Evitar osmótica em Caenorhabditis elegans: Função Synaptic de dois genes, Orthologues dos Direitos Humanos NRXN1 E NLGN1, Como candidatos para o autismo

Summary

Neurexinas e neuroliginas são proteínas da membrana do neurônio-adesão que desempenham papéis essenciais na diferenciação e transmissão sináptica. Mutantes neuroligina deficiente de

Abstract

Neurexinas e neuroliginas são moléculas de adesão de células presentes nas sinapses excitatórios e inibitórios, e eles são necessários para o funcionamento correto da rede neurônio ^1. Estas proteínas são encontradas nas membranas pré-sinápticas e pós-sinápticos ^2. Estudos em ratos indicam que neurexinas e neurologins têm um papel essencial na transmissão sináptica ^1. Relatórios recentes têm mostrado que alterou conexões neuronais durante o desenvolvimento do sistema nervoso humano pode constituir a base da etiologia da numerosos casos de distúrbios do espectro do autismo ^3.

Caenorhabditis elegans pode ser usado como uma ferramenta experimental para facilitar o estudo do funcionamento dos componentes sináptica, devido à sua simplicidade para a experimentação de laboratório, e dado que seu sistema nervoso e fiação sináptica tem sido completamente caracterizado. Em C. Elegans NRX-1 e NLG-1 genes ortólogos são para humanos NRXN1 e NLGN1 genes que codificam a alfa-neurexin-1 e neuroligina-1 proteínas, respectivamente. Em humanos e nematóides, a organização de neurexinas e neuroliginas é semelhante no que respeita aos domínios funcionais.

O chefe do nematóide contém o amphid, um órgão sensorial do nemátodo, que medeia as respostas a diferentes estímulos, incluindo a força osmótica. O amphid é feito de 12 neurônios sensoriais bipolares com dendritos e um axônio ciliadas terminal pré-sináptico ^4. Dois desses neurônios, chamado ASHR e ASHL são particularmente importantes em função sensorial osmótica, detectando solúvel em água repelentes com força osmótica elevada ^5. Os dendritos destes dois neurônios alongar até a ponta da boca e os axônios estendem ao anel nervoso, onde fazem conexões sinápticas com outros neurônios determinar a resposta comportamental ^6.

Para avaliar as implicações da neurexin e neuroligina em evitar alta resistência osmótica, mostramos a resposta diferente de mutantes C. elegans com defeito no NRX-1 e 1-NLG genes, usando um método baseado em um anel de frutose 4M ^7. Os fenótipos comportamentais foram confirmados utilizando clones específicos RNAi ^8. Em C. elegans, o dsRNA necessário para acionar RNAi pode ser administrado através da alimentação ^9. A entrega de dsRNA através dos alimentos induz a interferência RNAi do gene de interesse permitindo assim a identificação dos componentes genéticos e caminhos de rede.

Protocol

1: ensaio de evitar osmótica.

1. Sobre 16-24 horas antes do ensaio, pick L4 animais estágio larval de cada genótipo a uma placa NGM fresco contendo OP50 E. coli andincubate-lo a 20 ° C. No dia seguinte, iniciar o experimento com adultos jovens.
2. Recomenda-se realizar o ensaio "cegamente". As placas com cada estirpe a ser ensaiadas devem ser rotulados por um experimentador segundo, da realização do ensaio utilizando as placas rotulados que seria desmascarado quando o experimento foi concluída.
3. No dia do ensaio, prepare uma solução estoque 4M de frutose com 1% de solução Vermelho Congo e dissolver completamente em temperatura ambiente. Recomendamos que verifique a solução antes de cada ensaio uma vez que o corante poderia precipitar com o tempo.
4. Anel anular (1 cm de diâmetro) na placa NGM é esboçada no centro do meio sólido, com 15 mL da solução de vermelho de 4M frutose. Deixe a solução de frutose mergulhar no agar, o que normalmente leva entre 2 e 5 minutos.
5. Lugar individual animais adultos jovens de cada linhagem dentro do anel e siga ao longo dos próximos 10 minutos para determinar a resposta à barreira osmótica. Animais evitando o anel de mais de seis vezes em uma fileira são classificados como normais, aqueles sair do ringue em menos de seis tentativas são considerados defeitos de sensibilidade osmótica.
   Nota: A tensão de controle deve ser usado em cada ensaio. Animais adultos N2 jovens são utilizados como controle positivo uma vez que decisivamente evitar a barreira do anel. Animais que tenham sido previamente fome, passou por Dauer larvas ou são provenientes de placas que são demasiado seca não deve ser usado. No início, os animais de controle devem ser avaliadas em duplicata, para confirmar que as placas de ensaio ea solução estão corretas.

2: Geração de worms knockdown alimentando RNAi.

1. RNAi placas: placas de alimentação NGM RNAi contém por litro: 17 g de ágar, 2,5 g de peptona, 3,0 g NaCl, 1 ml de 5 mg de colesterol ^-1 ml; encher o cantil de 1 litro com H ₂ O e autoclave. Depois de agar esfria a cerca de 65 ° C, adicione 25 ml de 1 M KPO _4, pH 6,0, 1 ml de CaCl ₂ 1 M, 1 ml de 1M MgSO _4, 0,5 ml carbenicilina (50 mg ml ^-1) e 1 ml IPTG 1M. Se você está começando com NGM sólido preparado, derreta meio sólido por microondas e, posteriormente, lugar NGM líquido no banco para esfriar e adicione KPO _4, pH 6,0, CaCl _2, MgSO _4, carbenicilina e IPTG como indicado anteriormente.
   
   Adicionar 10 ml de NGM em cada placa de Petri 60 mm. Permitir o resfriamento e inverter as placas mantendo-as a RT noite antes de usar. As placas podem ser armazenadas em um saco plástico a 4 ° C por cerca de 4-5 dias.
2. Preparação bacteriana e indução: Isolar colônias de E.coli HT115 (DE3), estirpe transformada com L4440 vetor contendo um fragmento correspondente ao gene-alvo, para Luria-Bertani (LB) ágar (17 g de ágar, 10 g triptona, 5 g extrato de levedura e 10 g de NaCl por litro) contendo ampicilina (50 mcg / ml) e tetraciclina (15 mcg / ml).
   
   Escolha uma colônia de bactérias e inocular em LB com 50 mg / ml ampicilina, e cresceu para 6 8 h com agitação a 37 ° C; uma gota de semente desta cultura para as placas NGM preparada e secar os pratos cuidadosamente antes de ser incubada overnight ( 12 24 h) à temperatura ambiente para permitir que as bactérias para crescer e começar a indução. A incubação foi no escuro, porque a tetraciclina é sensível à luz e pode afetar a variabilidade dos ensaios RNAi entre placas.
   
   É necessário o uso de um positivo e um controle negativo para os experimentos de alimentação RNAi. O controle positivo é E.coli célula HT115 transformada com o vetor contendo a seqüência L4440 unc-22 gene. O knockdown da unc-22 gene produz um "fenótipo espasmos". O controle negativo é E.coli HT115 célula transformada com o vetor L4440 vazio.
3. Manipulação de verme e de pontuação: O primeiro dia, coloque L4 worms palco de uma placa NGM semeados com OP50 em placas NGM sem bactérias e incubar a 20 ° C por 12 horas (em jejum).
   
   No dia seguinte, a transferência de jovens adultos hermafroditas jejum em uma placa seedded com as bactérias expressando o gene alvo específicos RNAi. Deixe 40-48 horas a 20 ° C para gerar progênie F1.
   
   Em seguida, coloque alguns vermes adultos F1 noutra placa semeada com a mesma bactéria. Após 24-48 horas, selecionar e isolar da progênie F2, adultos jovens (totalmente formado vulva protuberante com poucos ovos) e escore de fenótipos.
   
   Nota: a indução de RNAi em neurônios têm algumas limitações por causa das propriedades refratárias do sistema de C elegans nervoso para RNAi.. Para superar os problemas desta ineficiência no neurônio é recomendado o uso da cepa RRF-3, um fundo hipersensíveis aos efeitos da RNAi em neurônios ^10. Em nossos experimentos não diferenes foram encontradas entre Bristol e RRF N2-3 cepas para os genes e do fenótipo analisado.

3: As cepas utilizadas.

O C. elegans cepas utilizadas neste trabalho são apresentados na Tabela 1. Cepas mutantes estavam cruzados contra N2 selvagens - tipo, pelo menos, quatro vezes para remover indesejados mutações aleatórias que poderia ter sido gerada durante o protocolo de mutagênese.

. OP50 E coli cepa foi suppliied por Caenorhabditis Genetic Center, University of Minnesota, EUA E.coli HT115 (DE3) com o plasmídeo carregando pL4440 NRX-1 (JA: C29A12.5). Florins e-1 (JA: C40C9.5 fragmentos de genes) foram fornecidos pelo Dr. Peter Askjaer, Centro Andaluz de Biologia del Desarrollo ('Abd), Universidad Pablo Olavide CSIC, Sevilla, Espanha.

4: Os resultados representativos.

Resultados ilustrativos são representados nas Figuras 1 e 2. Dez animais de cada cepa e um mínimo de três experimentos foram realizados réplica.

Figura 1. Experimentos de comportamento de evitação osmótica.
Estirpes de controlo e NRX-1 (ok1649 e tm1961) mutantworms V deficiente responder, invertendo para trás quando se deparam com uma barreira osmótica (4M frutose). NLG-1 (ok259 e tm474) X mutantes não conseguem detectar essa barreira. Mutantes duplos deficiente em NLG-1 e NRX-1, cepas CRR21 (ok1649; ok259) VX e CRR23 (tm1961; ok259) VX recuperou o fenótipo de tipo selvagem. O * indica diferenças significativas (P ≤ 0,001) pelo teste t-student, na resposta de cada cepa para a N2 Bristol tipo selvagem por t-student

Figura 2. Experimentos com worms knockdown alimentando RNAi.
E.coli HT115 (DE3) transformadas com o vetor pL4440 vazio ou contendo um fragmento correspondente aos genes alvo NRX-1 ou NLG-1 foram utilizados para cepas de vírus alimentados com diferentes. O * indica diferenças significativas (P ≤ 0,001) pelo teste t-student, na resposta da cepa N2 alimentados com bactérias carregando o vetor pL4440 com um fragmento do gene alvo NLG-1 em comparação com a cepa N2 alimentados com vector pL4440 vazia .

Discussion

Neurexinas e neuroliginas desempenhar papéis essenciais na transmissão sináptica ¹¹ e diferenciação das conexões sinápticas ^12. Ambas as moléculas têm sido identificadas como genes candidatos para o autismo ^13,14.

Neste vídeo mostramos um método simples que nos permite estudar o efeito de genes que afetam a resposta de esquiva osmótica em C. elegans. Neuroligina mutantes deficientes são defeituosos na detecção de resistência osmótica, mas mutantes deficientes em neurexin mostram uma resposta semelhante à cepa selvagem, evitando uma solução de frutose 4M. No entanto, quando mutantes neuroligina, que são incapazes de detectar a solução de frutose, também são deficientes no gene neurexin, eles recuperar o fenótipo do tipo selvagem responder à força osmótica.

Esta observação foi confirmada usando uma abordagem RNAi knockdown alimentação. Assim, a cepa do tipo selvagem foi prejudicada em reconhecer a barreira osmótica, quando foi alimentado com bactérias expressando uma seqüência codificadora do gene NLG-1. Mas NLG-1 mutantes, que não conseguem detectar a barreira osmótica, recuperou essa capacidade quando foram alimentados com bactérias expressando uma seqüência de codificação de NRX-1. Estes resultados indicam que neurexin e neuroligina pode estar envolvido nas sinapses dos neurônios sensoriais e nematóides que eles interagem uns com os outros de uma maneira que afeta a função sináptica.

Materials

Table 1. C. elegans strains. Strain Gene Allele Source Bristol N2 - - aCGC VC228 nlg-1 ok259 CGC FX00474 nlg-1 tm474 bNBP-JAPAN VC1416 nrx-1 ok1649 CGC FX1961 nrx-1 tm1961 NBP-JAPAN NL2099 rrf-3 pk1436 CGC CRR21 nrx-1; nlg-1 ok1649; ok259 This work CRR22 nrx-1; nlg-1 tm1961;ok259 This work a. Caenorhabditis Genetic Center, University of Minnesota, USA. b. National Bioresource Project for the Experimental Animal "Nematode C. elegans". Tokyo Women’s Medical University, Japan.