Evitare osmotica Caenorhabditis elegans: Funzione sinaptica di due geni, ortologhi di Human NRXN1 E NLGN1, Come candidati per l'autismo

Summary

Neurexins e neuroligins sono membrane dei neuroni proteine ​​di adesione che svolgono ruoli essenziali nella differenziazione e la trasmissione sinaptica. Neuroligin mutanti carenti di

Abstract

Neurexins e neuroligins sono molecole di adesione delle cellule presenti nelle sinapsi eccitatorie e inibitorie, e sono tenuti per un corretto funzionamento della rete neuronale ^1. Queste proteine ​​si trovano al membrane presinaptico e postsinaptico ^2. Studi condotti su topi indicano che neurexins e neurologins hanno un ruolo essenziale nella trasmissione sinaptica ^1. Recenti studi hanno dimostrato che le connessioni neuronali alterate nel corso dello sviluppo del sistema nervoso umano potrebbe costituire la base della eziologia di numerosi casi di disturbi dello spettro autistico ^3.

Caenorhabditis elegans potrebbe essere utilizzato come uno strumento sperimentale per facilitare lo studio del funzionamento dei componenti sinaptica, per la sua semplicità per la sperimentazione di laboratorio, e dato che il suo sistema nervoso e il cablaggio sinaptica è stato pienamente caratterizzato. In C. Elegans NRX-1 e NLG-1 geni ortologhi di uomo e NRXN1 NLGN1 geni che codificano neurexin-alfa-1-1 e neuroligin proteine, rispettivamente. Negli esseri umani e nematodi, l'organizzazione di neurexins e neuroligins è simile rispetto a domini funzionali.

Il capo del nematode contiene il amphid, un organo sensoriale del nematode, che media le risposte a stimoli diversi, tra cui la forza osmotica. Il amphid è composto da 12 neuroni bipolari con dendriti sensoriali ciliate e un assone terminale presinaptico ^4. Due di questi neuroni, chiamato ASHR e ASHL sono particolarmente importanti in osmotica funzione sensoriale, rilevando idrosolubili repellenti con elevata resistenza osmotica ^5. I dendriti di queste due neuroni allungare fino alla punta della bocca e gli assoni estendere all'anello nervose, dove effettuare i collegamenti sinaptici con altri neuroni determinare la risposta comportamentale ^6.

Per valutare le implicazioni di neurexin e neuroligin in alto evitamento forza osmotica, ci mostrano la diversa risposta di C. elegans mutanti difettosi in NRX-1 e NLG-1 geni, usando un metodo basato su un anello di fruttosio 4M ^7. I fenotipi comportamentali sono stati confermati utilizzando specifici cloni RNAi ^8. In C. elegans, il dsRNA necessaria per attivare RNAi può essere somministrato per alimentazione ^9. La consegna dei dsRNA attraverso il cibo induce l'interferenza di RNAi del gene di interesse permettendo così l'identificazione di componenti genetiche e percorsi di rete.

Protocol

1: test di evitamento osmotica.

1. Circa 16-24 ore prima del test, raccogliere L4 animali stadio larvale di ciascun genotipo per un piatto fresco NGM contenente OP50 E. coli che andincubate a 20 ° C. Il giorno dopo inizia l'esperimento con i giovani adulti.
2. Si consiglia di effettuare il test "alla cieca". Le piastre con ogni sforzo per essere analizzati devono essere rietichettate da uno sperimentatore secondo, eseguendo il test con le piastre rietichettati che sarebbe stato smascherato quando l'esperimento è terminato.
3. Il giorno del test, preparare una soluzione 4M stock di fruttosio con 1% di soluzione di Rosso Congo e sciogliere completamente a temperatura ambiente. Si consiglia di verificare la soluzione prima di ogni test in quanto il colorante potrebbe precipitare con il tempo.
4. Anello anulare (1 cm di diametro) sulla piastra NGM è delineata al centro del terreno solido, con 15 microlitri della soluzione rosso fruttosio 4M. Lasciate che la soluzione di fruttosio penetrare nel agar, questo avviene di solito tra i 2 ei 5 minuti.
5. Luogo singoli animali adulti giovani di ogni ceppo all'interno della circonvallazione e seguire nei prossimi 10 minuti per determinare la risposta alla barriera osmotica. Animali evitando l'anello più di sei volte di fila sono classificati come normali, quelli in uscita l'anello in meno di sei tentativi sono considerati difettosi nella sensibilità osmotica.
   Nota: il ceppo di controllo deve essere utilizzato in ogni test. Animali adulti N2 giovani vengono utilizzati come controlli positivi in ​​quanto decisamente evitare la barriera anello. Gli animali che sono stati precedentemente fame, passato attraverso Dauer larve o sono provenienti da piatti che sono troppo secche non deve essere utilizzato. All'inizio, animali di controllo devono essere valutati in duplice copia, a confermare che le piastre di analisi e la soluzione siano corretti.

2: Generazione di vermi knockdown alimentando RNAi.

1. RNAi piastre: piastre NGM alimentazione RNAi contiene per litro: 17 g di agar, 2,5 g di peptone, 3,0 g NaCl, 1 ml di 5 mg di colesterolo ml ^-1; riempire il pallone a 1 litro con H ₂ O e autoclave. Dopo agar si raffredda fino a circa 65 ° C, aggiungere 25 ml di 1 M KPO _4, pH 6.0, 1 ml di 1 M CaCl _2, 1 ml di 1M MgSO _4, carbenicillina 0,5 ml (50 mg ml ^-1) e 1 ml 1M IPTG. Se siete pronti a partire con NGM solide, si fondono terreno solido da microonde e successivamente posto NGM liquido in panchina per raffreddare e poi aggiungere KPO _4, pH 6.0, CaCl _2, MgSO _4, carbenicillina e IPTG come indicato in precedenza.
   
   Aggiungere 10 ml di NGM in ogni piatto 60 millimetri Petri. Lasciare raffreddare e capovolgere le piastre mantenimento delle stesse in una notte prima dell'uso RT. Le piastre possono essere conservate in un sacchetto di plastica a 4 ° C per circa 4-5 giorni.
2. Preparazione batterica e induzione: Isolare le colonie di E.coli HT115 (DE3) ceppo, trasformato con L4440 vettore contenente un frammento corrispondente al gene bersaglio, su Luria-Bertani (LB) piastre di agar (17 agar g, 10 g di triptone, 5 g estratto di lievito e 10 g di NaCl per litro) contenente ampicillina (50 mg / ml) e tetraciclina (15 mg / ml).
   
   Scegli una colonia di batteri e inoculare in LB con 50 mg / ml ampicillina, e destinata alla produzione di 6 8 ore con agitazione a 37 ° C; seme una goccia di questa cultura sulle piastre NGM preparato e asciugare i piatti accuratamente prima di essere incubazione overnight ( 12 24 h) a temperatura ambiente per permettere ai batteri di crescere e di iniziare a induzione. L'incubazione era al buio perché tetracicline è sensibile alla luce e può influenzare la variabilità dei saggi RNAi tra i piatti.
   
   E 'necessario utilizzare un positivo e un controllo negativo per esperimenti di alimentazione RNAi. Il controllo positivo è E.coli HT115 cellule trasformate con il vettore L4440 contenente la sequenza del gene unc-22. L'atterramento di unc-22 gene produce un "fenotipo spasmi". Il controllo negativo è E.coli HT115 cellule trasformate con vuoto vettore L4440.
3. Gestione verme e punteggio: Il primo giorno, luogo L4 vermi palco da una piastra NGM seminato con OP50 su piastre NGM senza batteri e incubare a 20 ° C per 12 ore (a digiuno).
   
   Il giorno dopo, il trasferimento di giovani adulti ermafroditi digiuno su un piatto seedded con i batteri che esprimono il gene bersaglio specifico RNAi. Lascia 40-48 ore a 20 ° C per generare progenie F1.
   
   Poi inserire un paio di vermi adulti F1 su un altro piatto seminato con i batteri stessi. Dopo 24-48 ore, selezionare e isolare dalla progenie F2, i giovani adulti (completamente formato vulva sporgente con le uova pochi) e punteggio per fenotipi.
   
   Nota: l'induzione RNAi nei neuroni hanno alcune limitazioni a causa delle proprietà refrattario del sistema nervoso C. elegans a RNAi.. Per superare i problemi di questa inefficienza nel neurone si raccomanda di utilizzare il rif-3 ceppo, uno sfondo ipersensibili agli effetti di RNAi nei neuroni ^10. Nei nostri esperimenti non differences sono stati trovati tra Bristol N2 e rif-3 ceppi per i geni e il fenotipo analizzati.

3: I ceppi utilizzati.

Il C. elegans ceppi utilizzati in questo lavoro sono riportati nella tabella 1. Ceppi mutanti erano fuori incrociata contro N2 selvaggio - Tipo di almeno quattro volte per rimuovere i mutazioni casuali che avrebbero potuto essere generati durante il protocollo di mutagenesi.

. OP50 E coli ceppo è stato suppliied da Caenorhabditis Genetic Center, University of Minnesota, USA E.coli HT115 (DE3) con il plasmide pL4440 portando NRX-1 (JA: C29A12.5). NLG e-1 (JA: C40C9.5 frammenti di geni) sono stati forniti dal Dott. Peter Askjaer, Centro Andaluz de Biologia del Desarrollo (Abd), CSIC Universidad Pablo Olavide, Siviglia, Spagna.

4: I risultati rappresentativi.

Risultati illustrativo sono rappresentati nelle figure 1 e 2. Dieci animali di ogni ceppo e un minimo di tre esperimenti replica sono state effettuate.

Figura 1. Esperimenti di comportamento di evitamento osmotica.
Ceppi di controllo e NRX-1 (ok1649 e tm1961) mutantworms V carenti rispondere invertendo indietro quando incontrano una barriera osmotica (4M fruttosio). NLG-1 (ok259 e tm474) X mutanti non riescono a rilevare questa barriera. Doppi mutanti carenti di NLG-1 e NRX-1, ceppi CRR21 (ok1649; ok259) VX e CRR23 (tm1961; ok259) VX recuperato il fenotipo wild type. Il simbolo * indica differenze significative (p ≤ 0,001) da t-student test, nella risposta di ogni sforzo per la N2 Bristol wild-type da t-studente di prova

Figura 2. Gli esperimenti con i vermi knockdown alimentando RNAi.
E.coli HT115 (DE3) trasformato con vuoti vettore pL4440 o contenente un frammento corrispondente ai geni bersaglio NRX-1 o NLG-1 sono stati utilizzati per ceppi di vite senza fine alimentato diverse. Il simbolo * indica differenze significative (p ≤ 0,001) da t-student test, nella risposta del ceppo N2 alimentato con i batteri portando la pL4440 vettore con un frammento intese a promuovere l'NLG-1 gene in confronto con il ceppo N2 alimentato con vuoto pL4440 vettore .

Discussion

Neurexins e neuroligins svolgono ruoli fondamentali nella trasmissione sinaptica ¹¹ e la differenziazione delle connessioni sinaptiche ^12. Entrambe le molecole sono stati identificati come geni candidati per l'autismo ^13,14.

In questo video vi mostriamo un metodo semplice che ci permette di studiare l'effetto di geni che influenzano la risposta osmotica evitare in C. elegans. Neuroligin mutanti carenti sono difettosi nel rilevare la forza osmotica, ma mutanti carenti in neurexin mostrano una risposta simile al ceppo wild-type, evitando una soluzione 4M fruttosio. Tuttavia quando neuroligin mutanti, che non sono in grado di individuare la soluzione di fruttosio, sono carenti nel gene neurexin, si riprendono il fenotipo wild type rispondere alla forza osmotica.

Questa osservazione è stata confermata con un approccio di alimentazione RNAi knockdown. Così, il ceppo di tipo selvatico è stata compromessa nel riconoscere la barriera osmotica quando è stato alimentato con i batteri che esprimono una sequenza codificante del gene NLG-1. Ma NLG-1 mutanti, che non riescono a rilevare la barriera osmotica, recuperato questa capacità quando sono stati alimentati con batteri che esprimono una sequenza codificante del NRX-1. Questi risultati indicano che neurexin e neuroligin potrebbero essere coinvolti al nematode sinapsi dei neuroni sensoriali e che interagiscono tra loro in un modo che influenza la funzione sinaptica.

Materials

Table 1. C. elegans strains. Strain Gene Allele Source Bristol N2 - - aCGC VC228 nlg-1 ok259 CGC FX00474 nlg-1 tm474 bNBP-JAPAN VC1416 nrx-1 ok1649 CGC FX1961 nrx-1 tm1961 NBP-JAPAN NL2099 rrf-3 pk1436 CGC CRR21 nrx-1; nlg-1 ok1649; ok259 This work CRR22 nrx-1; nlg-1 tm1961;ok259 This work a. Caenorhabditis Genetic Center, University of Minnesota, USA. b. National Bioresource Project for the Experimental Animal "Nematode C. elegans". Tokyo Women’s Medical University, Japan.