Biology

आसमाटिक बचाव में Caenorhabditis एलिगेंस: दो जीन की synaptic समारोह, मानव के Orthologues और Autism के लिए के रूप में उम्मीदवार

Published: December 11, 2009 doi: 10.3791/1616

Fernando Calahorro^1,2, Encarna Alejandre^1,2, Manuel Ruiz-Rubio^1,2

¹Departamento de Genética, Facultad de Ciencias, Universidad de Córdoba, ²Instituto Maimónides de Investigación Biomédica de Córdoba (IMIBIC)

Summary

Neurexins और neuroligins झिल्ली न्यूरॉन आसंजन प्रोटीन है जो synaptic भेदभाव और प्रसारण में आवश्यक भूमिका प्रदर्शन कर रहे हैं. Neuroligin की कमी म्यूटेंट

Protocol

1: आसमाटिक परिहार परख.

परख पहले के बारे में 16-24 घंटे, एक ताजा एन जी एम OP50 ई. युक्त थाली L4 प्रत्येक जीनोटाइप के लार्वा चरण जानवरों लेने कोलाई यह 20 डिग्री सेल्सियस पर andincubate अगले दिन युवा वयस्कों के साथ प्रयोग शुरू करते हैं.
यह परख "आँख बंद करके" बाहर ले करने के लिए सिफारिश की है. प्रत्येक assayed हो तनाव के साथ प्लेटें एक दूसरे experimenter द्वारा relabelled होना चाहिए, relabelled प्लेटें कि जब प्रयोग समाप्त हो गया है बेपर्दा हो जाएगा का उपयोग परख प्रदर्शन.
परख के दिन, 1% कांगो लाल समाधान के साथ fructose के एक 4M शेयर समाधान तैयार करने और पूरी तरह से कमरे के तापमान पर भंग. हम समाधान की जाँच करने से पहले प्रत्येक परख अनुशंसा करते हैं के बाद से डाई समय के साथ वेग सकता.
एन जी एम थाली पर कुंडलाकार अंगूठी (1 सेमी व्यास) ठोस माध्यम से केंद्र पर उल्लिखित है, लाल 4M fructose समाधान के 15 μl के साथ. Fructose समाधान अगर में लेना, यह आम तौर पर 2 और 5 मिनट के बीच लेता है.
व्यक्तिगत अंगूठी के भीतर प्रत्येक तनाव के युवा वयस्क जानवरों प्लेस और अगले 10 मिनट पर पालन आसमाटिक बाधा के जवाब निर्धारित करने के लिए. एक पंक्ति में छह बार से अधिक की अंगूठी से बचने पशु सामान्य रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं, उन में कम से कम छह प्रयास अंगूठी निकल आसमाटिक संवेदनशीलता में दोषपूर्ण माना जाता है.
नोट: नियंत्रण तनाव प्रत्येक परख में इस्तेमाल किया जाना चाहिए. N2 युवा वयस्क जानवरों सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं के रूप में वे निर्णायक अंगूठी बाधा से बचने के. पशु कि पहले भूखे गया है, Dauer लार्वा के माध्यम से पारित कर रहे हैं या प्लेटें कि भी सूख रहे हैं से आ का इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए. शुरुआत में, नियंत्रण जानवरों को दो प्रतियों में मूल्यांकन किया जाना चाहिए, पुष्टि करते हैं कि परख प्लेटें और समाधान सही हैं.

2: आरएनएआई खिला द्वारा पछाड़ना कीड़े का सृजन.

आरएनएआई प्लेटें: एन जी एम आरएनएआई खिला प्लेटें प्रति लीटर शामिल: 17 छ अगर, 2,5 छ peptone, 3.0 ग्राम NaCl, 5 मिलीग्राम मिलीलीटर ^-1 कोलेस्ट्रॉल के 1 मिलीग्राम, 1 लीटर के लिए एच ₂ हे और आटोक्लेव के साथ फ्लास्क भरने . के बाद अगर के बारे में 65 के लिए ठंडा डिग्री सी, 1 एम ₄ केपीओ, 6.0 पीएच, 1 एम 1 ₂ CaCl, 1M MgSO _4, 0,5 मिलीलीटर carbenicillin (50 मिलीग्राम ^-1 मिलीलीटर) और 1 के 1 मिलीलीटर के मिलीलीटर की 25 मिलीलीटर जोड़ने मिलीलीटर 1M IPTG. यदि आप तैयार ठोस एन जी एम के साथ शुरू कर रहे हैं, microwaving द्वारा ठोस मध्यम पिघल और बाद में शांत करने के लिए और _फिर 4 केपीओ, 6.0 _{पीएच,} 2 _CaCl, 4 MgSO carbenicillin और IPTG जोड़ने के रूप में पहले संकेत दिया बेंच पर तरल एन जी एम जगह.

प्रत्येक 60 मिमी पेट्री डिश में एन जी एम के 10 मिलीलीटर जोड़ें. ठंडा करने की अनुमति दें और प्लेट पलटना उन्हें प्रयोग करने से पहले रात भर आरटी पर बनाए रखने. प्लेट्स 4 ° C पर एक प्लास्टिक की थैली में बारे में 4-5 दिनों के लिए भंडारित किया जा सकता है.
बैक्टीरियल तैयारी और प्रेरण: ई. कोलाई HT115 (DE3) तनाव की कालोनियों, L4440 एक लक्ष्य जीन इसी टुकड़ा युक्त सदिश के साथ (पौंड) Luria Bertani अगर प्लेट (17 छ अगर, 10 ग्राम tryptone, 5 ग्राम पर, बदल पृथक खमीर निकालने, और प्रति लीटर 10 छ NaCl) (50 μg / मिलीलीटर) एम्पीसिलीन और tetracyclin (15 μg / मिलीलीटर) युक्त.

जीवाणुओं की एक कॉलोनी उठाओ और 50 μg / मिलीलीटर एम्पीसिलीन के साथ लेग में टीका लगाना, और 37 में झटकों के साथ 6 आठ घंटे के लिए हो डिग्री सेल्सियस; बीज तैयार एन जी एम प्लेटों पर इस संस्कृति की एक बूंद और प्लेटों से पहले जा रहा है रात भर incubating अच्छी तरह से सूखे ( 12 24 कमरे के तापमान पर) घंटे बैक्टीरिया बढ़ने की अनुमति देना और प्रेरण शुरू. ऊष्मायन अंधेरे में था क्योंकि टेट्रासाइक्लिन संवेदनशील प्रकाश है और यह प्लेटों के बीच आरएनएआई assays की परिवर्तनशीलता को प्रभावित कर सकता है.

यह एक सकारात्मक और आरएनएआई खिला प्रयोगों के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण का उपयोग करना आवश्यक है. सकारात्मक नियंत्रण L4440 unc-22 जीन अनुक्रम युक्त वेक्टर के साथ ई. कोलाई HT115 तब्दील सेल है . पछाड़ना unc-22 जीन की एक "हिल phenotype" पैदा करता है. नकारात्मक नियंत्रण खाली L4440 सदिश के साथ ई. कोलाई HT115 तब्दील सेल है.
इल्ली से निपटने और स्कोरिंग: पहले दिन, जगह एक एन जी एम बैक्टीरिया और सेते बिना OP50 एन जी एम प्लेटों पर साथ 20 वरीयता प्राप्त थाली से L4 मंच कीड़े ° सी (उपवास) के 12 घंटे के लिए.

अगले दिन, एक विशिष्ट लक्ष्य जीन आरएनएआई व्यक्त बैक्टीरिया के साथ seedded की थाली पर युवा उपवास वयस्क hermaphrodites हस्तांतरण. छोड़ दो 20 में 40-48 घंटे ° सी F1 संतान उत्पन्न करने के लिए.

फिर एक और एक ही बैक्टीरिया के साथ वरीयता प्राप्त प्लेट पर कुछ F1 वयस्क कीड़े जगह है. 24-48 घंटे के बाद का चयन करें, और F2 संतान, युवा वयस्कों (कुछ अंडे के साथ पूरी तरह का गठन उभड़नेवाला योनी) और phenotypes लिए स्कोर से अलग हैं.

नोट: न्यूरॉन्स में प्रेरण आरएनएआई आरएनएआई सी एलिगेंस तंत्रिका तंत्र के दुर्दम्य गुण की वजह से कुछ सीमाएं हैं. न्यूरॉन में इस अक्षमता की समस्याओं को दूर करने के लिए यह तनाव ^RRF-3, 10 न्यूरॉन्स में एक आरएनएआई के प्रभाव के लिए अत्यंत अनुभुत पृष्ठभूमि का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है. हमारे प्रयोगों में कोई differencतों ब्रिस्टल N2 और RRF - तीन उपभेदों के बीच जीनों के लिए पाया गया और phenotype विश्लेषण .

3: खींच इस्तेमाल किया.

सी. इस काम में इस्तेमाल किया एलिगेंस उपभेदों तालिका 1 में दिखाया गया हैं . उत्परिवर्ती उपभेदों बाहर पार कर N2 के खिलाफ जंगली गया - कम से कम चार बार अवांछित यादृच्छिक म्यूटेशनों कि mutagenesis के प्रोटोकॉल के दौरान उत्पन्न किया गया हो सकता है निकालने के प्रकार.

OP50 ई कोलाई तनाव प्लाज्मिड nrx-1 ले जाने pL4440 (जावेद: C29A12.5) के साथ Caenorhabditis जेनेटिक केंद्र, मिनेसोटा विश्वविद्यालय, संयुक्त राज्य अमेरिका HT115 ई. कोलाई (DE3) द्वारा suppliied था और nlg 1 (जावेद: C40C9.5 ) जीन टुकड़े डॉ. पीटर Askjaer, Centro Andaluz डे Biología डेल Desarrollo CABD (), CSIC Universidad पाब्लो Olavide, सेविला, स्पेन द्वारा प्रदान किया गया.

4: प्रतिनिधि परिणाम.

निदर्शी परिणाम आंकड़े 1 और 2 में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. प्रत्येक तनाव के दस पशुओं और कम से कम तीन प्रतिकृति प्रयोगों की एक बाहर किए गए.

चित्रा 1. आसमाटिक परिहार व्यवहार के प्रयोगों.
नियंत्रण उपभेदों और nrx-1 (ok1649 और tm1961) वी कमी mutantworms पीछे पीछे, जब वे एक आसमाटिक बाधा (4M fructose) मुठभेड़ करके जवाब. Nlg-1 (ok259 और tm474) एक्स म्यूटेंट इस बाधा का पता लगाने में विफल है. VX और CRR23 (tm1961; ok259); डबल nlg-1 और nrx-1, CRR21 (ok259 ok1649) उपभेदों में कमी म्यूटेंट VX जंगली प्रकार phenotype बरामद किया . * टी छात्र परीक्षा से महत्वपूर्ण मतभेद, (पी 0.001 ≤) ब्रिस्टल जंगली प्रकार N2 के लिए प्रत्येक तनाव के जवाब में टी छात्र परीक्षा द्वारा इंगित करता है

चित्रा 2. आरएनएआई खिला द्वारा पछाड़ना कीड़े के साथ प्रयोग.
HT115 ई. कोलाई (DE3) खाली pL4440 सदिश के साथ बदल या एक nrx 1 या nlg-1 खिलाया अलग कीड़ा उपभेदों के लिए इस्तेमाल किया गया लक्ष्य जीन को इसी टुकड़ा युक्त . * टी छात्र परीक्षा से महत्वपूर्ण (पी 0.001 ≤) N2 एक nlg एक जीन लक्ष्यीकरण टुकड़ा के साथ N2 खाली pL4440 सदिश के साथ खिलाया तनाव के साथ तुलना में pL4440 वेक्टर ले जाने जीवाणुओं के साथ खिलाया तनाव की प्रतिक्रिया में मतभेद का संकेत .

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Discussion

Neurexins और neuroligins synaptic ¹¹ पारेषण और synaptic ¹² कनेक्शन के भेदभाव में आवश्यक भूमिका प्रदर्शन करते हैं. दोनों अणुओं ^13,14 autism के लिए उम्मीदवार जीनों के रूप में पहचान की गई है.

इस वीडियो में हम एक सरल पद्धति है जो हमें सी. में आसमाटिक परिहार प्रतिक्रिया को प्रभावित जीन के प्रभाव का अध्ययन करने की अनुमति देता है शो एलिगेंस. Neuroligin कमी म्यूटेंट आसमाटिक ताकत का पता लगाने में खराब कर रहे हैं, लेकिन neurexin में कमी म्यूटेंट एक जंगली प्रकार तनाव के लिए इसी तरह की प्रतिक्रिया दिखाने के लिए, एक 4M fructose समाधान से बचने. लेकिन जब neuroligin म्यूटेंट, जो fructose समाधान का पता लगाने में असमर्थ हैं भी neurexin जीन में कमी कर रहे हैं, वे जंगली प्रकार आसमाटिक ताकत को जवाब phenotype ठीक हो.

इस अवलोकन एक आरएनएआई खिला पछाड़ना दृष्टिकोण का उपयोग कर पुष्टि की गई. इस प्रकार, जंगली प्रकार तनाव जब यह nlg-1 जीन की एक कोडन अनुक्रम व्यक्त बैक्टीरिया से तंग आ गया था आसमाटिक बाधा पहचानने में बिगड़ा था. लेकिन nlg-1 म्यूटेंट, जो आसमाटिक बाधा का पता लगाने में विफल इस क्षमता बरामद जब वे बैक्टीरिया nrx-1 के एक कोडन अनुक्रम व्यक्त के साथ खिलाया गया. इन परिणामों से संकेत मिलता है कि neuroligin और neurexin निमेटोड संवेदी न्यूरॉन्स के synapses पर शामिल हो सकता है और वे एक तरीका है कि synaptic समारोह को प्रभावित करता है में प्रत्येक दूसरे के साथ बातचीत है कि.

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Acknowledgments

हम अपने मूल्यवान मदद के लिए धन्यवाद करने के लिए डॉ. एंटोनियो मिरांडा - Vizuete करना चाहते हैं. हम भी मूल्यवान तकनीकी सहायता के लिए सलमा Boulayoune और इसाबेल Caballero के लिए हमारे आभार व्यक्त पसंद है. इस काम के जून्टा डे Andalucia (जैव-272) से एक अनुदान द्वारा वित्त पोषण किया गया था. इस शोध वर्तमान यूरोप में आनुवंशिक प्रयोग से संबंधित कानूनों के साथ समझौते में बाहर किया गया है.

Materials

Table 1. C. elegans strains.

Strain	Gene	Allele	Source
Bristol N2	-	-	aCGC
VC228	nlg-1	ok259	CGC
FX00474	nlg-1	tm474	bNBP-JAPAN
VC1416	nrx-1	ok1649	CGC
FX1961	nrx-1	tm1961	NBP-JAPAN
NL2099	rrf-3	pk1436	CGC
CRR21	nrx-1; nlg-1	ok1649; ok259	This work
CRR22	nrx-1; nlg-1	tm1961;ok259	This work

a. Caenorhabditis Genetic Center, University of Minnesota, USA.

b. National Bioresource Project for the Experimental Animal "Nematode C. elegans". Tokyo Women’s Medical University, Japan.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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