона концентраций белка, которые могут быть измерены. Необходимость разведения также устранены, и подготовка образцов количественного относительно легко, как измерение поверхности можно просто протереть лаборатории салфеткой. Это видео статье представлены модификации традиционных методов определения концентрации белка для количественного определения количества белка микрообъеме использованием A280 считывание абсорбции или анализа BCA колориметрических.

Protocol

И. NanoDrop 2000c Спектрофотометр

NanoDrop технология основана на инновационной системой удержания образец, который используется поверхностное натяжение для удержания и мера микрообъеме образцов между двумя оптическими пьедесталы без использования кювет или капилляров. NanoDrop 2000c спектрофотометр использует эту технологию, чтобы быстро и легко измерить 0.5-2 мкл капель белков, ДНК, РНК и других биомолекул. Эта возможность становится все более важным, как молекулярные методы постоянно развиваться, чтобы использовать меньшее количество материала для анализа. Идеальное микрообъеме спектрофотометр для условий, в которых образец ограничен. Тем не менее, простота в использовании, быстрый цикл измерения и, а также обширные диапазоне концентраций также сделать спектрофотометр удобно, когда достаточное количество образцов имеются. Измерение цикла также значительно снижается, помогают ученым повысить эффективность на протяжении всего их рабочих процессов.

Microsample размещается непосредственно на поверхности и обнаружения столба жидкости создается между концами оптических волокон поверхностного натяжения. Это столба жидкости формы вертикального оптического пути. Ксеноновая лампа-вспышка обеспечивает источник света и спектрометр использованием ПЗС-линейки используется для анализа света, проходящего через образец.

Удаление традиционных устройств, таких как сдерживание кювет из системы имеет ряд преимуществ: очень небольшое количество образцов, необходимых для измерения, очистки просто требует очистки оптических поверхностей с лабораторией стереть, и длина пути может быть изменена в реальном времени в процессе измерения.

NanoDrop 2000c определяет оптимальную длину пути автоматически (1 мм до 0,05 мм), обеспечивая самый широкий спектр возможных измерения концентрации белка без разведения. Сократив длину пути, более высокие концентрации белка может быть измерена. Это эффективно устраняет необходимость выполнения разведения для большинства образцов белка. Например, NanoDrop 2000c можно измерить BSA концентрациях до 400 мг / мл.

NanoDrop 2000c Спектрофотометр полный спектр спектрофотометр для измерения поглощения ДНК, РНК, белков и других биомолекул. Это видео протокол будет сосредоточена на измерении белков.

II. Микрообъеме концентрации белка Определение Использование A280 Измерения поглощения

a. Принцип измерения A280

Метод белка A280 применима к очищенных белков, которые содержат триптофан, тирозин, фенилаланин остатков или цистеин-цистеин дисульфидных связей и проявляют оптическую плотность при 280 нм. Этот метод использует A280 оптическая плотность в сочетании с любым коэффициентом массовое вымирание или молярный коэффициент погашения для расчета концентрации очищенного белка. Преимущество прямых измерений A280 является то, что поколение стандартной кривой не требуется для определения концентрации белка. Если образец неохарактеризованных раствора белка, сотовые лизата или неочищенный экстракт белка, то, используя один из предварительно настроенных колориметрических методов, доступных на NanoDrop 2000/2000c, например, BCA, Пирс 660 нм, Брэдфорд, и Лоури анализов, является рекомендуется.

b. Микрообъеме белка A280 Измерения - Автозагрузка

  1. Выберите приложение белка A280 из главного меню.
  2. Выберите тип образца измеряется от выпадающего списка. По умолчанию рекомендуется для большинства неизвестной смеси белков, в которых 1 Abs = 1 мг / мл. При измерении ранее характеризуется очищенный белок, то либо коэффициент массовое вымирание или молярный коэффициент погашения и молекулярной массы могут быть введены для определения концентрации белка более точно.
  3. Выбор концентрации единиц из раскрывающегося списка.

c. Микрообъеме белка A280 измерения - Глухая

  1. Создание пустой помощью соответствующего буфера. Очень важно использовать буфер, в котором белок приостановлено. Буфер, используемый должна быть такой же рН и ионной силы аналогичный как пример решения. Примечание: RIPA буферов способствовать слишком много поглощению при 280 нм и, следовательно, несовместимы с прямыми измерениями белка A280. Для белков, взвешенных в буфер RIPA, рекомендуется концентрация белка быть определена с использованием буфера RIPA совместимы колориметрического анализа.
  2. Внесите 2 мкл соответствующего гашения раствор на дно пьедестала, нижняя рука и нажмите Бланк.
  3. Протрите пустое решение из нижней и верхней пьедесталы использованием сухого лаборатории салфеткой.

d. Микрообъеме белка A280 измерений Измерение

Важные моменты: однородность образца чрезвычайноважно, так как такой маленький объем измеряется. Чтобы гарантировать, что образцы были однородными, мягко, но тщательно перемешать образцы сразу до принятия аликвоту для измерения. Избегайте введения пузырьков при смешивании и пипетки.

В связи с изменчивостью поверхностного натяжения между различными белками, мы рекомендуем загрузки 2 мкл образцов для обеспечения правильного формирования колонки. Всегда используйте низкие наконечники для пипеток хранения. Для загрузки образца, сенсорный наконечник пипетки к нижней поверхности оптических пьедестал в то время как изгнание решение, чтобы избежать решения от присоединения к внешней стороне кончика пипетки. Выгнать меньше, чем полное количество образца для предотвращения выброса и внедрения пузырьков в пробе.

  1. Введите образец ID в соответствующем поле, нагрузка 2 мкл первый образец, как описано для незаполненным и нажмите кнопку Measure. Свежие 2μL аликвоту образца следует использовать для каждого измерения.
  2. Удалить образец из нижней и верхней пьедесталы использованием сухого лаборатории салфеткой.

e. Микрообъеме белка A280 Измерения Очистка

Обычный, без ворса, лабораторные протрите часто бывает достаточно для чистки оптических пьедесталы между измерениями.

f. Создание белка A280 Измерения Ремонт

Решения и реагентов, содержащих поверхностно-активные вещества могут uncondition поверхности измерения пьедестала в течение долгого времени, не давая колонки образца жидкости в форме. Уплощение капли на нижней постаменте указывает на оптическую поверхность становится безусловным. Если поверхностные свойства были скомпрометированы, восстановление пьедесталы важно обеспечить формирование образца колонку. В этом случае положительный эффект оптических поверхностей с использованием лабораторных энергично протирать или использовать NanoDrop Пьедестал Восстановление соединения (PR-1), как указано.

III. Микрообъеме концентрации белка Определение Использование колориметрический Анализы

a. Принцип обнаружения колориметрических

Спектрофотометр NanoDrop 2000c также может быть использован для измерения неохарактеризованных белковых растворов, клеточные лизаты, экстракты и сырой белок использованием колориметрического анализа.

Колориметрический методы являются косвенными методами, которые связаны с взаимодействием красителя с белковым компонентом образца для создания нового комплекса, который поглощает свет в видимом диапазоне длин волн.

Спектрофотометр NanoDrop 2000c имеет несколько предварительно настроенных колориметрических анализов в том числе BCA, Пирс 660, Брэдфорд, и Лоури методами. Анализ BCA будет демонстрироваться в качестве примера колориметрическим методом с использованием спектрофотометра микрообъеме. (Скриншот)

BCA (Bicinchoninic кислота) анализа является общая колориметрический метод часто используется для разбавленных растворов белков и белков в присутствии компонентов, которые имеют значительные УФ (280 нм) поглощения. В отличие от метода A280 протеина, белка методом BCA требует, чтобы стандартную кривую быть создан до концентрации белка образца может быть измерена.

Метод использует bicinchoninic кислоты (ДСС), а обнаружение реагентом. Cu-BCA хелатных образуется в присутствии белка измеряется при 562 нм и нормированных при 750 нм.

b. Микрообъеме BCA Пробирной Измерения BCA Пробирной подготовка

  1. Необходимые реагенты, содержащиеся в восстановителем совместимый комплект (Thermo Scientific Пирс кошка не 23250..): BCA реагента, BCA реагент B, совместимость реагентов, разведение буфера, и альбумина (БСА) стандартами.
  2. Равновесие всех неизвестных белков и белковых стандартов до комнатной температуры и тщательно перемешать.
  3. Подготовка достаточно свежий рабочий раствор для стандартов и образцов, быть измерена с помощью 50:1 соотношение реагентов: B
  4. Для микро-анализ, использование соотношении 1:1 рабочего реактива к образцу. Добавьте 10 мкл рабочего реагента в каждую пробирку с достаточно труб для покрытия всех образцов и стандартов. Для высокого диапазона анализа, использование 20:01 соотношение рабочего реактива к образцу. Добавить 190 мкл рабочего раствора в каждую пробирку с достаточно труб для покрытия всех образцов и стандартов. Обратитесь к Пирс BCA комплектом документации для определения, какие отношения подходит для ваших образцов.
  5. Добавьте 10 мкл стандартного или образец в каждую пробирку содержащую реагент. Хорошо перемешайте, аккуратно вортексе.
  6. Инкубировать пробирки при 37 ° С в течение 30 минут.
  7. Разрешить реакции, чтобы уравновесить до комнатной температуры (~ 10 минут).

c. Микрообъеме BCA Пробирной Измерения Создание калибровочной кривой

  1. Выберите метод белка BCA из главного меню. Если окно длиной волны проверке появляется, убедитесь, рука вниз.
  2. Введите значения для каждого стандарта концентрации в правой таблице панели. Программное обеспечение позволяет для ведения и до 7 additРациональная стандартам. Исходные и / или стандарты должны быть измерены в репликацию.
    Примечание: минимальное требование для стандартных поколение кривой измерения двух стандартов или измерение нуля отсчета и по крайней мере одного стандарта. Рекомендуется, чтобы дополнительные стандарты будут включены в качестве необходимых для покрытия ожидаемого диапазона анализа концентрации.
  3. Создание пустой. Пустым для колориметрических анализов, как правило, деионизированной H 2 O.
  4. Внесите 2 мкл дН 2 O на дно пьедестала, нижняя рука и нажмите Бланк. Только одна заготовка, необходимые для покрытия всех последующих измерений ссылки и стандартов.
  5. Создание ссылки с помощью пипетки 2 мкл, содержащие только рабочий реагент и буферных без каких-либо белков на нижний постамент. Нижняя рука и нажмите кнопку Measure.
  6. На вкладке стандартам, выделите необходимый стандарт и пипетки 2 мкл желаемого уровня на нижний постамент. Нижняя рука и нажмите кнопку Measure. Повторите процедуру для всех стандартов. Не забудьте измерить все стандарты до измерения образцов. Для просмотра стандартной кривой нажмите кнопку Просмотр стандартной кривой.

d. Микрообъеме BCA Пробирной Измерения 2 мкл измерения белка

  1. После того как все стандарты были измерены, щелкните на кнопке Образцы. Введите образец ID. Нагрузка 2 мкл образца на нижний постамент и нажмите Измерить. Свежие 2 мкл образца следует использовать для каждого измерения.
  2. Протрите образец из нижней и верхней пьедесталы использованием сухого лаборатории салфеткой.

e. Микрообъеме Измерения BCA Пробирной Очистка и Ремонт

Выполните очистку и восстановление, как описано в прямом A280 измерения оптической плотности.

Представитель Результаты:

Микрообъеме определения концентрации белка осуществляется либо прямым A280 измерения или косвенного колориметрического анализа. A280 измерения примере определяется концентрация белка на основе коэффициента экстинкции белка интересов. Анализ BCA колориметрических примере определяется концентрация белка основана на стандартной кривой известных концентраций белка.

Discussion

Микрообъеме количественного использует внутреннюю поверхностного натяжения свойства образца формы столба жидкости между двумя поверхностями измерения. Отсутствие сдерживания устройства, позволяет длина пути изменить в режиме реального времени, по существу устраняет необходимость выполнять разведения. Эта возможность значительно увеличивает динамический диапазон концентрации белка, а также скорость измерения. Используя минимальное количество образца, большое количество образцов может быть проанализирована быстро и точно, что позволяет ученым принять более измерений и достижения лучшего контроля качества. Кроме того, и, если необходимо, драгоценные образцы могут быть восстановлены после того, измерения. Когда такие небольшие объемы измеряются, образцы однородности является чрезвычайно важным, чтобы избежать ошибки выборки. Низкий наконечники для пипеток удержания всегда должны быть использованы для загрузки образцов и советы должны быть изменены между образцом повторяет. Пьедестал поверхности должны быть надлежащим образом очищены и обусловленным, чтобы обеспечить наиболее точные результаты. Наконец, спектрофотометр микрообъеме идеально подходит, когда образец является ограниченным, однако, простота использования, скорость и обширная динамический диапазон спектрометра делают его подходящим, когда образец имеется в изобилии.

Disclosures

Авторы являются сотрудниками Thermo Fisher Scientific, которая производит реактивы и инструменты, используемые в этой статье.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NanoDrop 2000c Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific, Inc.
Laboratory wipes
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Inc. 23250 Reducing agent compatible
PR-1 Reconditioning Kit Thermo Fisher Scientific, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aitken, A., Learmonth, M. Protein determination by UV absorption. (1996).
  2. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  3. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951).
  4. Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. Use of Coomassie Brilliant Blue G250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrilamide gels. Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).
  5. Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. 10:1A.17. (2006).
  6. Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, F. ujimoto, Goeke, E. K., Olson, N. M., J, B., Klenk, D. C. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
  7. Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Meth. Enzymol. 182, 50-68 (1990).
Микрообъеме концентрации белка Определение использованием NanoDrop 2000c Спектрофотометр
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), e1610, doi:10.3791/1610 (2009).More

Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), e1610, doi:10.3791/1610 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter