Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Kuiken Ex ovo Cultuur en Ex ovo CAM test: Hoe het echt werkt

doi: 10.3791/1620 Published: November 30, 2009

Summary

Het kuiken chorion-membraan (CAM) is een uniek, natuurlijk immunodeficiënte ondersteunende cultuur omgeving om angiogenese en tumorigenese studie. Deze video artikel demonstreert de verschillende stappen in het kuiken

Abstract

Kip eieren in de vroege fase van de kweek zijn tussen de in vitro en in vivo systemen en zorgen voor een vasculaire testomgeving niet alleen om angiogenese studeren, maar ook voor het ontstaan ​​van tumoren te bestuderen. Na de chick chorion-membraan (CAM) heeft ontwikkeld, kan het bloedvat netwerk gemakkelijk toegankelijk is, gemanipuleerd en waargenomen en daardoor zorgt voor een optimale omgeving voor angiogenese assays. Aangezien het lymfatische systeem is niet volledig ontwikkeld tot in de late stadia van de incubatie, het kuiken embryo fungeert als een natuurlijk immunodeficiënte gastheer staat is tot duurzame geënt weefsels en cellen zonder de species-specifieke beperkingen. Naast het voeden van het ontwikkelen van allo-en xenotransplantaten, de CAM bloedvat-netwerk biedt een unieke gunstig klimaat voor tumorcel intravasation, verspreiding, en vasculaire arresteren en een repository waar gearresteerd cellen extravasaat aan micro metastatische foci te vormen.

Voor experimentele doeleinden, in de meeste recente studies van de CAM werd blootgelegd door het snijden van een raam door de eischaal en de experimenten werden uitgevoerd in ovo, wat resulteert in aanzienlijke beperkingen in de toegankelijkheid van de CAM en de mogelijkheden voor observatie en documentatie van foto-effecten. Als shell-less culturen van het kippenembryo werd 1-4 gebruikt, geen experimentele details werden verstrekt en, indien gepubliceerd op alle, de overlevingskansen van deze culturen waren laag. We verfijnde de methode van ex-ovo cultuur van kippenembryo's aanzienlijk door de invoering van een rationeel gecontroleerde extrusie van de ei-inhoud. Deze ex ovo culturen verbeteren van de toegankelijkheid van de CAM en kippenembryo, zodat ze makkelijk in vivo documentatie van effecten en het vergemakkelijken van experimentele manipulatie van het embryo. Hierdoor kan de succesvolle toepassing van een groot aantal wetenschappelijke vragen: (1) Als een verbeterde angiogenese test 5,6, (2) een experimentele set-up voor vereenvoudigde injecties in het glasvocht van het kippenembryo oog 7-9, (3) als een testomgeving voor de verspreiding en intravasation van tumorcellen van gevestigde cellijnen geënt op de CAM 10-12, (4) verspreid als een verbeterd systeem voor het ondersteunen van een succesvolle transplantatie en de cultuur van de ledematen van kippen en muizen 13 als (5 ) voor transplantatie, vermeerdering, en re-enten van vaste primaire tumor weefsel verkregen van biopsies op het oppervlak van de CAM 14.

In deze video artikel beschrijven we de oprichting van een verfijnde chick ex ovo cultuur-en CAM-test met overleving meer dan 50%. Daarnaast bieden wij een stap voor stap demonstratie van de succesvolle toepassing van de ex ovo cultuur voor een groot aantal wetenschappelijke toepassingen.


Daniel S. Dohle, Susanne D. Pasa, en Sebastian Gustmann droegen ook voor deze studie.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle apparatuur en reagentia moeten worden aangeschaft steriel of moet worden warmte of stoom gesteriliseerd of gesteriliseerd met 70% EtOH.

De auteurs stellen dat experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de Europese Gemeenschappen richtlijn (86/609/EEG), volgens de richtlijnen van de NIH ten aanzien van de zorg en het gebruik van dieren voor experimentele procedures en de regels uiteengezet door de Institutional Animal set zorg en gebruik Comite (IACUC) aan de Universiteit van Duisburg-Essen (Duitsland).

Deel 1: Incubatie van eieren

  1. Bevruchte eieren kunnen worden bewaard bij 13 ° C gedurende maximaal een week.
  2. Eieren worden uitgebroed gedurende 72 uur, liggen horizontaal in een incubator met een bewegend lade, het draaien van de eieren 12 keer per dag continu. Vochtigheid wordt gehouden op 60 - 62%, incubatie temperatuur op 37,5 ° C.
    Let op: Voordat u begint met incubatie, vuil, veren en uitwerpselen zorgvuldig verwijderd uit de eierschalen mechanisch door droog te vegen met gemeenschappelijke, grijze zigzag papieren handdoeken, die een ruw in plaats van een zacht oppervlak structuur hebben. Veegde de eieren met ethanol of ontsmettingsmiddel, echter aanzienlijk verminderd overleving van de embryo's, ongeacht de gebruikte vloeistof.

Deel 2: Ex ovo cultuur

  1. Na incubatie gedurende 72 uur, worden de eieren uit de broedmachine.
    Opmerking: De eieren worden uitgebroed gedurende 72 uur, omdat - volgens onze experimenten - om onbekende redenen, maar in overeenstemming met Auerbach et al.1 vroegere ontwikkelingsstadia hadden significant lagere overleving. In etappes later dan 72 uur de dooierzak die nog niet wordt gedekt door de CAM wordt dunner en heeft de neiging zich te houden aan de eierschaal toonaangevende (i) om kleine bloedingen op het gebied van hechting en (ii) de breuk van de dooier-zak membraan. Daarom is de gepresenteerde methode is niet van toepassing op embryo's die ouder zijn dan 72 uur.
  2. De bovenkant van de eieren, waar het embryo zich bevindt, wordt gekenmerkt door potlood, omdat het embryo weerstaat rotatie tot op zekere hoogte.
  3. Het ei wordt horizontaal met het potlood teken aan de bovenkant en gebarsten aan de rand van een 80 mm driehoekige magnetische roerstaaf leggen gericht loodrecht op de lengteas van het ei.
    Opmerking: Voor een beter gevoel, geen handschoenen worden gebruikt, maar de handen moeten ontsmet wordt met 70% EtOH worden. Het is belangrijk dat de eierschaal en het ei membraan worden opengesteld. Het lekken van eiwit is een veilig teken dat het ei membraan is geperforeerd is.
  4. Het ei ligt dicht bij de bodem van de petrischaal gehouden om verdere lekkage van eiwit te voorkomen.
    Opmerking: Tijdens de eerste opening procedure is het belangrijk dat het eiwit op de bodem van de petrischaal is nog steeds verbonden met de rest in het ei, omdat dit resulteert in een vacuüm in het ei dat de dooier houdt met het embryo op de top binnen het ei. Het vacuüm kan worden geregeld hetzij door de vinger druk, die de toevoer van lucht controles in het ei of door het optillen van het ei, die in de kolom van de aangesloten eiwit dat wil zeggen de onderdruk toeneemt.
  5. Door voorzichtig druk uit te oefenen op de meridiaan die door de spleet en de evenaar van het ei door de duim en middelvinger is het mogelijk om het vacuüm te regelen. De inhoud van het ei kan dan worden overgebracht naar de petrischaal onbeschadigd, als het ei met de dooier voorzichtig opgetild en de beide helften van de schaal zijn zorgvuldig gescheiden. Het embryo en de dooier schepen moet liggen op de top van een onbeschadigd dooier.
    Opmerking: Als het potlood merk is niet bewaard op de top, het embryo zou kunnen worden gekwetst wanneer het kraken van de shell. Als de eieren zijn niet zorgvuldig genoeg zijn gebarsten of de embryo's ouder zijn dan 72 uur (zie boven), de dooier zak kleeft aan de shell en vaak breuken. Hetzelfde gebeurt wanneer de vochtigheid van de incubator is minder dan 60% of eieren worden niet gedraaid tijdens de incubatie.
  6. Ex ovo culturen worden teruggestuurd naar een incubator en bewaard bij 37,5 ° 38,2 ° C en 60% luchtvochtigheid. CO 2 of O 2 voeding is niet nodig als de incubator is niet hermetisch gesloten (ventilatierooster gedeeltelijk open!) En speciale Petrischalen met afstandhouders tussen de deksel en schaal worden gebruikt.
    Let op: verplaatsen van de embryo's moet worden tot een minimum beperkt tijdens de eerste dagen van de incubatie. Te veel agitatie resulteert in een hoge sterftecijfers. Vanaf incubatie dag 9 vanaf, de embryo's zijn minder gevoelig voor agitatie.
    Dode embryo's moeten onmiddellijk worden verwijderd om infecties te voorkomen.
    Als celcultuur incubators worden gebruikt, die hermetisch gesloten zijn, O 2 aanbod is verplicht voor de embryo's niet om te sterven. Luchtvochtigheid is essentieel voor de CAM niet uit te drogen en als incubatie temperatuur lager is dan 37 ° C, de embryo's te traag ontwikkelen.

Deel 3: Toepassing van stoffen voor angiogenese assays

  1. Geautoclaveerd gevouwen papieren filters (50,5 mm in diameter) zijn geslagen door een perforator en gebruikt als ondersteunend materiaal (carrier) voor vloeibare stoffen toegepast op de CAM.
    Opmerking: In vrijwel elke drager (zie tabel hieronder) veroorzaakt irritatie van de CAM, vooral wanneer toegepast vóór incubatie dag 10, want het veranderd de zich ontwikkelende CAM schip architectuur. Dit is ook mogelijk inerte stoffen, zoals hydroxyethylcellulose folie inbegrepen, Teflon sponzen (PTFE-pledgets), collageen sponzen, collageen folie, steriel gaas (swabs), ronde dekglaasjes, en silicium ringen, die alle veroorzaakt vals-positieve resultaten. Filtreerpapier leek de minste irritatie en werd daarom gebruikt in onze testen.
  2. Als de CAM volledig is ontwikkeld, kan tot zes verschillende monsters worden toegepast en de effecten ervan kunnen vergeleken worden op een enkele CAM.
  3. Om uitdrogen te voorkomen filters extra doses (3 ug moedertaal angiotropin) of buffer (5 ul PBS) moeten opnieuw worden toegepast elke dag.
  4. Vanaf dag 3 na het aanbrengen, bloedvaten richten op de angiogene stoffen op de filters, terwijl het patroon van de bloedvaten rondom controles is ongewijzigd.
    Opmerking: De CAM moet niet worden verward met de dooier-zak. De CAM is een dynamisch ontwikkelen van structuur, terwijl de dooierzak is statisch met weinig afwijkingen tijdens de ontwikkeling. Op het ontwikkelen van drie dagen de ontwikkelingslanden CAM kan worden erkend voor het eerst aan het caudale einde van het embryo als een klein blaasje. Tussen dag drie en dag tien het eerste blaasje groeit, het creëren van een gevouwen twee lagen membraan begroeiing van de dooierzak in toenemende mate. De toepassing site moet halverwege tussen embryo en de vouw van de CAM (grens) omdat anders de embryo belemmert microscopische observatie van de effecten in doorvallend licht worden. Als alternatief wordt de filter met de angiogene stof geïnternaliseerd wanneer de CAM blijft groeien.

Deel 4: Enten van cellen op de CAM

4.1.Preparation van cellen

  1. Confluente cellen worden overgebracht van cultuur kolf met FALCON buizen door het gebruik van een steriele 25 ml plastic pipet met een pipet hulp.
  2. Voor een schatting van aantal cellen, is 15 pi van de celsuspensie overgebracht naar een Neubauer kamer en cellen worden handmatig geteld onder een microscoop.
  3. Falcon buizen worden gecentrifugeerd gedurende 3 minuten bij 1000 rpm bij kamertemperatuur en het supernatans verwijderd.
  4. Voor live cell tracking, worden de cellen verdund met PBS tot de gewenste concentratie (hier: 2x10 7 cellen / ml) en gekleurd met oa PKH26 (Sigma), een rode fluorescente live cell membraan labeling kit, volgens de fabrikant 'protocol.
    Cellen worden opnieuw gesuspendeerd in celkweek medium (bij voorkeur Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium; DMEM) om de gewenste concentratie voor injectie (10 7 cellen / ml) of inenting (3x10 6 cell / ml). Andere cel concentraties worden toegepast voor injecties vs inenting volgens de concentraties die reeds gepubliceerd in de literatuur 15-17 en onze ervaring.

4.2 Enten van cellen op de CAM

  1. Ringen (~ 1mm dikte) worden gesneden van een 1 ml pipet tip of een perifere veneuze katheter (PVL) buis door het gebruik van een scherpe scalpel en toegepast op de CAM van een E6-E14 chick embryo gekweekt ex ovo.
    Opmerking: Probeer niet te "zag" meerdere malen, maar om dwars door de pipet tip of katheter met een gesneden met behulp van een nieuw, zeer scherpe scalpel scherpe randen aan de resulterende ringen te voorkomen. Controleer of de ringen onder de microscoop voor de scherpe randen als gevolg van micro-scheuren.
  2. Afhankelijk van de grootte van de ringen 20 ul van 3x10 6 cellen / ml cellen gepipetteerd in totaal in een ring of als split volumes in meerdere ringen.
    Opmerking: In sommige gevallen traumatisering van de CAM door de zachte schrapen is een eerste vereiste, bijvoorbeeld om inoculatie van de cellen 17 en capillarisatie van grafts (zie hieronder) te vergemakkelijken. Indien echter, traumatisering van het CAM is niet bedoeld of contraindicative, bijvoorbeeld voor studies van de invasieve potentieel van tumorcellen, ringen mag niet worden gebruikt voor de inenting, maar cellen moeten direct worden toegepast als de toepassing van ringen of ringen zich zou kunnen leiden tot micro-laesie . Als ringen worden gebruikt, moeten deze worden gesneden zo dun mogelijk om het gewicht te minimaliseren en te vermijden inspringing van de CAM.

Deel 5: Intravitreale injectie van cellen

  1. Een Hamilton microliter spuit is gespoeld meerdere malen met 70% EtOH en tenslotte met steriele PBS.
  2. De micro-spuit is gevuld met het gekleurd of ongekleurd celsuspensie (zie deel 4.1).
    Opmerking: De injectieplaats moet zorgvuldig worden gekozen, niet om bloedvaten van de CAM of aangrenzende structuren van het embryo (brain!) verwonden door meer dan penetratie met de naald. De injectie moet geschieden onder een dissectie verrekijker.
  3. Onder de microscoop controle, Voorzichtig, maar al snel doordringen in de CAM en de ogen lagen met de naald en continu injecteren 10 tot maximaal 20 ui celsuspensie (bij voorkeur verdund in PBS) in het glasvocht van het kuiken embryo gekweekt ex ovo.
    Opmerking: Als de CAM niet kan worden gepenetreerd met de naald, het kan worden verwijderd op een plaats met weinig of geen bloedvaten door deze voorzichtig uit elkaar te scheuren met twee tang.
  4. De naald moet 1-2 seconden te blijven in het oog met een verlies van de geïnjecteerde celsuspensie door lekken te vermijden.

Deel 6: Dissectie van kip ledematen

  1. Eieren worden verwijderd uit de broedmachine na 3 tot 4 dagen van incubatie (E3/E4 = Hamburger Hamilton (HH) stage18-23)
  2. Eieren worden gekraakt op de rand van een driehoekige magnetische roerstaaf en overgebracht in een petrischaal (details: zie deel 2) en het embryo wordt ontleed vanuit de aangesloten dooier vaartuigen door het snijden van een cirkel met behulp van de lente een schaar.
  3. Het embryo is overgebracht naar een verse petrischaal gevuld met koud, steriel PBS door het gebruik van een kleine drain lepel en gewassen door vriendelijk agitatie.
  4. Het embryo is overgebracht naar een kleine petrischaal gevuld met steriele PBS en bevrijd uit de omliggende membranen, voorzichtig scheuren ze uit elkaar met fijne pincet.
  5. Ledematen worden losgemaakt door microchirurgische tang zo dicht op het lichaam mogelijk, gegrepen en overgedragen aan de CAM van een 8-10-dagen-oude host kip gekweekt ex ovo (zie transplantatie procedure).

Deel 7: Voorbereiding van de muis ledematen

  1. Tijd zwanger paringen worden opgezet en de ochtend van de dag waarop een vaginale plug wordt ontdekt bij vrouwen paring is aangewezen zwangerschap dag 0.
  2. De zwangere vrouw wordt opgeofferd door cervicale dislocatie wanneer de ontwikkeling van de embryo's bereikte embryonale dag (E) 10 tot 13 en gefixeerd op een wax boord.
  3. De buikwand wordt bevochtigd met 70% EtOH, snijd over de middellijn en de huid flappen worden lateraal bevestigd door pennen.
  4. Beide hoorns van de baarmoeder worden verwijderd uit de buik, vrijstaande en overgebracht naar een beker met koude PBS.
  5. De embryo's worden gescheiden, overgebracht naar een petrischaal en baarmoeder wand-en embryonale membranen worden zorgvuldig verwijderd door het gebruik van de tang.
  6. Ledematen worden afgesneden door het gebruik van de lente schaar of vrijstaande door fijne tang zo dicht op het lichaam mogelijk, gegrepen en overgedragen aan de CAM van de 8-10-dagen-oude host kip gekweekt ex ovo (zie transplantatie procedure).

Deel 8: Het verzamelen van tumormonsters

  1. Tumor biopten worden verzameld in 2 ml Eppendorf buizen gevuld met tumor cel-specifieke cultuur medium (hier: Leibovitz's medium) en bij kamertemperatuur bewaard.
  2. Tumor biopten worden gesneden in 1-2 mm3 stukken door steriele scalpels.
    Opmerking: Als tumor monsters werden te klein, ze niet zouden hechten aan de CAM, als ze te groot, de CAM kan worden gewonden en de embryo zou kunnen sterven.
  3. Een stuk van de kern van de biopsie monster wordt geënt op de CAM van 8-10-dagen-oude host kip gekweekt ex ovo (zie transplantatie procedure).
    Opmerking: Het nemen van materiaal van het oppervlak van de biopsie verhoogt het risico van besmetting met spier-of bindweefsel.

Deel 9: enten procedure

  1. Voor het enten van de ledematen of tumor exemplaren, de volledig ontwikkelde CAM van 8-10-dagen oude kippenembryo's gekweekte ex ovo wordt gebruikt.
  2. De grafts zijn ideaal geplaatst op de CAM in de buurt van een Y-splitsing van een bloedvat.
  3. Op de gewenste plaats van toediening, is de CAM selectief getraumatiseerd door zachte schrapen uit (tang) de bovenste peridermal deel van de dubbele epitheliale laag, waardoor de basale laag intact.
    Opmerking: Het is essentieel om het bloeden of zichtbare breuk van de haarvaten te voorkomen.
  4. De ent wordt overgebracht naar de CAM met een minimum aan PBS bevestigd. Afhankelijk van het transplantaat, is het misschien een of twee keer worden geplaatst op een site van de CAM, waar geen definitief enten is bedoeld om overmatig PBS te verwijderen en dan eindelijk geënt op de voorbereide getraumatiseerd CAM site.
  5. De ent wordt vastgepakt door fijn pincet en gelaagd op de CAM. Afhankelijk van de gevoeligheid van de ent, kan een lichte druk worden toegepast (niet geschikt voor ledematen) te manoeuvreren het transplantaat in een resulterende inspringing van de CAM (geschikt voor tumor monsters).
    Opmerking: Zoals het kuiken immuunsysteem ontwikkelt op embryonale dag (E) 18, ex ovo xenotransplantaten culturen mogen niet worden verlengd voorbij E17 als de gastheer kippenembryo's vaak sterven.
    Het is belangrijk te beschikken gastheer CAM, respectievelijk kippenembryo's gekweekt ex ovo, samenvallen met een bron van donorweefsel van uw keuze.

Deel 10: Re-enting

  1. De gastheer kuiken embryo wordt gedood door onthoofding.
  2. De CAM metde bijgevoegde transplantaat wordt verwijderd door een cirkelvormige snede met puntige schaar en overgebracht naar een petrischaal gevuld met PBS.
  3. Overmatig cam is gesneden uit het transplantaat in het voorjaar van schaar, behalve voor de voormalige bevestiging site.
  4. In het geval van grotere tumormonsters, is het transplantaat gesneden in helften of meerdere kleinere stukken en opnieuw geënt met het snijvlak naar de nieuwe CAM van de tweede gastheer.

Deel 11: representatieve resultaten

Figuur 1
Figuur 1. Shell-minder kip cultuur
Kippenembryo's van de verschillende ontwikkelingsstadia gekweekt ex ovo in petrischalen.

Figuur 2
Figuur 2. Ex ovo CAM-angiogenese-test
Bevruchte kippeneieren werden horizontaal geïncubeerd bij 37 ° C en een luchtvochtigheid van 60 - 62% en gebarsten in petrischalen op embryonale dag 4 (E4). Incubatie werd voortgezet onder dezelfde voorwaarden. Op E10 steriel filtreerpapier van (5,5 mm in diameter) zijn gelaagd op de top van de CAM en een doorweekt met 5 ul PBS of 3 ug inheemse angiotropin6. Haarvaten toonde voor de hand liggende aanpassing aan de angiotropin gedrenkt filtreerpapier op E14.

Figuur 3
Figuur 3. Ex ovo enten van ledematen
Ledematen van Chick (E3/E4) en muis (E13) waren geënt op de CAM van shell-minder kip culturen. Bloedvaten van het CAM de ledematen gesloten na twee dagen. De ontwikkeling van de ledematen voortgezet in deze ex ovo culturen het bereiken van een twee kootje fase in kuiken en de weergave van vermindering van het interdigitale banen in muriene ledematen.

Figuur 4
Figuur 4. Ex ovo inoculatie van de tumor monster
Een biopsie monster van blaascarcinoom werd geïnoculeerd op de CAM van een 10-dagen oude kuiken embryo gekweekt ex ovo. Na twee dagen in de cultuur, was de tumor monster is aangesloten op de CAM vaatstelsel en na 7 dagen, meerdere bloedvaten invoeren van het transplantaat werden waargenomen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Innovatieve of gewoon een andere chick cultuur protocol?

Met de voormalige Shell-less cultuur protocollen 1-4 De totale overleving tarieven van de kippenembryo's waren laag, bijvoorbeeld ca. 30% 1. De verfijnde ex ovo cultuur protocol zoals beschreven in dit artikel video, daarentegen, maakt het mogelijk om te overleven prijzen meer dan 50%. Vergeleken met de klassieke in-ovo culturen ex ovo cultuur van kippenembryo's vergemakkelijkt aanzienlijk de toegankelijkheid van de CAM en kippenembryo en stelt hun experimentele manipulatie en continue monitoring. Deze cultuur methode kan worden gebruikt voor een breed scala van de aanvraag, variërend van verbeterde angiogenese assays 5,6 tot gefaciliteerd injecties in het glasvocht van het kippenembryo oog 7-9, intravasation assays 10-12, verbeterde enten en de groei van ledematen 13 en innovatief onderhoud van tumormonsters 14. Zo, ex ovo cultuur draagt ​​een nuttig instrument in ontwikkelings-, angionesis en tumor onderzoek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

De auteurs willen graag J. Kueper en J. Wittschier bedanken voor de uitstekende technische bijstand en prof. dr. Ruebben voor het leveren van ruim tumor materiaal.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Fertilized Eggs Animal Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH
Mice Animal Charles River Laboratories
Incubator Type 3000 with rotating egg tray Tools Siemens AG 9503 Maintain at 37°C with relative humidity set above 60%
Egg incubator BSS 160 Tools Grumbach, Germany 8101 Maintain at 37-387deg;C with relative humidity set above 60%
PBS Reagent Sigma-Aldrich PBS should be cold (> 4°C) and sterile
Dulbecco’s modified eagle’s medium Reagent Sigma-Aldrich D 6429 DMEM culture medium
Leibovitz’s L-15 Medium Reagent Invitrogen 31415-029 here: collection medium for tumor samples
Tumor cell -specific medium Reagent Sigma-Aldrich each research group should use the medium they culture their tumors cells in or common culture media, e.g. Leibovitz’s Medium or Dulbecco’s modified eagle’s medium
supplemented with 15% fetal bovine serum (FBS), 4mM L-glutamine and 50 μM insulin
70% EtOH Reagent Sigma-Aldrich
Magnetic stir bar, triangled 80 mm Tool VWR international 442-0391 A triangled magnetic stir bar serves well to crack the eggs shell.
Forceps DUMONT #5 Tool Fine Science Tools 11252-30 bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip)
Forceps DUMONT #7 Tool Fine Science Tools 11271-30 curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip)
Spring scissors, straight, 8cm Tool Fine Science Tools 15000-00 fine, small straight blades
Fine Iris scissors, straight Tool Fine Science Tools 14094-11 Use to cut our the CAM
Standard scissors, straight, sharp/blunt Tool Fine Science Tools 14007-14 Use for decapitation or cervical dislocation
microliter syringe 1702 TLLX, 25 μl Tool Hamilton Co 80222 Use for injection into the vitreous
Hamilton 33-G needle (15 mm) Tool Fine Science Tools 18073-15 Use for injection into the vitreous
Sterile scalpels Tool Use for dissecting tumor samples
Small drain spoon Tool Geuder 15758 Use to transfer of small chick embryos
Wax board with fixing pins Tool Home made Use to fix of animals for dissection
Petri dishes 60 x 15 mm Tool Greiner Bio-One 628102
Petri dishes 92 x 16 mm Tool Sarstedt Ltd 82.1472
Sterile Petri dish 100 x 20 mm Tool Greiner Bio-One 664160 extra deep, with spacers for ventilation
Beaker Tool 300-600 ml
FALCON tubes Tool Falcon BD 15 ml and 50 ml
Eppendorf tubes Tool Eppendorf 1.5 ml and 2 ml
1ml pipette tips Tool Use to cut plastic rings for application of substances / cells
Peripheral venous catheter (PVL) Tool Viggo® Use to cut silicon rings from the tube for application of substances / cells
Pipettes and tips Tool Eppendorf
Autoclaved folded Filters 595 1/2, 110 mm diameter Tool Schleicher Schuell 311643 Carrier, which caused least irritation of the CAM; used in the paper
PTFE-Pledget, non resorbing, 6,3 x 152.4 x 1.6 mm Tool santec-medical REF 277, LOT 832/511-1 Carrier; caused false positive results
Hxdroxyethylcellulose Tylose H 100000 Reagent Carrier mixed with Kollidon 17 PF; caused false positive results
Kollidon 17 PF Reagent BASF S30200 mixed with Hydroxyethylcellulose; caused false positive results
Collagen Biomatrix TissuDura Tool Baxter Internationl Inc. REF B2246000999999 Carrier; caused false positive results
Round glass cover slips, 11 mm Tool Assistent Germany 1001/0011 Carrier; causes false positive results
Bovine Collagen Sponge Tool Wyeth Animal Health Carrier; caused false positive results
Resodont Absorbable Collagen Membrane Tool Resorba Woundcare Germany LOT 280303 Carrier; caused false positive results
Non-Woven Swabs Tool Fink Walter GmbH REF 328132 Carrier; caused false positive results

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 41, 391-394 (1974).
  2. Tufan, A. C., Akdogan, I., Adiguzel, E. Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of development neurobiology. Neuroanatomy. 3, 8-11 (2004).
  3. Deryugina, E. I., Quigley, J. P. Chick embryo chorioallantoic membrane models to quantify angiogenesis induced by inflammatory and tumor cells or purified effector molecules. Methods Enzymology. 444, 21-44 (2008).
  4. Ribatti, D. Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis. Int. Rev. Cell Mol. Biol. 270, 181-224 (2008).
  5. Höckel, M., Sasse, J., Wissler, J. H. Purified monocyte-derived angiogenic substance (angiotropin) stimulates migration, phenotypic changes, and "tube formation" but not proliferation of capillary endothelial cells in vitro. J. Cell Physiol. 133, 1-13 (1987).
  6. Wissler, J. H. Engineering of blood vessel patterns by Angio Morphogens [Angiotropins]. Materialwiss. Werkstofftech. 32, 984-1008 (2001).
  7. Kistler, H. B. J. r., LaVail, J. H. Penetration of horseradish peroxidase into the optic nerve after vitreal or vascular injections in the developing chick. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 20, 705-716 (1981).
  8. Halfter, W. Change in embryonic eye size and retinal cell proliferation following intravitreal injection of glycosaminoglycans. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49, 3289-3298 (2008).
  9. Oppitz, M., Busch, C., Shriek, G., Metzger, M., Just, L., Drews, U. Non-malignant migration of B16 mouse melanoma cells in the neural crest and invasive growth in the eye cup of the chick embryo. Melanoma Res. 17, 17-30 (2007).
  10. Uchibayashi, T., Egawa, M., Nakajima, K., Hisazumi, H., Tanaka, M., Endo, Y., Sasaki, T. Responses of tumour cell lines implanted onto the chorioallantoic membrane of chick embryo to anticancer agents in combination with hyperthermia. Urol. Res. 20, 237-239 (1992).
  11. Demir, R., Naschberger, L., Demir, I., Melling, N., Dimmler, A., Papadopoulus, T., Sturzl, M., Klein, P., Hohenberger, W. Hypoxia generates a more invasive phenotype of tumour cells: an in vivo experimental setup based on the chorioallantoic membrane. Pathol. Oncol. Res. (2008).
  12. Kunzi-Rapp, K., Genze, F., Kufer, R., Reich, E., Hautmann, R. E., Gschwend, J. E. Chorioallantoic membrane assay: vascularized 3-dimensional cell culture system for human prostate cancer cells as an animal substitute model. J. Urol. 166, 1502-1507 (2001).
  13. Hall, B. K. Grafting of organs and tissues to the chorioallantoic membrane of the embryonic chick. TCA Manual. 4, (3), 881-883 (1978).
  14. Kunzi-Rapp, K., Kaskel, P., Steiner, R., Peter, R. U., Krahn, G. Increased blood levels of human S100 in melanoma chick embryo xenografts' circulation. Pigment Cell Res. 14, 9-13 (2001).
  15. McFall, R. C., Sery, T. W., Makadon, M. Characterization of a new continuous cell line derived from a human retinoblastoma. Cancer Research. 37, 1003-1010 (1977).
  16. Deryugina, E. I., Zijlstra, A., Partridge, J. J., Kupriyanova, T. A., Madsen, M. A., Papagiannakopoulos, T., Quigley, J. P. Unexpected effect of matrix metalloproteinase down-regulation on vascular intravasation and metastasis of human fibrosarcoma cells selected in vivo for high rates of dissemination. Cancer Research. 65, 10959-10969 (2005).
  17. Kim, J., Kovalski, K., Ossowski, L. requirement for specific proteases in cancer cell intravasation as revealed by a novel semiquantitative PCR-based assay. Cell. 94, 353-362 (1998).
Kuiken<em> Ex ovo</em> Cultuur en<em> Ex ovo</em> CAM test: Hoe het echt werkt
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Dünker, N. Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works. J. Vis. Exp. (33), e1620, doi:10.3791/1620 (2009).More

Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Dünker, N. Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works. J. Vis. Exp. (33), e1620, doi:10.3791/1620 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter