التناضحي في تجنب انواع معينة ايليجانس : وظيفة متشابك من اثنين من الجينات ، Orthologues لحقوق الإنسان NRXN1 و NLGN1 ، كمرشحين للتوحد

Summary

وNeurexins neuroligins هي بروتينات التصاق الأغشية العصبية التي تؤدي أدوارا أساسية في التمايز متشابك والإرسال. المسوخ Neuroligin قصور

Abstract

وNeurexins neuroligins هي جزيئات التصاق الخلية موجودة في نقاط الاشتباك العصبي مثير والمثبطة ، وكانت مطلوبة لتصحيح أداء الشبكة العصبية ^1. وتوجد هذه البروتينات في أغشية قبل المشبكي وبعد المشبكي ^2. الدراسات على الفئران تشير إلى أن neurexins وneurologins دورا أساسيا في نقل متشابك ^1. وقد أظهرت تقارير حديثة أن الاتصالات العصبية تتغير خلال تطوير النظام العصبي البشري يمكن أن تشكل أساسا لمسببات حالات عديدة من اضطرابات طيف التوحد ^3.

ويمكن استخدام انواع معينة ايليجانس كأداة تجريبية لتسهيل الدراسة للعمل العناصر متشابك ، وذلك بسبب بساطتها عن التجارب المختبرية ، ونظرا لأنه تم نظامه العصبي والأسلاك متشابك تتميز بشكل كامل. في سي. ايليجانس nrx - 1 - 1 NLG والجينات هي الجينات لorthologous NRXN1 وNLGN1 الإنسان التي ترميز ألفا neurexin - 1 - 1 neuroligin والبروتينات ، على التوالي. في البشر ، والديدان ، وتنظيم وneurexins neuroligins مشابهة فيما يتعلق المجالات الوظيفية.

رئيس الخيطية تحتوي على amphid ، وهو جهاز الحسية من الديدان الخيطية ، التي تتوسط استجابات لمثيرات مختلفة ، بما في ذلك قوة التناضحي. وأدلى amphid من 12 العصبونات الحسية بين القطبين مع التشعبات مهدبة واحد محوار المحطة قبل المشبكي ^4. اثنين من هذه الخلايا العصبية ، ويدعى ASHR ASHL تكتسب أهمية خاصة في وظيفة حسية التناضحي وكشفها للذوبان في الماء مع القوة الطاردة الأوسمي ^5. والتشعبات من هذه الخلايا العصبية لإطالة two غيض من الفم ، وتمتد لتشمل محاور الحلقة العصبية ، حيث أنها إجراء اتصالات متشابك مع الخلايا العصبية الأخرى تحديد الاستجابة السلوكية ^6.

لتقييم الآثار المترتبة على neurexin وneuroligin في تجنب ارتفاع قوة التناضحي ، نظهر استجابة مختلفة من المسوخ ايليجانس جيم معيبة في nrx - 1 - 1 NLG والجينات ، وذلك باستخدام أسلوب يستند على حلقة الفركتوز 4M ^7. وأكد الظواهر السلوكية المحددة باستخدام الحيوانات المستنسخة رني ^8. في C. ايليجانس ، يمكن أن تدار الرنا المزدوج الجديلة المطلوبة لتحريك رني عن طريق تغذية ^9. تسليم الرنا المزدوج الجديلة عن طريق الغذاء الحث على التدخل رني من الجينات في المصالح مما يتيح تحديد المكونات الجينية ومسارات الشبكة.

Protocol

1 : تنافذي مقايسة الإبطال.

1. حوالي 16-24 ساعة قبل الفحص ، واختيار الحيوانات L4 مرحلة اليرقات من النمط الجيني لكل لوحة NGM الطازجة التي تحتوي على OP50 E. القولونية andincubate إليها في 20 درجة مئوية. وفي اليوم التالي تبدأ التجربة مع البالغين الشبان.
2. فمن المستحسن لتنفيذ فحص "عمياء". وينبغي لوحات relabelled مع كل سلالة أن يعاير من قبل المجرب الثانية ، أداء الفحص باستخدام لوحات relabelled أن المقنعة عند التجربة قد انتهت.
3. في يوم الفحص ، وإعداد محلول المخزون 4M من الفركتوز مع 1 ٪ محلول الأحمر الكونغو وتذوب تماما في درجة حرارة الغرفة. نوصي بالتحقق من حل قبل كل مقايسة منذ الصبغة قد يعجل مع مرور الوقت.
4. تم تفصيلها الحلقة الحلقي (1 قطرها سم) على لوحة NGM على مركز المتوسطة الصلبة ، مع 15 ميكرولتر من الحل 4M الفركتوز الحمراء. اسمحوا الحل الفركتوز نقع في آغار ، وهذا عادة ما يستغرق ما بين 2 و 5 دقائق.
5. مكان الحيوانات الفردية الشباب البالغين من كل سلالة داخل الحلبة ومتابعة على مدى 10 دقيقة المقبل لتحديد ردا على حاجز التناضحي. وتصنف الحيوانات تجنب الحلقة أكثر من ست مرات في صف واحد كما هو معتاد ، وتعتبر تلك التي تخرج من الحلبة في أقل من ست محاولات معيبة في حساسية التناضحي.
   ملاحظة : يجب استخدام سلالة تحكم في كل فحص. وتستخدم الحيوانات N2 الشباب البالغين والضوابط الإيجابية لأنها حاسمة تجنب حاجز الحلبة. لا ينبغي أن الحيوانات التي تم تجويع من قبل ، مرت Dauer اليرقات أو تأتي من الأطباق التي هي جافة جدا يمكن استخدامها. في بداية ، ينبغي تقييم التحكم في الحيوانات مكررة ، لتأكيد أن لوحات مقايسة والحل الصحيح.

2 : انشاء ضربة قاضية من الديدان عن طريق تغذية رني.

1. رني لوحات : لوحات NGM التغذية رني يحتوي على لتر الواحد : 17 ز آغار ، 2،5 ز ببتون ، 3.0 غرام كلوريد الصوديوم ، 1 مل من 5 ملغ كوليسترول ^-1 مل ؛ ملء القارورة إلى 1 ليتر مع H ₂ O والأوتوكلاف. بعد آغار يبرد إلى حوالي 65 درجة مئوية ، إضافة 25 مل من KPO M 1 ₄ ، ودرجة الحموضة 6.0 ، 1 مل من CaCl M 1 ₂ ، 1 مل من 1M MgSO ₄ ، 0،5 مل كربنيسيلين (50 ملغ مل ^-1) و 1 مل IPTG 1M. إذا كنت بدأت مع NGM الصلبة المعدة ، تذوب المتوسطة الصلبة عن طريق الميكروويف والمكان في وقت لاحق NGM السائل على مقاعد البدلاء لتبرد ثم قم بإضافة ₄ KPO ، ودرجة الحموضة 6.0 ، CaCl ₂ ، MgSO ₄ ، كربنيسيلين IPTG وعلى النحو المبين سابقا.
   
   إضافة 10 مل من NGM في كل طبق بتري 60 مم. تسمح التبريد والحفاظ على عكس لوحات لهم RT بين عشية وضحاها قبل الاستخدام. ويمكن تخزين لوحات في كيس من البلاستيك في 4 درجات مئوية لمدة 4-5 أيام.
2. البكتيرية إعداد والاستقراء : عزل مستعمرات القولونية HT115 (DE3) سلالة ، تحولت مع L4440 متجه تحتوي على جزء المقابلة لهذا الجين المستهدف ، على لوريا ، Bertani (LB) لوحات أجار (17 آغار ز ، 10 ز تريبتون ، 5 ز خلاصة الخميرة ، و 10 غرام لكل لتر كلوريد الصوديوم) التي تحتوي على أمبيسلين (50 ميكروغرام / مل) ، وtetracyclin (15 ميكروغرام / مل).
   
   اختيار مستعمرة من البكتيريا وتلقيح في LB مع 50 ميكروغرام / مل الأمبيسلين ، ونمت لمدة 6 8 ساعات مع اهتزاز عند 37 درجة مئوية ؛ البذور قطرة من هذه الثقافة على استعداد لوحات NGM والجافة لوحات بدقة قبل أن تفرخ بين عشية وضحاها ( 12 24 ح) في درجة حرارة الغرفة للسماح للبكتيريا لتنمو وتبدأ التعريفي. كانت الحضانة في الظلام بسبب التتراسيكلين خفيف الحساسة والتي قد تؤثر في تقلب المقايسات رني بين لوحات.
   
   فمن الضروري استخدام الإيجابية والسلبية لمراقبة التغذية للتجارب رني. الرقابة الإيجابية القولونية HT115 الخلية تتحول مع ناقلات L4440 تحتوي على التسلسل الجيني UNC - 22. في ضربة قاضية للUNC 22 جينة تنتج "النمط الظاهري الوخز". التحكم السلبي القولونية HT115 الخلية تتحول مع ناقلات L4440 فارغة.
3. وسجل تداول دودة : اليوم الأول ، ومحل الديدان المرحلة L4 من لوحة NGM المصنفة على لوحات OP50 مع NGM دون البكتيريا واحتضان عند 20 درجة مئوية لمدة 12 ساعة (الصوم).
   
   في اليوم التالي ، نقل الشباب المخنثين الكبار صام على طبق من ذهب seedded مع البكتيريا التعبير عن الجينات المستهدفة المحددة رني. ترك 40-48 ساعة عند 20 درجة مئوية لتوليد ذرية F1.
   
   ثم ضع بضع الديدان البالغة F1 على لوحة أخرى المصنف مع البكتيريا نفسها. بعد 24-48 ساعة ، حدد وعزل من ذرية F2 ، الشباب (متخلقا الفرج جاحظ مع البيض قليلة) ودرجة عن الظواهر.
   
   ملاحظة : للتحريض رني في الخلايا العصبية لديك بعض القيود بسبب الخواص الحرارية للنظام العصبي لجيم ايليجانس رني. للتغلب على مشاكل عدم الكفاءة في هذه الخلايا العصبية من المستحسن استخدام قوة الرد السريع سلالة - 3 ، على خلفية شديدة الحساسية لآثار رني في الخلايا العصبية ^10. في تجاربنا لا differencتم العثور على وفاق بين N2 بريستول وقوة الرد السريع سلالات - 3 لتحليل الجينات والنمط الظاهري.

3 : استخدام السلالات.

وجيم وتظهر سلالات ايليجانس المستخدمة في هذا العمل في الجدول 1. وكانت سلالات متحولة خارج عبرت ضد N2 البرية -- اكتب أربع مرات على الأقل لإزالة الطفرات العشوائية غير المرغوب فيها التي قد يكون تم إنشاؤها خلال بروتوكول الطفرات.

وكان suppliied OP50 القولونية E السلالة الوراثية بواسطة انواع معينة مركز جامعة مينيسوتا ، الولايات المتحدة الأمريكية القولونية HT115 (DE3) مع pL4440 بلازميد يحمل nrx - 1 (JA : C29A12.5).. وNLG - 1 (JA : C40C9.5 وقدمت شظايا الجينات) من قبل الدكتور بيتر Askjaer ، ومركز الأندلس دي Biología ديل Desarrollo (CABD) ، CSIC جامعة بابلو Olavide ، اشبيلية ، اسبانيا.

4 : نتائج الممثل.

وتتمثل النتائج توضيحية في أرقام 1 و 2. ونفذت عشرة الحيوانات من كل الضغوط والحد الأدنى من التجارب المتماثلة ثلاثة من أصل.

الشكل 1. تجارب سلوك التهرب التناضحي.
سلالات السيطرة وnrx - 1 (ok1649 وtm1961) mutantworms الخامس قاصرة عن طريق عكس الاستجابة الى الوراء عندما كانت تواجه عقبة التناضحي (4M الفركتوز). NLG - 1 (ok259 وtm474) المسوخ X تفشل في الكشف عن هذا الحاجز. تعافى VX النمط الظاهري نوع البرية المسوخ مضاعفة نقص في NLG - 1 و nrx - 1 ، سلالات CRR21 (ok1649 ؛ ؛ ok259) VX وCRR23 (ok259 tm1961). * يشير إلى فروق ذات دلالة إحصائية (P ≤ 0.001) من تصميم t - الطالب الاختبار ، في استجابة كل سلالة لN2 بريستول البرية من نوع T - بواسطة الطالب الاختبار

الشكل 2. تجارب على الديدان عن طريق تغذية رني ضربة قاضية.
القولونية HT115 (DE3) تحولت مع ناقلات pL4440 فارغة أو تحتوي على جزء المقابلة للجينات الهدف nrx - 1 استخدمت أو NLG 1 إلى سلالات تتغذى دودة مختلفة. * يشير إلى فروق ذات دلالة إحصائية (P ≤ 0.001) من تصميم t - الطالب الاختبار ، في التصدي للسلالة N2 البكتيريا التي تتغذى على تحمل ناقلات pL4440 بشظية استهداف NLG - 1 الجينات بالمقارنة مع سلالة N2 تتغذى على ناقلات pL4440 فارغة .

Discussion

وNeurexins neuroligins أداء أدوار أساسية في انتقال متشابك ¹¹ و تمايز اتصالات متشابك ^12. وقد تم تحديد كل من الجزيئات والجينات المرشحة لمرض التوحد ^13،14.

في هذا الفيديو نظهر طريقة بسيطة التي تسمح لنا لدراسة تأثير الجينات التي تؤثر في استجابة تجنب التناضحي في C. ايليجانس. المسوخ Neuroligin ناقصة معيبة في الكشف عن قوة ناضح ، ولكن نقص في المسوخ neurexin اظهار استجابة مشابهة لنوع السلالة البرية ، وتجنب الحل الفركتوز 4M. ولكن عندما neuroligin المسوخ ، والتي هي غير قادرة على الكشف عن حل الفركتوز ، هي أيضا من نقص في الجين neurexin ، فإنها استعادة النمط الظاهري نوع الاستجابة للقوة البرية التناضحي.

وقد أكدت هذه الملاحظة باستخدام ضربة قاضية التغذية رني النهج. وبالتالي ، كان ضعف السلالة النوع البري في التعرف على الحاجز التناضحي عندما كان يأكل مع البكتيريا التعبير عن تسلسل ترميز الجين NLG - 1. لكنه تعافى NLG - 1 المسوخ ، والتي تعجز عن اكتشاف الحاجز التناضحي ، هذه القدرة عندما كانت تتغذى البكتيريا مع التعبير عن تسلسل ترميز nrx - 1. هذه النتائج تشير إلى أن قد يكون متورطا neurexin neuroligin وعند نهايات الخلايا العصبية الحسية الخيطية ، وأنها تتفاعل مع بعضها البعض في الطريقة التي تؤثر على وظيفة متشابك.

Materials

Table 1. C. elegans strains. Strain Gene Allele Source Bristol N2 - - aCGC VC228 nlg-1 ok259 CGC FX00474 nlg-1 tm474 bNBP-JAPAN VC1416 nrx-1 ok1649 CGC FX1961 nrx-1 tm1961 NBP-JAPAN NL2099 rrf-3 pk1436 CGC CRR21 nrx-1; nlg-1 ok1649; ok259 This work CRR22 nrx-1; nlg-1 tm1961;ok259 This work a. Caenorhabditis Genetic Center, University of Minnesota, USA. b. National Bioresource Project for the Experimental Animal "Nematode C. elegans". Tokyo Women’s Medical University, Japan.