Osmotische Vermijden in Caenorhabditis elegans: Synaptic Functie van twee genen, orthologen van de Mens NRXN1 En NLGN1, Als kandidaten voor Autisme

Summary

Neurexins en neuroligins zijn membraan-neuron hechting eiwitten die een essentiële rol in synaptische differentiatie en transmissie uit te voeren. Neuroligin gebrekkige mutanten van

Abstract

Neurexins en neuroligins zijn cel adhesie moleculen in exciterende en inhiberende synapsen, en ze zijn verplicht voor een correcte neuron netwerkfunctie ^1. Deze eiwitten zijn te vinden op de presynaptische en postsynaptische membranen ^2. Studies in muizen wijzen erop dat neurexins en neurologins een essentiële rol in synaptische transmissie ¹ hebben. Recente rapporten hebben aangetoond dat een veranderde neuronale verbindingen tijdens de ontwikkeling van het menselijk zenuwstelsel kan de basis van het ontstaan ​​van een groot aantal gevallen van autisme spectrum stoornissen ^drie vormen.

Caenorhabditis elegans kan worden gebruikt als een experimenteel instrument om de studie van het functioneren van synaptische onderdelen daarvan te bevorderen, vanwege zijn eenvoud voor laboratorium experimenten, en gezien het feit dat het zenuwstelsel en de synaptische bedrading volledig is gekarakteriseerd. In C. Elegans NRX-1 en nlg-1 genen orthologe voor de menselijke NRXN1 en NLGN1 genen die coderen voor alfa-neurexin-1 en neuroligin-1 eiwitten, respectievelijk. Bij mensen en nematoden, de organisatie van neurexins en neuroligins is vergelijkbaar met betrekking tot functionele domeinen.

Het hoofd van de nematode bevat de amphid, een zintuig van de nematode, die reacties bemiddelt op verschillende stimuli, waaronder osmotische kracht. De amphid is gemaakt van 12 sensorische bipolaire neuronen met trilharen dendrieten en een axon presynaptische terminal ^4. Twee van deze neuronen, genaamd ASHR en ASHL zijn bijzonder belangrijk in osmotische sensorische functie, het detecteren van water-oplosbare insectenwerende middelen met een hoge osmotische kracht ^5. De dendrieten van deze twee neuronen verlengen tot aan de punt van de mond en de axonen uit te breiden tot de zenuw ring, waar ze synaptische verbindingen met andere neuronen het bepalen van de gedrags-respons ^6.

Voor het evalueren van de implicaties van neurexin en neuroligin in hoge osmotische sterkte te vermijden, laten we de verschillende reactie van C. elegans mutanten defect in de NRX-1 en nlg-1 genen, met behulp van een methode op basis van een 4M fructose ring ^7. De gedrags-fenotypes werden bevestigd met behulp van specifieke RNAi klonen ^8. In C. elegans, kan de dsRNA nodig is om RNAi triggeren worden beheerd door het voeren van ^9. De levering van dsRNA induceert via de voeding van de RNAi interferentie van het gen van belang waardoor de identificatie van genetische componenten en netwerk paden.

Protocol

1: Osmotische vermijden test.

1. Ongeveer 16-24 uur voor de test, pick L4 larvestadium dieren van elk genotype om een nieuwe plaat met NGM OP50 E. coli andincubate het bij 20 ° C. Volgende dag beginnen het experiment met jonge volwassenen.
2. Het is aanbevolen om het uitvoeren van de assay "blind". De platen met elke stam te worden getest moet worden geëtiketteerd door een tweede experimentator, het uitvoeren van de test met behulp van het opnieuw geëtiketteerde platen die zouden worden ontmaskerd als het experiment is voltooid.
3. De dag van de test, bereiden een 4M voorraad oplossing van fructose met 1% Congo Red oplossing en lossen volledig op kamertemperatuur. Wij raden u aan de oplossing voor elke test, omdat de kleurstof kan neerslag met de tijd.
4. Ringvormige ring (1 cm diameter) op NGM plaat is beschreven op het midden van het vast medium, met 15 ul van de rode 4M fructose-oplossing. Laat de fructose oplossing dringen in de agar, dit duurt meestal tussen de 2 en 5 minuten.
5. Plaats individuele jonge volwassen dieren van elke stam binnen de ring en volgt in de komende 10 minuten om de reactie op de osmotische barrière te bepalen. Dieren het vermijden van de ring meer dan zes keer op rij worden geclassificeerd als normaal, die het verlaten van de ring in minder dan zes pogingen worden als ondeugdelijk beschouwd in osmotische gevoeligheid.
   Opmerking: De controle stam moet worden gebruikt in elke test. N2 jonge volwassen dieren worden gebruikt als positieve controles als ze resoluut voorkomen dat de ring barrière. Dieren die eerder zijn uitgehongerd, gepasseerd Dauer larven of afkomstig zijn uit platen die te droog mag niet worden gebruikt. In het begin moet controle dieren worden geëvalueerd in tweevoud, te bevestigen dat de assay platen en de oplossing correct zijn.

2: Het genereren van knock-down wormen door RNAi voeden.

1. RNAi platen: NGM RNAi voeden platen bevat per liter: 17 g agar-agar, 2,5 g pepton, NaCl 3,0 g, 1 ml van 5 mg ^ml-1 cholesterol, vul de kolf met 1 liter met H ₂ O en autoclaaf. Na agar afkoelt tot ongeveer 65 ° C, voeg 25 ml van 1 M KPO _4, pH 6,0, 1 ml van 1 M CaCl _2, 1 ml 1M MgSO _4, 0,5 ml carbenicilline (50 mg ml ^-1) en een ml 1M IPTG. Als je begint met voorbereide solide NGM, smelt vast medium door de magnetron en vervolgens vloeibaar NGM plaats op de bank afkoelen en voeg KPO _4, pH 6,0, CaCl _2, MgSO _4, carbenicilline en IPTG zoals eerder aangegeven.
   
   Voeg 10 ml van NGM in elke 60 mm petrischaal. Laat afkoelen en keer platen handhaven ervan bij RT 's nachts voor gebruik. Platen kunnen worden opgeslagen in een plastic zakje bij 4 ° C gedurende ongeveer 4-5 dagen.
2. Bacteriële voorbereiding en inductie: Isoleer kolonies van E.coli HT115 (DE3) stam, getransformeerd met L4440 vector die een fragment dat overeenkomt met het target-gen, op Luria-Bertani (LB) agar platen (17 g agar, 10 g trypton, 5 g gistextract, en 10 g NaCl per liter) met ampicilline (50 ug / ml) en tetracycline (15 ug / ml).
   
   Kies een kolonie van bacteriën en in de LB met 50 ug / ml ampicilline enten, en geteeld voor 6 8 uur met schudden bij 37 ° C; zaad een daling van deze cultuur op de voorbereide NGM platen en grondig de platen voordat ze incubatie 's nachts droog ( 12 24 uur) bij kamertemperatuur, zodat de bacteriën om te groeien en om inductie te beginnen. De incubatie werd in het donker, omdat tetracycline is lichtgevoelig en kan invloed hebben op de variabiliteit van de RNAi-testen onder de borden.
   
   Het is noodzakelijk om een ​​positieve en een negatieve controle voor RNAi voeren experimenten gebruiken. De positieve controle is E.coli HT115 cel getransformeerd met de L4440 vector die het unc-22 gensequentie. De knock-down van de UNC-22 gen produceert een "trillen fenotype". De negatieve controle is E.coli HT115 cel getransformeerd met lege L4440 vector.
3. Worm handling en scoren: De eerste dag, plaats L4 stadium wormen uit een NGM plaat bezaaid met OP50 op NGM platen zonder bacteriën en incubeer bij 20 ° C gedurende 12 uur (vasten).
   
   De volgende dag, transfer jonge vastte volwassen hermafrodieten op een bord seedded met de bacteriën de uiting van de specifieke target-gen RNAi. Laat 40 tot 48 uur bij 20 ° C tot F1 nakomelingen te genereren.
   
   Plaats dan een paar F1 volwassen wormen op een ander bord bezaaid met dezelfde bacterie. Na 24-48 uur, selecteren en isoleren van de F2 nakomelingen, jong volwassenen (volledig gevormd uitstekende vulva met weinig eieren) en de score voor fenotypes.
   
   Let op: de RNAi inductie in neuronen hebben een aantal beperkingen als gevolg van de vuurvaste eigenschappen van de C elegans zenuwstelsel aan RNAi.. Het overwinnen van de problemen van deze inefficiëntie in neuron is het aanbevolen om de SRF-3 stam, een overgevoelig achtergrond om de effecten van RNAi in neuronen ¹⁰ te gebruiken. In onze experimenten geen differences werden gevonden tussen Bristol N2 en RRF-3 stammen voor de genen en het fenotype geanalyseerd.

3: Stammen gebruikt.

De C. elegans stammen die in dit werk zijn weergegeven in Tabel 1. Mutante stammen waren uit-gekruist tegen N2 wild - type minstens vier keer om ongewenste willekeurige mutaties die hadden kunnen worden gegenereerd tijdens de mutagenese protocol te verwijderen.

. OP50 E coli-stam werd suppliied door Caenorhabditis Genetic Center, University of Minnesota, USA E.coli HT115 (DE3) met het plasmide pL4440 die NRX-1 (JA: C29A12.5). En nlg-1 (JA: C40C9.5 )-gen fragmenten werden verzorgd door dr. Peter Askjaer, Centro Andaluz de biologia del Desarrollo (CABD), CSIC Universidad Pablo Olavide, Sevilla, Spanje.

4: Representatieve resultaten.

Illustratief resultaten zijn weergegeven in de figuren 1 en 2. Tien dieren van elke stam en een minimum van drie replica experimenten werden uitgevoerd.

Figuur 1. Experimenten van de osmotische vermijdingsgedrag.
Controle stammen en NRX-1 (ok1649 en tm1961) V deficiënt mutantworms reageren door het omkeren van achteruit wanneer ze in een osmotische barrière (4M fructose). Nlg-1 (ok259 en tm474) X mutanten niet om deze barrière op te sporen. Dubbele mutanten deficiënt in nlg-1 en NRX-1, stammen CRR21 (ok1649; ok259) VX en CRR23 (tm1961; ok259) VX herstelde het wild type fenotype. De * geeft significante verschillen (P ≤ 0.001) door t-student test, in de reactie van elke stam aan de Bristol N2 wild-type door t-student-test

Figuur 2. Experimenten met knockdown wormen door RNAi voeden.
E.coli HT115 (DE3) getransformeerd met lege pL4440 vector of met een fragment dat overeenkomt met het doel genen NRX-1 of NLG-1 werden gebruikt om gevoed verschillende worm stammen. De * geeft significante verschillen (P ≤ 0.001) door t-student test, in de reactie van de N2 stam bacteriën gevoed met het dragen van de pL4440 vector met een fragment gericht op de nlg-1-gen in vergelijking met de N2 stam gevoed met lege pL4440 vector .

Discussion

Neurexins en neuroligins voeren een essentiële rol in synaptische transmissie ¹¹ en differentiatie van de synaptische verbindingen ^12. Beide moleculen zijn geïdentificeerd als kandidaat-genen voor autisme ^13,14.

In deze video laten we een eenvoudige methode die ons in staat stelt de studie van de invloed van de genen die de osmotische vermijdingsreactie in C. elegans. Neuroligin gebrekkige mutanten defect zijn bij het opsporen van osmotische kracht, maar mutanten deficiënt is in neurexin vertonen een reactie vergelijkbaar met de wild type stam, het vermijden van een 4M fructose-oplossing. Maar als neuroligin mutanten, die niet in staat om de fructose-oplossing te detecteren, ook deficiënt zijn in de neurexin gen, innen zij de wild type fenotype reageren op osmotische sterkte.

Deze observatie werd bevestigd met behulp van een RNAi voeden knockdown aanpak. Zo werd de wild-type stam aangetast in het herkennen van de osmotische barrière toen het werd gevoed met bacteriën uitdrukken van een coderende sequentie van het nlg-1 gen. Maar nlg-1 mutanten, die niet aan de osmotische barrière te detecteren, herstelde deze hoedanigheid toen zij werden gevoed met bacteriën uitdrukken van een coderende sequentie van NRX-1. Deze resultaten geven aan dat neurexin en neuroligin kunnen worden betrokken bij de synapsen van de nematode sensorische neuronen en dat ze met elkaar een ander op een manier die de synaptische functie beïnvloedt.

Materials

Table 1. C. elegans strains. Strain Gene Allele Source Bristol N2 - - aCGC VC228 nlg-1 ok259 CGC FX00474 nlg-1 tm474 bNBP-JAPAN VC1416 nrx-1 ok1649 CGC FX1961 nrx-1 tm1961 NBP-JAPAN NL2099 rrf-3 pk1436 CGC CRR21 nrx-1; nlg-1 ok1649; ok259 This work CRR22 nrx-1; nlg-1 tm1961;ok259 This work a. Caenorhabditis Genetic Center, University of Minnesota, USA. b. National Bioresource Project for the Experimental Animal "Nematode C. elegans". Tokyo Women’s Medical University, Japan.