Evitar osmótica en Caenorhabditis elegans: La función sináptica de dos genes, Orthologues de los Derechos Humanos NRXN1 Y NLGN1, Como candidatos para el autismo

Summary

Neurexinas y neuroliginos son las neuronas de membrana las proteínas de adhesión que realizan funciones esenciales en la diferenciación sináptica y la transmisión. Neuroligina mutantes deficientes de

Abstract

Neurexinas y neuroliginos son moléculas de adhesión celular presentes en las sinapsis excitadoras e inhibidoras, y que son necesarios para el correcto funcionamiento de la red neuronal ^1. Estas proteínas se encuentran en las membranas presináptica y postsináptica ^2. Los estudios en ratones indican que neurexinas y neurologins tienen un papel esencial en la transmisión sináptica ^1. Los informes recientes han demostrado que las alteraciones en las conexiones neuronales durante el desarrollo del sistema nervioso humano puede constituir la base de la etiología de numerosos casos de trastornos del espectro autista ^3.

Caenorhabditis elegans puede ser utilizado como una herramienta experimental para facilitar el estudio del funcionamiento de los componentes sinápticos, debido a su simplicidad para la experimentación de laboratorio, y dado que su sistema nervioso y el cableado sináptica se ha caracterizado completamente. En C. Elegans NRX-1 y florines-1 genes son ortólogos humanos de NRXN1 y NLGN1 genes que codifican la alfa-neurexin-1 y neuroligin-1 proteínas, respectivamente. En los seres humanos y los nematodos, la organización de neurexinas y neuroliginos es similar en lo que respecta a los dominios funcionales.

El jefe del nematodo contiene el amphid, un órgano sensorial de los nematodos, que media las respuestas a diferentes estímulos, incluyendo la fuerza osmótica. El amphid consta de 12 neuronas sensoriales bipolares con dendritas ciliadas y un axón terminal presináptica ^4. Dos de estas neuronas, llamada Ashr y ASHL son particularmente importantes en la función sensorial osmótica, detectar soluble en agua, repelentes con una alta resistencia osmótica ^5. Las dendritas de estas dos neuronas alargar hasta el extremo de la boca y los axones se extienden hasta el anillo nervioso, donde hacen conexiones sinápticas con otras neuronas para determinar la respuesta de comportamiento ^6.

Para evaluar las implicaciones de neurexin neuroligin y en la evitación de alta resistencia osmótica, se muestra la diferente respuesta de C. elegans mutantes defectuosos en NRX-1 y florines-1 genes, utilizando un método basado en un anillo de fructosa 4M ^7. Los fenotipos de comportamiento se confirmaron mediante clones específicos de RNAi ^8. En C. elegans, el dsRNA necesaria para activar el ARNi puede ser administrado por la alimentación de ^9. La entrega de dsRNA a través de los alimentos provoca la interferencia del RNAi el gen de interés lo que permite la identificación de los componentes genéticos y las vías de la red.

Protocol

1: ensayo de evitar osmótica.

1. Alrededor de 16-24 horas antes del ensayo, recoger animales L4 etapa larval de cada genotipo a un plato fresco que contiene NGM OP50 E. coli que andincubate a 20 ° C. Al día siguiente, comenzar el experimento con los adultos jóvenes.
2. Se recomienda llevar a cabo el ensayo "a ciegas". Las placas con cada cepa a ensayar deben ser etiquetados de nuevo por un segundo experimentador, realizar el ensayo con las placas reetiquetados que ser desenmascarada cuando el experimento ha terminado.
3. El día del ensayo, preparar una solución de 4 millones de fructosa con el Congo solución al 1% Red y disolver completamente a temperatura ambiente. Le recomendamos que visite la solución antes de cada ensayo ya que el tinte podría precipitar con el tiempo.
4. Anillo anular (1 cm de diámetro) en la placa de NGM se describe en el centro del medio sólido, con 15 l de la solución 4M fructosa rojo. Deje que la solución de fructosa penetre en el agar, esto suele tardar entre 2 y 5 minutos.
5. Lugar individual animales adultos jóvenes de cada cepa dentro de la circunvalación y seguir en los próximos 10 minutos para determinar la respuesta a la barrera osmótica. Animales para evitar el anillo de más de seis veces en una fila son clasificados como normales, los que sale el anillo en menos de seis intentos no se consideran defectos en la sensibilidad osmótica.
   Nota: La cepa de control se deben utilizar en cada ensayo. N2 animales adultos jóvenes se utilizan como controles positivos, ya que de manera decisiva evitar la barrera del ring. Los animales que han sido previamente muerto de hambre, pasó por Dauer larvas o son procedentes de las placas que son demasiado seco no se debe utilizar. Al principio, los animales de control deben ser evaluados por duplicado, para confirmar que las placas de ensayo y la solución es correcta.

2: La generación de gusanos caída por la alimentación de RNAi.

1. RNAi placas: NGM placas de alimentación RNAi contiene por litro: 17 g de agar, 2,5 g de peptona, 3,0 g de NaCl, 1 ml de 5 mg de colesterol ml ^-1; llenar el frasco de 1 litro con H ₂ O y autoclave. Después de agar se enfría a 65 ° C, 25 ml de 1 M KPO _4, pH 6,0, 1 ml de 1 M de CaCl _2, 1 ml de 1 M MgSO _4, 0,5 ml carbenicilina (50 mg ml ^-1) y 1 ml 1M IPTG. Si usted está comenzando con NGM sólidos preparados, derretir un medio sólido en el microondas y, posteriormente, el lugar NGM líquido en el banco que se enfríe y luego añadir KPO _4, pH _6,0, CaCl2, MgSO _4, carbenicilina y IPTG como se indicó anteriormente.
   
   Añadir 10 ml de NGM en cada uno de 60 mm placa de Petri. Permitir el enfriamiento e invertir las placas manteniéndolas durante una noche antes de su uso RT. Las placas pueden guardarse en una bolsa de plástico a 4 ° C durante 4-5 días.
2. Preparación de bacterias y de inducción: aislar las colonias de E. coli HT115 (DE3) cepa, transformada con L4440 vector que contiene un fragmento correspondiente al gen diana, en Luria-Bertani (LB) placas de agar (17 g de agar, 10 g de triptona, 5 g extracto de levadura y 10 g de NaCl por litro) que contiene la ampicilina (50 mg / ml) y tetraciclina (15 mg / ml).
   
   Elija una colonia de bacterias y se inoculan en LB con 50 mg / ml de ampicilina, y se cultivan durante 6 8 h con agitación a 37 ° C, una caída de la semilla de esta cultura en los platos preparados NGM y secar los platos de fondo antes de incubar durante la noche ( 12 24 h) a temperatura ambiente para permitir que las bacterias para crecer y para comenzar la inducción. La incubación se encontraba en la oscuridad debido a la tetraciclina es sensible a la luz y puede afectar a la variabilidad de los ensayos de RNAi entre las placas.
   
   Es necesario el uso de un positivo y un control negativo para los experimentos de alimentación de RNAi. El control positivo es E.coli HT115 células transformadas con el vector L4440 que contiene la secuencia del gen unc-22. La caída de la UNC-22 gen produce una "contracción fenotipo". El control negativo es E. coli HT115 células transformadas con el vector L4440 vacío.
3. Manejo de gusano y de puntuación: El primer día, el lugar L4 gusanos etapa de una placa de NGM sembrado con OP50 en placas NGM sin bacterias e incubar a 20 ° C durante 12 horas (en ayunas).
   
   Al día siguiente, la transferencia de los jóvenes adultos hermafroditas en ayunas en un plato seedded con la bacteria que expresa el objetivo específico de genes por RNAi. Deja 40-48 horas a 20 ° C para generar plantas de la F1.
   
   A continuación, coloque unas cuantas lombrices adultas F1 sobre otra placa de siembra con la misma bacteria. Después de 24-48 horas, seleccionar y aislar a partir de la progenie F2, los adultos jóvenes (vulva completamente formadas que sobresale con pocos huevos) y la puntuación de los fenotipos.
   
   Nota: la inducción de RNAi en las neuronas tienen algunas limitaciones debido a las propiedades refractarias del sistema de C elegans nervioso RNAi.. Para superar los problemas de esta ineficiencia en las neuronas que se recomienda el uso de la cepa FRR-3, un fondo extremadamente sensibles a los efectos del ARNi en neuronas ^10. En nuestros experimentos no differences se encontraron entre Bristol N2 y cepas FRR-3 de los genes y analizaron el fenotipo.

3: Las cepas utilizadas.

El C. elegans cepas utilizadas en este trabajo se muestran en la Tabla 1. Las cepas mutantes se fuera cruzada contra N2 salvajes - tipo al menos cuatro veces para eliminar las mutaciones al azar no deseados que podrían haberse generado durante el protocolo de mutagénesis.

. OP50 E coli cepa fue suppliied por Caenorhabditis Centro Genético de la Universidad de Minnesota, EE.UU. E.coli HT115 (DE3) con el plásmido pL4440 llevar NRX-1 (JA: C29A12.5). Y florines-1 (JA: C40C9.5 fragmentos) de genes fueron proporcionados por el Dr. Peter Askjaer, Centro Andaluz de Biología del Desarrollo (CABD), CSIC Universidad Pablo Olavide, Sevilla, España.

4: Los resultados representativos.

Resultados ilustrativos están representados en las figuras 1 y 2. Diez animales de cada cepa y un mínimo de tres experimentos se llevaron a cabo réplica.

Figura 1. Los experimentos de conducta de evitación osmótica.
Las cepas de control y NRX-1 (ok1649 y tm1961) mutantworms V deficiente responder invirtiendo hacia atrás cuando se encuentran con una barrera osmótica (4 millones de fructosa). Florines-1 (ok259 y tm474) mutantes X no detectan esta barrera. Dobles mutantes deficientes en florines-1 y NRX-1, las cepas CRR21 (ok1649; ok259) y VX CRR23 (tm1961; ok259) VX recuperó el fenotipo de tipo salvaje. El * indica diferencias significativas (P ≤ 0,001) por la prueba t de Student, en la respuesta de cada cepa a la N2 Bristol de tipo salvaje por la prueba t-student

Figura 2. Los experimentos con gusanos caída por la alimentación de RNAi.
E.coli HT115 (DE3) transformada con el vector vacío o pL4440 que contiene un fragmento correspondiente a los genes diana NRX-1 o florines-1 se utiliza para alimentar el gusano cepas diferentes. El * indica diferencias significativas (P ≤ 0,001) por la prueba t de Student, en la respuesta de la cepa N2 alimentados con bacterias portadoras del vector pL4440 con un fragmento dirigidas a la florines-1 gen, en comparación con la cepa N2 alimentados con vacío pL4440 vector .

Discussion

Neurexinas neuroliginos y realizar un papel esencial en la transmisión sináptica ¹¹ y diferenciación de las conexiones sinápticas ^12. Ambas moléculas han sido identificados como genes candidatos para el autismo ^13,14.

En este video se muestra un método simple que nos permite estudiar el efecto de los genes que afectan la respuesta de evitación osmótica en C. elegans. Mutantes deficientes neuroligina son defectuosos en la detección de la fuerza osmótica, pero mutantes deficientes en neurexin muestran una respuesta similar a la cepa de tipo salvaje, evitando una solución de fructosa 4M. Sin embargo, cuando los mutantes neuroligin, que son incapaces de detectar la solución de fructosa, también son deficientes en el gen neurexin, se recupera el fenotipo de tipo salvaje en respuesta a la fuerza osmótica.

Esta observación se confirmó mediante una alimentación RNAi enfoque caída. Por lo tanto, la cepa de tipo salvaje se vio afectada en el reconocimiento de la barrera osmótica cuando fue alimentado con bacterias que expresan una secuencia codificante del gen florines-1. Pero florines-1 mutantes, que no detecte la barrera osmótica, se recuperó esta capacidad cuando fueron alimentados con bacterias que expresan una secuencia codificante de NRX-1. Estos resultados indican que neurexin y neuroligin podrían estar implicados en la sinapsis de las neuronas sensoriales y nematodos que interactúan entre sí de una manera que afecta a la función sináptica.

Materials

Table 1. C. elegans strains. Strain Gene Allele Source Bristol N2 - - aCGC VC228 nlg-1 ok259 CGC FX00474 nlg-1 tm474 bNBP-JAPAN VC1416 nrx-1 ok1649 CGC FX1961 nrx-1 tm1961 NBP-JAPAN NL2099 rrf-3 pk1436 CGC CRR21 nrx-1; nlg-1 ok1649; ok259 This work CRR22 nrx-1; nlg-1 tm1961;ok259 This work a. Caenorhabditis Genetic Center, University of Minnesota, USA. b. National Bioresource Project for the Experimental Animal "Nematode C. elegans". Tokyo Women’s Medical University, Japan.