Осмотическое избежании в Caenorhabditis Элеганс: Synaptic функции двух генов, ортологов прав NRXN1 И NLGN1, В качестве кандидатов на аутизм

Summary

Neurexins и neuroligins являются мембраны нейронов адгезии белков, которые выполняют существенную роль в дифференциации и синаптической передачи. Neuroligin недостаточно мутантов

Abstract

Neurexins и neuroligins являются молекулы адгезии клеток, присутствующих в возбуждающих и тормозных синапсов, а они необходимы для правильного нейронной сети функции ^1. Эти белки находятся на пресинаптических и постсинаптических мембран ^2. Исследования на мышах показали, что neurexins и neurologins играют существенную роль в синаптической передаче ^1. Недавние сообщения показали, что изменило нейронные связи в процессе развития нервной системы человека могло бы стать основой этиологии многочисленные случаи расстройств аутистического спектра ^3.

Caenorhabditis Элеганс могут быть использованы как экспериментальный инструмент для облегчения изучения функционирования синаптических компонентов, благодаря своей простоте для лабораторных экспериментов, и учитывая, что его нервная система и синаптической проводка была полностью описана. В C. Элеганс NRX-1 и NLG-1 гены ортологичных для человека NRXN1 и NLGN1 генов, которые кодируют альфа-neurexin-1 и neuroligin-1 белка, соответственно. В организме человека и нематод, организация neurexins и neuroligins похож по отношению к функциональной области.

Глава содержит нематод амфидов, орган чувств нематоды, которая выступает посредником ответы на различные стимулы, в том числе осмотические силы. Амфидов состоит из 12 сенсорных нейронов биполярного с мерцательным дендритов и один аксон пресинаптических терминал ^4. Два из этих нейронов, названный ASHR и ASHL особенно важны в осмотического сенсорные функции, выявление растворимых в воде репелленты с высокой осмотической силы ^5. Дендритов этих двух нейронов удлинить до кончика рта и аксоны распространяется на нервное кольцо, где они составляют синаптических связей с другими нейронами определения поведенческой реакции ^6.

Для оценки последствий neurexin и neuroligin в высокое осмотическое избежании силы, мы покажем другой ответ С. Элеганс мутантов дефектные в NRX-1 и NLG-1 генов, используя метод, основанный на 4М кольцо фруктозы ^7. Поведенческих фенотипов были подтверждены с использованием специфических клонов RNAi ^8. В С. Элеганс, дсРНК необходимые для запуска RNAi можно вводить путем подачи ^9. Доставка дсРНК через пища вызывает помехи RNAi гена интерес тем самым позволяя идентификация генетических компонентов и сетевых путей.

Protocol

1: Осмотическое анализа избегания.

1. Около 16-24 часов до анализа, выбрать L4 личиночной стадии животных каждого генотипа к свежим пластины NGM содержащие OP50 Е. кишечной andincubate это при 20 ° C. На следующий день начать экспериментировать с молодого возраста.
2. Рекомендуется проводить анализ "вслепую". Пластины с каждого штамма, чтобы быть проанализированы должны быть relabelled на второй экспериментатор, выступая методом с использованием relabelled пластин, которые будут разоблачены, когда эксперимент закончился.
3. День анализа, подготовки 4М маточного раствора фруктозы с 1% раствором конго красный и полностью растворяются при комнатной температуре. Мы рекомендуем проверять решения до каждого теста с красителем может осадок со временем.
4. С кольцевой (1 см в диаметре) на пластине NGM изложена в центре твердой среде, с 15 мкл красный раствор фруктозы 4М. Пусть фруктозы решение впитываться в агар, это обычно занимает от 2 до 5 минут.
5. Место отдельных молодых взрослых животных каждого штамма в пределах кольца и следовать в течение следующих 10 минут, чтобы определить ответ на осмотический барьер. Животные избегая кольцо более чем в шесть раз подряд, классифицируются как нормальное, а те, выходя на ринг в менее шести попыток считается дефектным в осмотической чувствительности.
   Примечание: контрольного штамма необходимо использовать в каждом анализе. N2 молодых взрослых животных используются в качестве положительного контроля, поскольку они решительно избегать кольцо барьер. Животные, которые были ранее голодали, проходили через Dauer личинок или приходят из плит, которые слишком сухой, не должны использоваться. В начале, контрольные животные должны быть оценены в двух экземплярах, чтобы подтвердить, что анализ пластин и решения являются правильными.

2: Генерация нокдаун червей путем подачи RNAi.

1. RNAi плит: NGM пластин RNAi кормления содержит на литр: 17 агар г, 2,5 г пептона, 3,0 г хлористого натрия, 1 мл 5 мг холестерина мл ^-1; заполнить колбе до 1 л Н ₂ О и автоклав. После агар охлаждают до 65 ° С, добавить 25 мл 1 М КПО _4, рН 6,0, 1 мл 1 М CaCl _2, 1 мл 1 М MgSO _4, 0,5 мл карбенициллин (50 мг мл ^-1) и 1 мл 1М IPTG. Если вы начинаете с подготовленными твердых NGM, растопить твердой среде в микроволновую печь, а затем место жидкость NGM на скамейке, чтобы охладиться, а затем добавить КПО _4, рН 6,0, CaCl _2, MgSO _4, карбенициллин и IPTG как указано ранее.
   
   Добавьте 10 мл NGM в каждую 60 мм чашки Петри. Разрешить охлаждения и инвертировать пластин поддержание их при комнатной температуре в течение ночи перед использованием. Плиты можно хранить в полиэтиленовом пакете при температуре 4 ° С в течение 4-5 дней.
2. Бактериальные подготовки и индукции: изолят колоний E.coli HT115 (DE3) напряжения, трансформированные L4440 вектор, содержащий фрагмент, соответствующий ген-мишень, на Лурия-Бертани (LB) агаром (17 г агара, 10 г триптон, 5 г дрожжевой экстракт, и 10 г хлористого натрия на литр), содержащий ампициллин (50 мкг / мл) и тетрациклином (15 мкг / мл).
   
   Выберите колонии бактерий и переливая ее LB с 50 мкг / мл ампициллина, и выращивали в течение 6 8 часов при встряхивании при 37 ° С; семян капля этой культуры на подготовленную пластин NGM и сухие пластины тщательно, прежде чем инкубации в течение ночи ( 12 24 ч) при комнатной температуре, чтобы размножения болезнетворных бактерий и начать индукции. Инкубации в темноте, так как тетрациклин светочувствительных и это может повлиять на изменчивость анализов RNAi между пластинами.
   
   Необходимо использовать положительный и отрицательный контроль для экспериментов RNAi кормления. Положительного контроля является E.coli HT115 ячейки трансформированных L4440 вектор, содержащий UNC-22 последовательности генов. Нокдаун UNC-22 ген производит "подергивания фенотип". Отрицательного контроля является E.coli HT115 клетка превращается в пустую L4440 вектор.
3. Worm обработки и подсчета очков: первый день, место L4 стадии червей пластины NGM засеяно OP50 на NGM пластины без бактерий и инкубировать при 20 ° С в течение 12 часов (натощак).
   
   На следующий день, трансфер молодого постился гермафродитов взрослых на тарелку seedded с бактериями выражения конкретной целевой ген РНК-интерференции. Оставьте 40-48 часов при температуре 20 ° С для получения потомства F1.
   
   Затем поместите несколько F1 червей взрослых на другую пластину посеян с теми же бактериями. После 24-48 часов, выбрать и изолировать от F2 потомства, молодые люди (полностью сформирована выступающими вульвы с несколько яиц) и оценки фенотипов.
   
   Примечание: индукция RNAi в нейроны имеют некоторые ограничения из-за огнеупорные свойства C Элеганс нервной системы РНК-интерференции.. Для преодоления проблем этого неэффективность нейрона рекомендуется использовать СБР-3 штамма, сверхчувствительных фоном к действию RNAi в нейронах ^10. В наших экспериментах не разностныхх годов были найдены между Бристоль N2 и СБР-3 штаммов для генов и фенотипа проанализированы.

3: Штаммы используется.

C. Элеганс штаммы, используемые в данной работе представлены в таблице 1. Мутантные штаммы были вне пересекли против N2 дикие - типа не менее четырех раз, чтобы удалить нежелательные случайных мутаций, которые могли бы быть, образующихся при мутагенеза протокола.

. OP50 E палочки штамма suppliied на Caenorhabditis генетический центр, Университет Миннесоты, США E.coli HT115 (DE3) с плазмидой pL4440 проведения NRX-1 (JA: C29A12.5). И NLG-1 (JA: C40C9.5 фрагменты) гена были предоставлены д-р Питер Askjaer, Centro Andaluz дель-де-Biología Desarrollo (Абд), CSIC Университета Пабло Olavide, Севилья, Испания.

4: представитель результаты.

Иллюстративные результаты представлены на рисунках 1 и 2. Десять животных каждого штамма и не менее трех экспериментов реплики были выполнены.

Рисунок 1. Эксперименты осмотического поведения избегания.
Управление штаммов и NRX-1 (ok1649 и tm1961) V недостаточно mutantworms реагировать путем обращения вспять назад, когда они сталкиваются осмотического барьера (4М фруктоза). NLG-1 (ok259 и tm474) X мутанты не способны обнаружить этот барьер. Двойные мутанты дефицит NLG-1 и NRX-1, штаммы CRR21 (ok1649; ok259) и VX CRR23 (tm1961; ok259) VX восстановления дикой фенотип типа. * Указывает на существенные различия (р ≤ 0,001) Т-студент испытания, в ответ каждого штамма к Bristol N2 дикого типа Т-студент тест

Рисунок 2. Эксперименты с нокдауна червей путем подачи RNAi.
E.coli HT115 (DE3) преобразуется с пустыми pL4440 вектор или содержащих фрагмент, соответствующий генов-мишеней NRX-1 или NLG-1 были использованы для кормили разными штаммами червей. * Указывает на существенные различия (р ≤ 0,001) Т-студент тест, в реакции N2 напряжение подается с бактериями проведения pL4440 вектор с фрагментом ориентации NLG-1 гена по сравнению с N2 напряжение подается с пустыми pL4440 вектор .

Discussion

Neurexins и neuroligins выполняют существенную роль в синаптической передачи ¹¹ и дифференциации синаптических связей ^12. Обе молекулы были определены в качестве генов-кандидатов для аутизма ^13,14.

В этом видео мы покажем простой метод, который позволяет изучать влияние генов, влияющих на осмотическое реакция избегания у C. Элеганс. Neuroligin недостаточно мутантов дефектные в обнаружении осмотической силы, но мутанты дефицит neurexin показать ответ похож на дикого типа, избегая 4М раствор фруктозы. Однако, когда neuroligin мутантов, которые не в состоянии обнаружить фруктозу решение, также дефицит neurexin гена, они выздоравливают дикий фенотип типа в ответ на осмотические силы.

Это наблюдение было подтверждено с помощью РНК-интерференции нокдаун кормления подход. Таким образом, дикого типа была нарушена в признании осмотического барьера, когда она была кормить бактерии выражения кодирующей последовательности NLG-1 гена. Но NLG-1 мутантов, которые не в состоянии обнаружить осмотического барьера, восстановить эту способность, когда их кормили с бактериями, выразив кодирующей последовательности NRX-1. Эти результаты показывают, что neurexin и neuroligin могут быть вовлечены в синапсах нематоды сенсорных нейронов, и что они взаимодействуют друг с другом таким образом, что влияет на синаптическую функцию.

Materials

Table 1. C. elegans strains. Strain Gene Allele Source Bristol N2 - - aCGC VC228 nlg-1 ok259 CGC FX00474 nlg-1 tm474 bNBP-JAPAN VC1416 nrx-1 ok1649 CGC FX1961 nrx-1 tm1961 NBP-JAPAN NL2099 rrf-3 pk1436 CGC CRR21 nrx-1; nlg-1 ok1649; ok259 This work CRR22 nrx-1; nlg-1 tm1961;ok259 This work a. Caenorhabditis Genetic Center, University of Minnesota, USA. b. National Bioresource Project for the Experimental Animal "Nematode C. elegans". Tokyo Women’s Medical University, Japan.