Summary
Neurexins 및 neuroligins는 시냅스 차별화 및 전송에 필수적인 역할을 수행하는 막 - 신경 세포의 접착 단백질입니다. 의 Neuroligin 부족한 돌연변이
Abstract
Neurexins 및 neuroligins은 세포 접착 분자는 흥분성의 억제와 시냅스에 존재하고, 그들이 올바른 신경망 기능 1 필수입니다. 이러한 단백질은 presynaptic 및 postsynaptic 세포막 2 볼 수 있습니다. 생쥐의 연구 neurexins과 neurologins가 시냅스 전달 1 필수 역할을 나타냅니다. 최근 보고서는 인간의 신경 시스템의 개발 기간 동안 변경의 연결을 연결 자폐증 스펙트럼 장애 3 가지 경우 많은 병인의 기초를 구성 수있는 것으로 나타났습니다.
Caenorhabditis의 엘레간스 때문에 실험실 실험에 대한 단순, 시냅스 구성 요소의 기능 연구를 촉진하기위한 실험 도구로 사용하며, 신경 시스템과 신경 배선이 완전히 특징되었음을 주어진 수 있습니다. C에서. 엘레간스 nrx - 1 nlg - 1 유전자는 각각 알파 - neurexin - 1 neuroligin - 1 단백질, 인코딩 인간 NRXN1 및 NLGN1 유전자에 orthologous 있습니다. 인간과 nematodes에서 neurexins 및 neuroligins의 조직 기능 도메인에 대한 존중과 유사합니다.
선충류의 머리 amphid, 삼투 강도를 포함한 다양한 자극에 반응을 mediates 선충류의 감각 기관이 포함되어 있습니다. amphid은 솜털이있는 dendrites 한 presynaptic 터미널 축삭 4 12 감각 뉴런의 바이폴라 이루어집니다. ASHR 및 ASHL라는 이러한 뉴런의 두 높은 삼투 강도 5 수용성 repellents를 감지, 삼투 감각 기능에 특히 중요합니다. 이 두 뉴런의 dendrites는 입 끝에으로 길이 그들이 행동 반응 6 결정 다른 뉴런과 시냅스 연결을 어디에 axons은 신경 링을 확장할 수 있습니다.
높은 삼투 강도 회피에 neurexin 및 neuroligin의 의미를 평가하기 위해, 우리는 4M Fructose와 반지 7 기반 방법을 사용, nrx - 1 nlg - 1 유전자에 결함이 C. 엘레간스 돌연변이의 다른 응답을 보여줍니다. 행동 phenotypes는 특정 RNAi의 클론 8을 사용하여 확인되었다. C로 엘레간스는 RNAi를 실행하는 데 필요한 dsRNA는 9 먹이에서 관리하실 수 있습니다. 음식을 통해 dsRNA의 납품 따라서 유전자 구성 요소와 네트워크 경로의 신분을 허용 관심있는 유전자의 RNAi 간섭을 유도.
Protocol
1 : 삼투 회피 분석.
- 약 16~24시간 분석하기 전에, OP50 E.를 포함하는 새로운 NGM 접시 각 유전자형의 L4 애벌레 무대 동물을 선택 대장균은 20 ° C.에 그것을 andincubate 다음 날 젊은 성인과 함께 실험을 시작합니다.
- 이것은 분석 "맹목적"을 수행하는 것이 좋습니다. assayed하는 각각의 응력과 접시는 실험이 완료되면 가면 될 relabelled 접시를 사용하여 분석을 수행하는 두 번째 실험자에 의해 relabelled해야합니다.
- 분석의 일, 1 % 콩고 레드 솔루션 Fructose와의 4M 재고 솔루션을 준비하고 실온에서 완전히 디졸브. 염색 시간과 침전 수 있으므로 우리는 각 분석하기 전에 해결책을 확인하는 것이 좋습니다.
- NGM 플레이트에 대한 환상 링 (1cm 직경)은 붉은 4M의 Fructose와 솔루션을 15 μl와 고체 배지의 중앙에 설명되어 있습니다. Fructose와 솔루션 한천에 흠뻑 젖어 보자, 이것은 보통 2 5 분 사이에 걸립니다.
- 반지 내의 각 변형의 개별 젊은 성인 동물을 플레이스와 삼투 장벽에 대한 응답을 결정하기 위해 다음 10 분 이상하십시오. 연속으로 여섯 번 이상의 반지를 피하 동물은 정상으로 분류되며 미만보다 여섯 시도에 반지를 종료들은 삼투 감도에 결함이있는 것으로 간주됩니다.
참고 : 제어 변형 각 분석에 사용해야합니다. 그들이 결정적으로 반지의 장벽을 피하기로 N2 젊은 성인 동물 긍정적인 컨트롤로 사용됩니다. 이전 굶주린 Dauer 애벌레 통과하거나 너무 건조 접시에서오고있다 동물을 사용해서는 안됩니다. 처음에는, 컨트롤 동물은 분석 접시와 솔루션이 올바른지 확인하기 위해 중복으로 평가해야합니다.
2 : RNAi 먹이로 최저의 벌레의 생성.
- RNAi 번호판 : NGM RNAi의 먹이 접시는 리터 당 포함 17g의 한천은 2,5 g 펩톤, 3.0 g NaCl, 5 MG ML -1 콜레스테롤 1 ML는, H 2 O 및 압력솥과 1리터로 술병을 입력합니다. 한천은 약 65 ° C 냉각 후, 1 M KPO 4, 산도 6.0, 1 M CaCl 2, 1M MgSO 4, 0,5 ML carbenicillin (50 MG ML -1)과 1 개 중 1 개의 ML 1 ML 25 ML을 추가 ML 1M의 IPTG. 당신이 준비한 탄탄한 NGM 시작하는 경우, microwaving에 의해 고체 매체를 녹으 후 시원한로 누른 다음 다른 이름으로 이전에 표시 KPO 4, 산도 6.0, CaCl 2, MgSO 4, carbenicillin과 IPTG을 추가하기 위해 벤치에 액체 NGM를 놓으십시오.
각 60mm 페트리 접시에 NGM 10 ML을 추가합니다. 냉각을 허용하고 사용하기 전에 밤새 RT에서 그들을 유지하는 번호판을 반전. 플레이트는 약 4-5 일 동안 4 ° C에서 비닐 봉지에 저장할 수 있습니다. - 박테리아 준비와 유도 : Luria - Bertani (LB) 한천 플레이트 (17g의 한천, 10g tryptone, 5g에, 대상 유전자에 해당하는 조각을 포함하는 L4440 벡터로 변형 E.coli HT115 (DE3) 변형의 식민지를 분리 효모 추출물, 그리고 리터 당 10g NaCl) 암피실린 (50 μg / ML)과 tetracyclin (15 μg / ML)를 포함.
박테리아의 식민지 선택 50 μg / ML 암피실린와 LB에 접종하고, 37 잡고 6 8 H에 대한 성장 ° C; 준비 NGM 판에 씨앗이 문화의 한 방울과 야간 잠복기되기 전에 철저하게 접시를 건조 ( 상온 12 24 H)은 박테리아가 성장하도록하고 유도를 시작하십시오. 테트라 사이클린은 민감한 빛이며 접시 사이에 RNAi의 assays의 다양성에 영향을 미칠 수 있기 때문에 부화가 어둠 속에서되었습니다.
그것은 긍정적이고 RNAi 먹이 실험에 대한 부정적인 컨트롤을 사용하는 것이 필요합니다. 긍정적인 컨트롤은 UNC - 22 유전자 시퀀스를 포함하는 벡터로 변환 L4440 E.coli 세포 HT115입니다. UNC - 22 유전자의 분해는 "꿈틀 표현형"를 생산하고 있습니다. 대조군은 빈 L4440 벡터로 변형 E.coli 세포 HT115입니다. - 웜 처리 및 채점 : 20 박테리아와 부화하지 않고 NGM 접시에 OP50와 씨앗 NGM 플레이트에서 첫 날, 장소 L4 무대 웜 ° 12 시간 C (금식).
다음날, 특정 타겟 유전자 RNAi을 표현 박테리아와 seedded 접시에 젊은 금식 성인 나온것을 전송할 수 있습니다. 20 40~48시간를 남겨 ° C는 F1 자손을 생성합니다.
그런 다음 같은 박테리아와 씨앗을 다른 접시에 몇 F1 어른 벌레를 놓습니다. 24-48시간 후, 선택하고 F2 자손, 젊은 성인 (몇 계란과 완벽하게 형성 튀어나온 산문)과 phenotypes에 대한 점수에서 분리.
참고 :. 뉴런의 RNAi 유도 때문에 RNAi에 C 엘레간스 신경 계통의 내화물 속성 중 일부 제한이 있습니다. 신경이 비효율의 문제를 극복하기 위해 그것은 rrf - 3 변형, 뉴런 10 RNAi의 효과에 과민 배경을 사용하는 것이 좋습니다. 실험없이 differenc에서에스이 유전자에 대한 브리스톨 N2 및 rrf - 3 변종 사이의 발견과 표현형 분석을했다.
3 계통 사용됩니다.
C. 이 작품에 사용된 엘레간스의 종자는 표 1에 표시됩니다. 돌연변이 변종은 밖으로 넘어 N2에 대한 야생 했어요 - 입력 돌연변이 유발 프로토콜 중에 생성된 것일 수도 원치 않는 임의의 변이를 제거하려면 적어도 네 번.
.. OP50 E 대장균의 변종은 플라스미드 nrx - 1을 들고 pL4440 (JA : C29A12.5)로 Caenorhabditis 유전자 센터, 미네소타 대학, 미국 E.coli HT115 (DE3)에 의해 suppliied되었으며 nlg - 1 (JA : C40C9.5 ) 유전자 조각은 박사 피터 Askjaer, 센트 Andaluz 호텔 드 Biología 델 Desarrollo (CABD), CSIC 대학교 파블로 Olavide, 세비야, 스페인에 의해 제공되었다.
4 : 대표 결과.
설명의 결과는 그림 1과 2에 표시됩니다. 열 각 변형의 동물과 세 복제 실험 최소가 진행되었다.
그림 1. 삼투 회피 동작의 실험.
제어 변종과 nrx - 1 V 결함 mutantworms들이 삼투 장벽 (4M Fructose와)을 발생하는 경우 거꾸로 반대로 대응 (ok1649 및 tm1961). nlg - 1 (ok259 및 tm474) X 돌연변이 장벽을 감지하기 위해 실패합니다. VX 및 CRR23 (tm1961, ok259); nlg - 1 nrx - 1, 종자 CRR21 (ok259 ok1649)에 결함 더블 돌연변 VX는 야생 타입 표현형를 발견 했어요. *는 t - 학생 시험에 의해 브리스톨 N2 야생 형 각 변형의 반응에 T - 학생 검사로 큰 차이 (P ≤ 0.001)를 나타냅니다
그림 2. RNAi 먹이로 최저의 벌레와 실험.
E.coli HT115 (DE3)는 빈 pL4440 벡터로 변환하거나 nrx이 - 1 또는 nlg - 1 먹이를 다른 웜 변종에 사용했던 대상 유전자에 해당하는 조각을 포함하는. *이 비어 pL4440 벡터와 공급 N2 스트레인과 비교 nlg - 1 유전자를 대상으로 조각으로 pL4440 벡터를 옮기는 박테리아와 공급 N2 변형의 반응에 T - 학생 검사로 큰 차이 (P ≤ 0.001)를 나타냅니다 .
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Discussion
Neurexins 및 neuroligins는 시냅스 전송 11 시냅스 연결 12 분화에 필수적인 역할을 수행합니다. 두 분자가 자폐증 13,14에 대한 후보 유전자로 확인되었습니다.
이 비디오에서 우리는 우리가 C로 삼투 회피 반응에 영향을 미치는 유전자의 효과를 연구 수있는 간단한 방법을 보여 엘레간스. Neuroligin 결함 돌연변이 삼투 강도를 감지에 결함이되며하지만 neurexin에 결함 돌연변이 4M Fructose와 솔루션을 피하기 위해, 야생 유형 변형과 비슷한 응답을 보여줍니다. 그러나 Fructose와 솔루션을 감지할 수 없습니다 neuroligin 돌연변이, neurexin 유전자도 결함 때, 그들은 삼투 강도에 반응 야생 유형 표현형을 복구합니다.
이 관측은 RNAi의 먹이 최저 접근 방식을 사용하여 확인되었다. 따라서 야생 입력 스트레인 그것은 nlg - 1 유전자의 코딩 순서를 표현하는 박테리아와 싫증이 났을 때 삼투 장벽을 인식에 장애인되었다. 그들이 nrx - 1의 코딩 순서를 표현하는 박테리아와 공급 때 그러나 삼투 장벽을 감지하지 nlg - 1 돌연변이,이 용량을 회수. 이러한 결과는 neurexin와 neuroligin가 선충류 감각 뉴런의 시냅스에 참여하고 그들이 신경 기능에 영향을 미치는 방식으로 각각 다른 상호 작용되는 수도 있음을 나타냅니다.
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Acknowledgments
우리는 그의 가치가 도와 주셔서 감사합니다 드르 안토니오 미란다 - Vizuete 싶습니다. 우리는 또한 가치있는 기술 지원을 살마 Boulayoune와 이사벨 카발 레로 우리의 감사를 표현하는 것을 좋아합니다. 이 작품은 준타 데 안다 루시아 (BIO - 272)에서 부여로 재정되었다. 이 연구는 유럽에서 유전자 실험을 규제하는 현행 법률에 계약에서 실시되었습니다.
Materials
Table 1. C. elegans strains.
a. Caenorhabditis Genetic Center, University of Minnesota, USA. |
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