Osmotiska skatteundandragande i Caenorhabditis elegans: Synaptic funktion av två gener, Orthologues de mänskliga NRXN1 Och NLGN1, Som kandidater för Autism

Summary

Neurexins och neuroligins är membran-neuron vidhäftning proteiner som utför viktiga roller i synaptiska differentiering och överföring. Neuroligin bristfällig mutanter av

Abstract

Neurexins och neuroligins är cell adhesionsmolekyler finns i retande och hämmande synapser, och de krävs för korrekta neuron nätet fungerar ^1. Dessa proteiner finns på presynaptiska och postsynaptiska membran ^2. Studier på möss visar att neurexins och neurologins har en viktig roll i synaptisk transmission ^1. Färska rapporter har visat att förändrat neuronala kontakter under utvecklingen av det mänskliga nervsystemet kan utgöra grundval av etiologi många fall av autismspektrumstörningar ^3.

Caenorhabditis elegans kan användas som en experimentell verktyg för att underlätta studier av hur synaptiska komponenter grund av dess enkelhet för laboratorie-experiment, och med tanke på att dess nervsystem och synaptic ledningar helt har präglats. I C. Elegans NRX-1 och NLG-1 gener orthologous för människors NRXN1 och NLGN1 gener som kodar för alfa-neurexin-1 och neuroligin-1 proteiner, respektive. Hos människa och nematoder, är organisationen av neurexins och neuroligins liknande i förhållande till funktionella domäner.

Chefen för nematoder innehåller amphid, ett sinnesorgan av nematod, som förmedlar svar på olika stimuli, däribland osmotisk styrka. Den amphid är tillverkad av 12 sensoriska bipolära nervceller med cilierade dendriter och en presynaptiska terminalen Axon ^4. Två av dessa nervceller, som heter ASHR och ASHL är särskilt viktiga i osmotiska sensorisk funktion, upptäcka vattenlösliga repellenter med höga osmotiska styrka ^5. Den dendriter av dessa två nervceller förlänger till spetsen i munnen och axoner sträcker sig till nerv-ringen, där de gör synaptiska kontakter med andra nervceller bestämma beteendemässiga svar ^6.

För att utvärdera effekterna av neurexin och neuroligin i höga osmotiska styrka undvikande visar vi olika svar C. elegans mutanter defekt i NRX-1 och NLG-1 gener, med hjälp av en metod som bygger på en 4M fruktos ring ^7. Den beteendemässiga fenotyper bekräftades med specifika RNAi kloner ^8. I C. elegans kan dsRNA för att utlösa RNAi administreras av utfodring ^9. Leveransen av dsRNA via livsmedel inducerar RNAi inblandning av genen av intresse vilket gör det möjligt att identifiera genetiska komponenter och vägar nätverk.

Protocol

1: Osmotisk undvikande analys.

1. Om 16-24 timmar före analysen, plocka L4 larvstadiet djur av varje genotyp till en ny NGM skylt som innehåller OP50 E. coli andincubate det vid 20 ° C. Nästa dag startar försöket med unga vuxna.
2. Det rekommenderas att utföra testet "blint". Plattorna med varje stam som ska analyseras bör märkas med en andra försöksledaren, analysen utförs med hjälp av ommärkta plattor som skulle avslöjas när försöket har avslutats.
3. Dagen för analysen, förbereda en 4M stamlösning av fruktos med 1% Kongo Röd lösning och lös upp den helt i rumstemperatur. Vi rekommenderar att en lösning före varje analys, eftersom färgen kan framkalla med tiden.
4. Kamgängad (1 cm diameter) på NGM Plattan beskrivs på mitten av fast substrat, med 15 ìl av röda 4M fruktos lösning. Låt fruktos lösningen tränga in i agar sker detta vanligtvis mellan 2 och 5 minuter.
5. Placera enskilda unga vuxna djur av varje stam inom ringen och följa under de kommande 10 minuter att avgöra svaret på den osmotiska barriären. Djur undvika ringen mer än sex gånger i rad klassificeras som normala, de spännande ringen på mindre än sex försök anses bristfällig i osmotiska känslighet.
   Obs: kontrollera stammen måste användas i varje analys. N2 unga vuxna djur används som positiva kontroller som de avgörande undvika ringen barriär. Djur som tidigare har svalt, passerade genom Dauer larver eller kommer från plattor som är för torr bör inte användas. I början bör kontrollera djur utvärderas i två exemplar, för att bekräfta att analysen tallrikar och lösningen är korrekta.

2: Generering av ÖVERVÄLDIGANDE maskar av RNAi utfodring.

1. RNAi plattor: NGM RNAi utfodring plattor innehåller per liter: 17 g agar, 2,5 g pepton, 3,0 g NaCl, 1 ml 5 mg ml ^-1 kolesterol, fyll kolven till 1 liter med H ₂ O och autoklav. Efter agar kyls till ca 65 ° C, tillsätt 25 ml 1 M KPO _4, pH 6,0, 1 ml 1 M CaCl _2, 1 ml 1M MgSO _4, 0,5 ml Carbenicillin (50 mg ml ^-1) och 1 ml 1M IPTG. Om du börjar med förberedda solida NGM, smälta fast medium av mikrovågsugnen och därefter placera flytande NGM på bänken svalna och lägg sedan till KPO _4, pH 6,0, CaCl _2, MgSO _4, Carbenicillin och IPTG vilket redan nämnts.
   
   Tillsätt 10 ml av NGM i varje 60 mm petriskål. Låt kyla och invertera tallrikar behålla dem vid RT natten före användning. Plattorna kan lagras i en plastpåse vid 4 ° C i ca 4-5 dagar.
2. Bakteriell förberedelse och induktion: Isolera kolonier av E. coli HT115 (DE3) stam, omvandlas med L4440 vektor som innehåller ett fragment motsvarande målgenen, på Luria-Bertani (LB) agarplattor (17 g agar, 10 g trypton, 5 g jästextrakt, och 10 g NaCl per liter) som innehåller ampicillin (50 mikrogram / ml) och tetracyklin (15 mikrogram / ml).
   
   Välj en koloni av bakterier och ympa in i LB med 50 mikrogram / ml ampicillin och odlas för 6 8 h med skaka vid 37 ° C, frö en droppe av denna kultur på det färdigställda NGM tallrikar och torka plattorna ordentligt innan inkubering över natten ( 12 24 h) vid rumstemperatur så att bakterier att växa och börja induktion. Inkubationen var i mörker, eftersom tetracyklin är ljuskänslig och det kan påverka variationen av RNAi analyser bland plattorna.
   
   Det är nödvändigt att använda en positiv och en negativ kontroll av RNAi utfodring experiment. Den positiva kontrollen är E.coli HT115 cellen omvandlas med L4440 vektor som innehåller UNC-22 gensekvens. Den ÖVERVÄLDIGANDE av UNC-22 genen producerar ett "ryckningar fenotyp". Den negativa kontrollen är E.coli HT115 cellen omvandlas med tomma L4440 vektor.
3. Worm hantering och poängsättning: Den första dagen, placera L4 scenen maskar från ett NGM tallrik ympats med OP50 på NGM tallrikar utan bakterier och inkubera vid 20 ° C i 12 timmar (fastande).
   
   Nästa dag, överföring unga fastade vuxna hermafroditer på en tallrik seedded med de bakterier som uttrycker något specifikt mål genen RNAi. Lämna 40-48 timmar vid 20 ° C för att generera F1-avkomma.
   
   Lägg sedan ett par F1 vuxna maskar på en annan tallrik ympats med samma bakterier. Efter 24-48 timmar, välja ut och isolera från F2 avkomma, unga vuxna (fullt utvecklade utskjutande vulva med få ägg) och poäng för fenotyper.
   
   Obs: RNAi induktion i nervceller har vissa begränsningar på grund av eldfasta egenskaper C elegans nervsystemet till RNAi.. För att övervinna problemen med denna ineffektivitet i Neuron är det rekommenderat att använda RRF-3 stam, en överkänslig bakgrunden till effekterna av RNAi i nervceller ^10. I våra experiment ingen skillnad näres hittades mellan Bristol N2 och RRF-3 stammar för gener och fenotyp analyseras.

3: stammar som används.

C. elegans stammar som används i detta arbete visas i tabell 1. Mutant stammar var ute och tvärs mot N2 vild - typ minst fyra gånger för att ta bort oönskade slumpmässiga mutationer som kunde ha genererats under mutagenes protokollet.

. OP50 E coli stam var suppliied av Caenorhabditis Genetiska Center, University of Minnesota, USA E.coli HT115 (DE3) med plasmiden pL4440 bär NRX-1 (JA: C29A12.5). Och gulden-1 (JA: C40C9.5 gen) fragment lämnades av Dr Peter Askjaer, Centro Andaluz de Biologia del Desarrollo (CABD), CSIC Universidad Pablo Olavide, Sevilla, Spanien.

4: representativa resultat.

Belysande resultat är representerade i figur 1 och 2. Tio djur av varje stam och minst tre replik experiment genomfördes.

Figur 1. Experiment av osmotiska undvikande beteende.
Kontroll stammar och NRX-1 (ok1649 och tm1961) V bristfällig mutantworms svara genom att vända bakåt när de stöter på en osmotisk barriär (4M fruktos). Gulden-1 (ok259 och tm474) X mutanter inte upptäcker denna barriär. Dubbel mutanter bristfällig i NLG-1 och NRX-1, stammar CRR21 (ok1649, ok259) VX och CRR23 (tm1961, ok259) VX återhämtade den vilda typen fenotyp. * Indikerar signifikanta skillnader (p ≤ 0,001) med t-elev test, i svaret på varje stam till Bristol N2 vildtyp av t-student testa

Figur 2. Experiment med ÖVERVÄLDIGANDE maskar av RNAi utfodring.
E.coli HT115 (DE3) omvandlas med tomma pL4440 vektor eller innehåller ett fragment motsvarande mål gener NRX-1 var eller NLG-1 används för att matas olika mask stammar. * Indikerar signifikanta skillnader (p ≤ 0,001) med t-elev test, i svaret på N2 stam matas med bakterier som bär pL4440 vektor med ett fragment med inriktning på NLG-1-genen i jämförelse med N2 stam matas med tomma pL4440 vektor .

Discussion

Neurexins och neuroligins utföra viktiga roller i synaptisk transmission ¹¹ och differentiering av synapsförbindelser ^12. Båda molekyler har identifierats som kandidatgener för autism ^13,14.

I denna video visar vi en enkel metod som tillåter oss att studera effekten av gener som påverkar osmotiska undvikande svar i C. elegans. Neuroligin bristfällig mutanter är defekta i att upptäcka osmotiska krafter, men mutanter brist på neurexin visar ett svar som liknar den vilda stammen, för att undvika en 4M fruktos lösning. Men när neuroligin mutanter, som inte kan upptäcka fruktos lösning, är också bristfällig i de neurexin genen, återställa de den vilda typen fenotypen svara på osmotiska styrka.

Denna iakttagelse bekräftades med hjälp av en RNAi synsätt utfodring knockdown. Således var den vilda stammen nedsatt att erkänna det osmotiska hindret när det var matas med bakterier som uttrycker en kodande sekvens av gulden-1 genen. Men gulden-1 mutanter, som misslyckas med att upptäcka osmotiska barriären, återhämtade denna kapacitet när de matas med bakterier som uttrycker en kodande sekvens NRX-1. Dessa resultat indikerar att neurexin och neuroligin kan vara inblandade vid synapser nematoder sensoriska neuroner och att de interagerar med varje annan på ett sätt som påverkar synaptisk funktion.

Materials

Table 1. C. elegans strains. Strain Gene Allele Source Bristol N2 - - aCGC VC228 nlg-1 ok259 CGC FX00474 nlg-1 tm474 bNBP-JAPAN VC1416 nrx-1 ok1649 CGC FX1961 nrx-1 tm1961 NBP-JAPAN NL2099 rrf-3 pk1436 CGC CRR21 nrx-1; nlg-1 ok1649; ok259 This work CRR22 nrx-1; nlg-1 tm1961;ok259 This work a. Caenorhabditis Genetic Center, University of Minnesota, USA. b. National Bioresource Project for the Experimental Animal "Nematode C. elegans". Tokyo Women’s Medical University, Japan.