Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

NanoDrop 2000c Spektrofotometre kullanılarak Microvolume Protein Konsantrasyonu Tayini

doi: 10.3791/1610 Published: November 4, 2009

Summary

Microvolume örnekleri doğal yüzey gerilimi, küvet ya da kılcal damarların kullanmadan örnekleri korumak için kullanan bir spektrofotometre sistem tarafından sayısal. Ölçülebilir olan protein konsantrasyonları ve hız dinamik aralık, bu yöntem büyük ölçüde artmıştır.

Abstract

Geleneksel spektrofotometri Küvet veya kapiler içine yerleştirerek örnekleri gerektirir. Bu genellikle, genellikle protein analizi için kullanılan sınırlı örnek hacmi nedeniyle pratik. Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spektrofotometre numune miktarının 0.5-2 mcL düşük hacim sağlayarak, sıvıların yüzey gerilimi özelliklerini kullanarak iki ölçüm yüzeyleri arasındaki microvolume örnekleri tutan yenilikçi bir örnek saklama sistemi ile bu sorunu çözer. Küvet veya kılcal damarların ortadan kaldırılması, dinamik aralık ölçülebilir protein konsantrasyonları önemli ölçüde artırırken ölçüm zamanını azaltır yol uzunluğu gerçek zamanlı değişiklikleri, sağlar. Dilüsyonları için ihtiyaç da ortadan kaldırılabilir ve ölçüm yüzeyleri sadece laboratuar silin ile silinebilir olarak numune ölçümü için hazırlıklar nispeten kolay. Bu video makale A280 absorbans okumaları veya BCA kolorimetrik tahlil kullanarak microvolume miktarda protein ölçümü için geleneksel protein konsantrasyonu tespiti yöntemlerine değişiklikler sunar.

Protocol

I. NanoDrop 2000c Spektrofotometre

NanoDrop teknolojisi Küvet veya kapiler kullanmadan microvolume örnekleri iki optik kaideleri arasında tutun ve ölçmek için yüzey gerilimi kullanan yenilikçi bir örnek tutma sistemi dayanmaktadır. NanoDrop 2000c spektrofotometre proteinlerin 0.5-2 mcL damlacıkları, DNA, RNA ve diğer biyomoleküllerin hızlı ve kolay bir şekilde ölçmek için bu teknolojiyi kullanır. Moleküler teknikler sürekli analiz için küçük miktarlarda malzeme kullanmak geliştikçe bu yeteneği giderek daha önemli hale gelmiştir. Microvolume spektrofotometre örnek sınırlı olduğu koşullar için idealdir. Bol miktarda örnek mevcuttur Ancak, kullanım kolaylığı, hızlı ölçüm döngüsü ve ve geniş konsantrasyon aralığında spektrofotometre uygun hale getirmek. Ölçüm döngüsü de büyük ölçüde bilim adamlarının kendi iş akışı boyunca verimliliği artırmak yardımcı azalır.

Microsample doğrudan algılama yüzey üstüne yerleştirilir ve yüzey gerilimi, fiber optik uçları arasında bir sıvı sütunu oluşturulur. Bu sıvı sütunu dikey bir optik yol oluşturur. Xenon flaş lambası, ışık kaynağı ve lineer bir CCD dizi örnek geçer ışığında analiz etmek için kullanılır kullanan bir spektrometre sağlar.

Sistemi gibi küvetler gibi geleneksel çevreleme cihazlar kaldırma birçok avantajı vardır: çok küçük miktarda numune ölçüm için gerekli olan temizleme sadece bir laboratuvar beziyle optik yüzeyleri silerek gerektirir ve yol uzunluğu ölçümü sırasında gerçek zamanlı olarak değiştirilebilir.

NanoDrop 2000c dilüsyonları olmadan, olası protein konsantrasyonu ölçümleri en geniş yelpazesi sunmaktadır (1 mm ile 0.05 mm) otomatik olarak en uygun yol uzunluğunu belirler. Yol uzunluğu kısaltarak, daha yüksek protein konsantrasyonları ölçülebilir. Bu etkili, çok protein örnekleri için dilüsyonları gerçekleştirmek için gereksinimini ortadan kaldırır. Örneğin, NanoDrop 2000c BSA konsantrasyonlarının 400 mg / ml gibi yüksek ölçebilirsiniz.

NanoDrop 2000c Spektrofotometre, DNA, RNA, protein, ve diğer biyomoleküllerin absorbans ölçmek için tam bir spektrum spektrofotometre. Bu video protokolü proteinlerin ölçümü üzerinde durulacak.

II. A280 Absorbans Ölçümler kullanarak Microvolume Protein Konsantrasyonu Tayini

a. A280 Ölçümler Prensibi

Triptofan, 280 nm Tirozin, fenilalanin kalıntı veya Sistein-Sistein disülfit bağları ve sergi absorbans içeren saflaştırılmış proteinler Protein A280 yöntemi uygulanabilir. Bu yöntem, saflaştırılmış protein konsantrasyonu hesaplamak için kitlesel yok katsayısı veya molar sönüm katsayısı ile birlikte A280 absorbans değeri kullanır. Doğrudan A280 ölçümleri avantajı bir standart eğri nesil protein konsantrasyonu belirlemek için gerekli değildir. Örnek bir uncharacterized protein solüsyonu, hücre lizatı, ya da ham protein ekstresi ise, daha sonra, BCA, Pierce 660 nm, Bradford, Lowry testleri gibi NanoDrop 2000/2000c önceden yapılandırılmış kolorimetrik yöntemler kullanarak önerilir.

b. Microvolume Protein A280 Ölçümler - Başlangıç

  1. Protein A280 uygulama ana menüden seçin.
  2. Açılan listeden ölçülecek numune türü seçin. En bilinmeyen protein karışımları 1 Abs = 1 mg / ml. Varsayılan ayarı için tavsiye edilir Eğer önceden karakterize saflaştırılmış protein ölçümü, daha sonra kitlesel yok katsayısı veya molar sönüm katsayısı ve molekül ağırlığı da daha doğrusu protein konsantrasyonu belirlemek için girmiş olabilir.
  3. Konsantrasyon birimleri açılan listeden seçin.

c. Microvolume Protein A280 Ölçümleri - Körleme

  1. Uygun bir tampon kullanarak boş bir kurun. Protein asılı olduğu tampon kullanmak önemlidir. Kullanılan tampon aynı pH ve örnek çözüm olarak benzer bir iyonik gücü olmalıdır. Not: RIPA tamponlar, 280 nm'de çok absorbans katkıda bulunan ve bu nedenle doğrudan A280 protein ölçümleri ile uyumsuz. RIPA tamponunda askıya proteinler, protein konsantrasyonu RIPA tampon uyumlu kolorimetrik assay kullanılarak belirlenecek tavsiye edilir.
  2. Pipet 2 alt kaide üzerine uygun bir kararma çözüm mcL, kol alt ve Boş tıklayın.
  3. Boş bir çözüm kuru bir laboratuvar silin kullanarak alt ve üst kaideleri silin.

d. Ölçüm Microvolume Protein A280 Ölçümleri

Son derece önemli noktalar: örnek homojenlik.Böyle bir küçük hacimli bu yana önemli ölçülen. Yavaşça örnekleri homojen olduğundan emin ama iyice ölçümü için bir kısım alınarak hemen önce örnekleri bir arada. Karıştırma ve pipetleme sırasında kabarcıklar tanıtan kaçının.

Farklı proteinler arasındaki yüzey gerilimi değişkenliği nedeniyle, uygun sütun oluşumunu sağlamak için numune 2 mcL yükleme öneririz. Her zaman düşük tutma pipet uçları kullanın. Pipet ucu dışarıda kalarak çözüm önlemek için çözüm sınır dışı bir örnek yüklemek için, optik alt kaide yüzeye pipet ucu dokunun. Blowout ve örnek kabarcıkları giriş önlemek için, numunenin tam bir miktardan daha az boşaltınız.

  1. Uygun alan bir örnek kimliğini girin, 2 boş ve tıklama ölçün açıklandığı gibi ilk örnek mcL yükleyin. Her bir ölçüm için, örnek bir taze 2μL kısım kullanılmalıdır.
  2. Kuru bir laboratuvar silin kullanarak alt ve üst kaideleri örnek çıkarın.

e. Temizleme Microvolume Protein A280 Ölçümler

Sıradan bir, tüy bırakmayan bir laboratuar silin genellikle ölçümler arasındaki optik kaideleri temizlik için yeterlidir.

f. Yenileme Protein A280 ölçümler yapma

Yüzey içeren çözeltiler ve reaktifler formu için örnek sıvı sütunu önlenmesi, zaman içinde ölçüm kaide yüzeyleri uncondition olabilir. Düzleşme alt kaide üzerinde damlacık bir optik yüzey şarta bağlı olma göstergesidir. Yüzey özellikleri tehlikeye varsa, kaideleri yenileme örnek sütun oluşumu sağlamak önemlidir. Eğer bu olursa, devetüyü şiddetle laboratuar silin ya da yönetmen olarak (PR-1) NanoDrop Ayak Yenileme Bileşik kullanarak optik yüzeyler.

III. Microvolume Protein Konsantrasyonu Tayini Kolorimetrik Tahliller

a. Kolorimetrik algılama ilkesi

NanoDrop 2000c spektrofotometre kolorimetrik testleri kullanarak uncharacterized protein çözümleri, cep lizatları, ve ham protein ekstreleri de ölçmek için kullanılan olabilir.

Kolorimetrik yöntemleri boya, görünür dalga boyu aralığında ışığı emer yeni bir kompleks üretmek için örnek protein bileşeni ile etkileşim gerektiren dolaylı yöntemler.

NanoDrop 2000c spektrofotometre BCA, Bradford, Pierce 660 ve Lowry yöntemleri de dahil olmak üzere birçok önceden yapılandırılmış kolorimetrik testleri vardır. BCA testi kolorimetrik tahlil microvolume spektrofotometre kullanarak bir örnek olarak gösterilebilir. (Ekran görüntüsü)

BCA (Bicinchoninic Asit) testi genellikle seyreltik protein çözümleri ve proteinlerin varlığında önemli UV (280 nm) absorbans bileşenler için kullanılan ortak bir kolorimetrik yöntemle. Protein A280 yönteminin aksine, Protein BCA yöntemi örnek protein konsantrasyonu ölçülebilir önce bir standart eğri oluşturulur olmasını gerektirir.

Bu yöntem algılama reaktif bicinchoninic asit (BCA) kullanır. Protein varlığında oluşan Cu-BCA şelat 562 nm'de ölçülür ve 750 nm dalga boyunda normalize edilir.

b. Microvolume BCA Testi Ölçümleri BCA Testi Hazırlık

  1. BCA reaktif A, B BCA reaktif, Uyumluluk reaktif, Sulandırma tampon ve Albumin (BSA) standartlarına: Gerekli reaktifler indirgen uyumlu kiti (Thermo Scientific Pierce kedi hayır 23250) bulunur.
  2. Oda sıcaklığına kadar bilinmeyen tüm proteinler ve protein standartları dengelenmesi ve iyice karıştırın.
  3. Standartları ve reaktif bir 50:1 oranı kullanılarak ölçülecek numune için yeterli taze çalışan reaktif hazırlayın: B
  4. Mikro testi için örnek çalışma reaktifi 1:1 oranında kullanın. Tüm örnekler ve standartları karşılamak için yeterli tüpleri ile her tüp reaktif çalışan 10 mcL ekleyin. Yüksek oranda test için örnek çalışma reaktifi 20:01 oranı kullanın. Tüm örnekler ve standartları karşılamak için yeterli tüpleri ile her tüp reaktif çalışan 190 mcL ekleyin. Örnekler için uygun oranı belirlemek için Pierce BCA kiti edebiyatına bakın.
  5. Her tüp içeren reaktif standart ya da numune 10 mcL ekleyin. Hafifçe karıştırın ve iyice karıştırınız.
  6. 37 tüpleri ° C'de 30 dakika.
  7. Reaksiyonların, oda sıcaklığında (~ 10 dakika) gelmesini sağlayın.

c. Standart Eğri oluşturma Microvolume BCA Testi Ölçümleri

  1. Protein BCA yöntemi ana menüden seçin. Dalga boyu doğrulama penceresi belirirse, kol aşağı doğru olduğundan emin olun.
  2. Sağ bölmede tabloda her bir standart konsantrasyon değerleri girin. Yazılım, referans ve en fazla 7 addit sağlarional standartları. Referans ve / veya standartlara çoğaltır ölçülmelidir.
    Not: standart eğri üretimi için minimum gereksinimi iki standartları ölçüm veya sıfır referans ve en azından tek bir standart ölçüm. Bu beklenen tahlil konsantrasyon aralığında karşılamak için gerekli ilave standartlar dahil olması tavsiye edilir.
  3. Boş bir kurun. Kolorimetrik deneyleri için boş genellikle H 2 O. deiyonize
  4. Pipet dH 2 O 2 mcL alt kaide üzerine, kol alt ve Boş tıklayın. Sadece boş bir sonraki tüm ölçümler, referans ve standartları karşılamak için gerekli.
  5. Alt kaide üzerine herhangi bir protein ile sadece çalışan reaktif ve tampon içeren 2 mcL kısım pipetleme referans oluşturulması. Alt kol ve tıklama ölçün.
  6. Standartları sekmesi altında, istenilen standart ve alt kaide üzerine istenen standart pipet 2 mcL vurgulayın. Alt kol ve tıklama ölçün. Tüm standartları için bu işlemi tekrarlayın. Önce tüm standartlara ölçme örnekleri ölçmek için emin olun. Standart Eğri standart eğri görüntülemek için Göster'i tıklatın.

d. Microvolume BCA Testi Ölçümleri 2 mcL Protein Ölçümleri

  1. Standartlarının tüm ölçülen sonra, Örnekleri düğmesini tıklatın. Örnek kimliğini girin. Örnek alt kaide üzerine 2 mcL Yük ve Ölçme tıklatın. Her bir ölçüm için örnek taze 2 mcL kısım kullanılmalıdır.
  2. Kuru bir laboratuvar silin kullanarak alt ve üst kaideleri örnek silin.

e. Microvolume BCA Testi Ölçümleri Temizleme ve Yenileme

Temizlik ve yenileme doğrudan A280 absorbans ölçümleri açıklandığı gibi gerçekleştirin.

Temsilcisi Sonuçlar:

Microvolume A280 ölçüm doğrudan veya dolaylı bir kolorimetrik tahlil ya protein konsantrasyonu tayini yapılır. A280 ölçüm örnek protein ilgi yok katsayısı dayalı protein konsantrasyonu belirler. BCA kolorimetrik tahlil örneği bilinen protein konsantrasyonları, standart bir eğri tabanlı protein konsantrasyonu belirler.

Discussion

Microvolume kantitatif iki ölçüm yüzeyleri arasında bir sıvı sütunu oluşturmak için bir örnek içsel yüzey gerilimi özellikleri kullanır. Çevreleme cihazın bulunmaması, yol uzunluğu aslında dilüsyonları gerçekleştirmek için ihtiyacı ortadan kaldırarak, gerçek zamanlı olarak değiştirmenize olanak sağlar. Bu özellik, protein konsantrasyonları dinamik aralık gibi ölçüm hızı önemli ölçüde artar. Örnek az miktarda kullanarak, örnekleri çok sayıda bilim adamları daha fazla ölçümleri almak ve daha iyi kalite kontrolü sağlamak için izin hızlı ve doğru bir şekilde analiz edilebilir. Buna ek olarak, ve gerekirse, değerli örnekleri bir ölçüm aldıktan sonra kurtarıldı olabilir. Böyle küçük hacimli ölçülen zaman, örnek homojenlik örnekleme hatalarını önlemek için son derece önemlidir. Düşük tutma pipet uçları her zaman yükleme örnekleri için kullanılan ve örnek çoğaltır arasındaki ipuçlarını değiştirilmesi gerekir. Kaide yüzeyleri düzgün bir şekilde temizlenmeli ve en doğru sonuçları elde etmek için klimalı olmalıdır. Son olarak, örnek sınırlı microvolume spektrofotometre ideal olmakla beraber, kullanım kolaylığı, hız ve geniş dinamik aralık spektrometre örnek bol olduğunda uygun hale.

Disclosures

Yazarlar bu makalede kullanılan reaktifler ve araçları üreten Thermo Fisher Scientific çalışanları.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NanoDrop 2000c Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific, Inc.
Laboratory wipes
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Inc. 23250 Reducing agent compatible
PR-1 Reconditioning Kit Thermo Fisher Scientific, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aitken, A., Learmonth, M. Protein determination by UV absorption. (1996).
  2. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  3. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951).
  4. Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. Use of Coomassie Brilliant Blue G250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrilamide gels. Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).
  5. Simonian, M. H., Smith, J. A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. 10:1A.17. (2006).
  6. Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, F. ujimoto, Goeke, E. K., Olson, N. M., J, B., Klenk, D. C. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
  7. Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Meth. Enzymol. 182, 50-68 (1990).
NanoDrop 2000c Spektrofotometre kullanılarak Microvolume Protein Konsantrasyonu Tayini
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), e1610, doi:10.3791/1610 (2009).More

Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), e1610, doi:10.3791/1610 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter