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Biology

小鸡前OVO文化前OVO CAM含量:它是如何真正起作用

doi: 10.3791/1620 Published: November 30, 2009

Summary

鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)是一个独特的,自然免疫缺陷的支持文化环境研究血管生成和肿瘤发生。此视频文章演示了在鸡的不同步骤

Abstract

在繁殖初期的鸡蛋之间在体外和体内系统,并提供了血管的测试环境,不仅要研究血管生成,但更要研究肿瘤的发生。后的鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)的发展,其血管网络可以轻松地访问,操纵和观察,因此对血管生成的实验提供了一个最佳设置。由于淋巴系统没有完全开发的后期阶段,直到孵化,鸡胚作为一个能够维持无特定物种的限制嫁接的组织和细胞的自然免疫缺陷的主机。除了培育发展异体和异种移植,CAM血管网络提供了一个独特的支持性环境对肿瘤细胞的血管内,传播和血管逮捕和被逮捕细胞渗出,形成微转移灶的一个仓库里。

实验目的,在最近期的研究CAM暴露切割通过蛋壳的一个窗口,并进行了实验在 OVO无障碍CAM和效果的观察和照片文件的可能性,造成很大的局限性。当鸡胚无壳培养使用1-4,提供了无实验细节,如果在所有出版,这些文化的存活率低。我们精制的鸡胚前OVO文化的方法显着引进的鸡蛋含量的合理控制挤压。这些当然OVO文化,加强无障碍CAM和鸡胚,使容易在体内影响的文件,并促进胚胎的实验操作。这使得大量的科学问题进行了成功的应用:(1)作为改善血管生成的实验5,6,(2)实验设立便利注射鸡胚眼7-9的玻璃体,(3)作为一个测试环境中传播和血管内的分散维持移植成功和肢芽鸡和小鼠13以及文化作为一种改进系统 ​​肿瘤细胞从细胞接种于CAM 10-12线,(4(5)嫁接,繁殖,重新嫁接坚实的原发肿瘤组织活检获得表面上的CAM 14)为。

在这个视频文章中,我们描述了建立一个精致的小鸡前OVO文化和CAM与存活率的检测,50%以上。除了 ​​我们提供了一个一步一步前OVO文化的科学应用的大量成功应用的示范。


丹尼尔Dohle,苏珊D.婆娑,和塞巴斯蒂安Gustmann同等贡献这项研究。

Protocol

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所有的设备和试剂必须购买无菌或需要加热或蒸汽消毒或用70%乙醇消毒。

作者状态,对动物的实验是根据欧洲共同体理事会指令(86/609/EEC),美国国立卫生研究院的机构动物所规定的实验程序和法规的动物护理和使用准则保养和使用委员会(IACUC)在杜伊斯堡 - 埃森大学(德国)。

第1部分:蛋孵化

  1. 受精卵可存储长达一个星期在13 ° C。
  2. 鸡蛋孵育72小时,躺在水平的孵化器与移动的托盘,旋转的鸡蛋12次,每天不断。湿度保持在60 - 62%,孵化温度为37.5 ° C。
    注:在开始孵化,灰尘,羽毛和粪便,小心取出从鸡蛋壳机械常见,灰色锯齿手纸巾,其中有一个柔软的表面结构,而不是粗糙的干擦。用乙醇或消毒擦拭的鸡蛋,但是,显着降低胚胎成活率不论所使用的液体。

第2部分: 防爆OVO文化

  1. 经过72小时的孵化,蛋是从孵化器中删除。
    :卵孵育72小时,因为-根据我们的实验-原因不明,但在与奥尔巴赫等al.1早期发展阶段的协议生存率有显着降低。黄麻袋,这是由凸轮尚未覆盖的阶段最迟72小时变得更薄,往往要坚持领导(一)少量出血,在坚持和(ii)破裂的蛋黄,一袋鸡蛋壳膜。因此提出的方法并不适用于年龄超过72小时的胚胎。
  2. 因为胚胎在一定程度上抵抗旋转的鸡蛋的顶部,胚胎的所在,用铅笔标记。
  3. 鸡蛋是水平之上的铅笔标记,并破获一个80毫米的三角磁力搅拌铺设面向鸡蛋的长轴垂直栏的边缘。
    :更好的感觉,没有应使用手套,但双手应消毒,用70%乙醇。重要的是,开辟了鸡蛋壳,以及卵膜。蛋清泄漏是一个安全标志,卵膜已穿孔。
  4. 鸡蛋是保持着密切的培养皿底部的蛋清,以避免进一步的泄漏。
    注:在最初开放的过程中,重要的是在培养皿的底部,鸡蛋白是这个结果仍然连接到蛋内的其余部分,在一个拥有顶级内的胚胎蛋黄蛋内的真空鸡蛋。通过手指的压力,控制进气口进入卵子或解除卵子,从而增加了连接蛋清即真空列,可调节的真空。
  5. 轻轻施加压力,通过裂缝和鸡蛋拇指和中指的赤道运行经络是可以调节的真空。蛋的内容可以被转移到培养皿中完好无损,如果与蛋黄的鸡蛋轻轻地抬起,仔细分离两半壳。胚胎和卵黄船只应趴在一个完好的蛋黄顶部。
    注意 :如果不保持顶部铅笔标记,开裂的外壳时,可能会伤害胚胎。如果鸡蛋没有破解足够仔细或胚胎72小时以上(见上文),黄麻袋枝壳和经常破裂。同样的情况时,孵化器的湿度不低于60%或鸡蛋在孵化过程中旋转。
  6. 返回前OVO文化的孵化器,并保持在37.5 ° 38.2 ° C和60%的湿度。 CO 2或O 2的供应是没有必要的,如果孵化器是不是封闭的密封(通风电网局部开放!),并使用特殊的Petri与盖和盘之间的间隔菜。
    :移动的胚胎,应保持在孵化的第一天到最低限度。在高死亡率的太多躁动的结果。从孵化第9天起,胚胎不敏感鼓动。
    死胚应立即删除,以避免感染。
    如果使用细胞培养孵化器,密封封闭,O 2的供应是不会死的胚胎强制性。湿度是必不可少的CAM不是干出来的,如果孵化温度超过37 ° C,胚胎会发展得太慢。

第3部分:物质的血管生成实验中的应用

  1. 蒸压折叠滤纸(5由打孔器打孔,直径0.5毫米),用于支持应用到CAM的液体物质的材料(载体)。
    注意 :几乎每个载体材料(见下表)引起的CAM刺激,尤其是在孵化第10天前申请,因为它改变了发展中国家的CAM血管结构。这也包括潜在的惰性物质,如羟乙基纤维素箔,聚四氟乙烯(PTFE - pledgets)的海绵,胶原蛋白海绵,胶原蛋白的金属箔,用无菌纱布(拭子),圆形盖玻片,和硅环,而这一切导致假阳性结果。滤纸似乎导致至少刺激性,因此,在我们的实验中使用。
  2. 当凸轮的全面发展,多达6种不同的样本可能会被应用,其效果可以在一个单一的凸轮相比。
  3. 为了避免干燥过滤器额外的剂量(3微克本土angiotropin)或缓冲液(5μLPBS)应重新申请每天。
  4. 从申请后第3天,血管定位对血管生成物质的过滤器,而周边控制的血管格局不变。
    注:CAM的不应该误认为蛋黄,麻袋。 CAM是一个动态发展的结构,而蛋黄麻袋在开发过程中有一点差异的静态。发展日间三个发展中国家的CAM可以确认胚胎的尾部结束第一次作为一个小囊泡。初步囊泡之间的第三天,每天十个扩展,创建一个折叠的两层膜overgrowing黄麻袋的速度越来越快。申请地点应半之间的胚胎和CAM(境)倍的方式,否则胚胎阻碍在透射光显微镜下观察效果。另外,与血管生成物质的过滤器是内在的,当凸轮不断增加。

第4部分:细胞接种到CAM

细胞4.1.Preparation的

  1. 聚合细胞从培养瓶转移到鹰管,使用25毫升无菌塑料吸管使用吸管援助。
  2. 估计细胞数,15μL的细胞悬液转移到一个纽鲍尔室和细胞在显微镜下手工计算。
  3. 猎鹰管离心3分钟,在室温下在1000 RPM和丢弃上清液。
  4. 对于活细胞的跟踪,细胞用PBS稀释至所需浓度(此处为:2 × 10 7细胞/ ml),如PKH26(Sigma公司),一个红色荧光活细胞膜标记试剂盒染色,根据制造商的协议。
    细胞重新悬浮在细胞培养液(优先贝科的修改鹰的介质; DMEM培养液)注射所需浓度(10 7细胞/毫升)或接种(3X10 6细胞/毫升)。根据文献15-17日 ,我们的经验已经出版的浓度,不同的细胞浓度用于注射与接种。

4.2接种细胞到CAM

  1. 使用锋利的手术刀,戒指(〜1mm厚)从一个1毫升枪头或周边静脉导管(PVL)管被切断,适用于E6 - E14鸡胚培养前 OVO CAM 。
    注意 :尽量不要“看到”了几次,但枪头或用导管穿过切割使用一个新的,非常尖锐的手术刀锋利的边缘,以避免上环。检查微裂缝产生的尖锐的边缘,在显微镜下环。
  2. 根据环的大小20 3X10 6细胞/ ml的细胞液吸管在共成一个圈,或分割成多个环卷。
    :在某些情况下,轻轻地刮取CAM性伤痛的一个先决条件,例如,以方便接种细胞17 capillarisation移植(见下文)。但是,如果性伤痛的CAM是不打算或contraindicative,如肿瘤细胞的侵袭潜能的研究,戒指不应该被用于接种,但应直接应用于环或环细胞本身可能诱发微病变。如果使用环,这些应该削减尽可能薄,以尽量减少重量和避免的CAM缩进。

第5部分:玻璃体内注射细胞

  1. 汉密尔顿微升注射器,70%的乙醇,最后用无菌PBS冲洗数次。
  2. 充满了微量注射器的准备染色或不染的细胞悬液(见4.1部分)。
    注:注射部位,要慎重选择,不要伤害比用针穿透血管的胚胎(brain!)的CAM或相邻结构。注射应根据解剖双眼。
  3. 显微镜下控制小心,但很快用注射器针头穿透CAM和眼睛层,并不断注入10最大20μL细胞悬液(优先PBS稀释)进入玻璃体鸡胚培养前 OVO 。
    注意:如果不能用针穿透,在CAM,它可能会用两个镊子轻轻撕裂它除了在网站很少或根本没有血管中删除。
  4. 针应保持1-2秒,进入眼内注入细胞悬液,以避免因漏电损失。

第6部分:夹层鸡肢芽

  1. 鸡蛋是从孵化器,孵化后3〜4天(E3/E4 =汉堡汉密尔顿(HH)stage18 - 23)
  2. 鸡蛋裂开了一个三角磁力搅拌棒的边缘上,转移到培养皿中(详情:请参阅第2部分),并从连接的蛋黄血管解剖,胚胎切割一个圆圈,用弹簧剪刀。
  3. 胚胎转移到一个新的充满冷,无菌PBS的培养皿中,用一个小漏勺洗净,一种躁动。
  4. 胚胎被转移到一个小培养皿中,用无菌PBS填充,从周围的膜中解脱出来,用细镊子小心撕裂他们分开。
  5. 肢芽脱离显微镊子尽可能靠近身体,掌握和转移到一个主机8 - 10日龄的鸡养殖前 OVO(见嫁接过程)CAM 。

第7部分:制备小鼠肢芽

  1. 一次怀孕交配设立和指定的女性交配检测阴道塞的一天上午妊娠0天。
  2. 怀孕的女性是牺牲颈椎错位时,胚胎的发展达到了胚胎一天(五)10至13,并固定于蜡板上。
  3. 腹壁蘸70%乙醇,沿中线切开皮瓣是固定的横向引脚。
  4. 子宫的两个角是从腹部,用冷PBS分离并转移到烧杯中删除。
  5. 胚胎分离,转移到培养皿和子宫壁,并使用镊子仔细胚胎膜被删除。
  6. 肢芽切断使用弹簧剪刀或罚款钳分离尽可能靠近身体,掌握和转移的CAM 8 - 10日龄主机鸡养殖前OVO(见嫁接过程)。

第8部分:收集的肿瘤样本

  1. 肿瘤活检收集在2毫升的Eppendorf管洋溢着肿瘤细胞的特定的培养基(在这里:Leibovitz的培养基),并在室温下保存。
  2. 肿瘤活检无菌手术刀切成1-2万立方米件。
    注意 :如果肿瘤样本太小,他们可能不会附加到CAM,如果过大,可能会受伤,在CAM,胚胎可能死亡。
  3. 一块从活检样品的核心是嫁接到CAM的8 - 10日龄主机鸡养殖前 OVO(见嫁接过程) 。
    :以活检表面的材料,增加肌肉或结缔组织污染的风险。

第9部分:嫁接过程

  1. 肢芽或肿瘤标本,充分开发的8 - 10日龄鸡胚培养的前 OVO使用CAM嫁接。
  2. Ÿ附近的血管分叉CAM移植占尽地利。
  3. 在所需的应用程序的网站,CAM是有选择性的创伤轻轻地刮取关闭(钳)双上皮细胞层上部peridermal部分,留下完整的基底层。
    :这是必不可少的,以避免出血或可见毛细血管破裂。
  4. 移植物转移到CAM附加最小的PBS。根据嫁接,它可能是一次或两次放置在一个网站的CAM,在没有最终嫁接的目的是清除过多的PBS,然后终于在准备好的精神创伤的CAM网站嫁接。
  5. 抓住罚款钳移植到CAM分层。根据移植物的敏感性,轻的压力可能被应用不适合肢芽)机动嫁接成的CAM缩进(适合肿瘤样本) 。
    注意 :由于雏鸡免疫系统的发展,在胚胎一天(五)18 OVO异种移植的文化不应该超越E17的延长主机鸡胚经常死。
    有可用的主机凸轮,分别培养鸡胚前OVO,定时,以配合您所选择的捐助者组织的来源是很重要的。

第10部分:重新嫁接

  1. 主机鸡胚被杀害斩首。
  2. 与CAM删除附加的移植是一个圆形切割指出剪刀,并转移到培养皿中,用PBS充满。
  3. 过度CAM是减少弹簧剪刀,从移植前附着部位除外。
  4. 更大的肿瘤样本的情况下,削减一半或几个较小的部分移植和面临的第二个主机的新的CAM与切割边缘重新嫁接。

第11部分:代表结果

图1
图1。无壳的鸡文化
鸡胚不同发展阶段的培养在培养皿中的前 OVO 。

图2
图2 前OVO CAM血管生成试验
受精鸡蛋中培养水平在37℃,湿度为60 - 62%,并在胚胎第4天(E4)培养皿破获。在同等条件下继续培养。在E10的无菌滤纸(直径5.5毫米)是分层的CAM上,浸泡5μLPBS或3微克本土angiotropin6。在E14,毛细血管呈明显的调整对angiotropin浸泡过的滤纸。

图3
3。EX OVO肢芽嫁接
鸡(E3/E4)和鼠标(E13)的肢芽嫁接到壳鸡文化CAM。从CAM的血管进入后两天的肢芽。肢芽的发展, 继续这些前OVO文化在鸡达到两指骨阶段,并显示在小鼠肢芽趾间网减少。

图4
图4 前OVO接种肿瘤样本。
一个膀胱癌的活检样本接种到10日龄的鸡胚培养前OVO CAM。经过两天在文化,连接到CAM血管肿瘤标本后7天,观察多个血管进入移植。

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Discussion

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创新或只是另一个小鸡文化协议?

1-4与前壳的文化协议鸡胚的总生存率分别为低,例如CA。 30%1。此视频文章中所述的成品前OVO文化协议,相反,允许超过50%的生存率。 OVO文化经典相比鸡胚 OVO文化,大大方便了CAM和鸡胚的无障碍,使他们的实验操作和连续监测。这种文化的方法,可用于各种广泛的应用,增强血管生成的实验5,6,促进注射7-9鸡胚眼玻璃体, 血管内检测10-12不等,提高了嫁接肢芽13生长14个肿瘤样本的维护和创新。因此, 前OVO文化有利于发展,angionesis和肿瘤研究中的一个有用的工具。

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Acknowledgments

作者想感谢优秀的技术援助和教授Ruebben J. Kueper J. Wittschier慷慨地提供肿瘤物质。

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Fertilized Eggs Animal Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH
Mice Animal Charles River Laboratories
Incubator Type 3000 with rotating egg tray Tools Siemens AG 9503 Maintain at 37°C with relative humidity set above 60%
Egg incubator BSS 160 Tools Grumbach, Germany 8101 Maintain at 37-387deg;C with relative humidity set above 60%
PBS Reagent Sigma-Aldrich PBS should be cold (> 4°C) and sterile
Dulbecco’s modified eagle’s medium Reagent Sigma-Aldrich D 6429 DMEM culture medium
Leibovitz’s L-15 Medium Reagent Invitrogen 31415-029 here: collection medium for tumor samples
Tumor cell -specific medium Reagent Sigma-Aldrich each research group should use the medium they culture their tumors cells in or common culture media, e.g. Leibovitz’s Medium or Dulbecco’s modified eagle’s medium
supplemented with 15% fetal bovine serum (FBS), 4mM L-glutamine and 50 μM insulin
70% EtOH Reagent Sigma-Aldrich
Magnetic stir bar, triangled 80 mm Tool VWR international 442-0391 A triangled magnetic stir bar serves well to crack the eggs shell.
Forceps DUMONT #5 Tool Fine Science Tools 11252-30 bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip)
Forceps DUMONT #7 Tool Fine Science Tools 11271-30 curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip)
Spring scissors, straight, 8cm Tool Fine Science Tools 15000-00 fine, small straight blades
Fine Iris scissors, straight Tool Fine Science Tools 14094-11 Use to cut our the CAM
Standard scissors, straight, sharp/blunt Tool Fine Science Tools 14007-14 Use for decapitation or cervical dislocation
microliter syringe 1702 TLLX, 25 μl Tool Hamilton Co 80222 Use for injection into the vitreous
Hamilton 33-G needle (15 mm) Tool Fine Science Tools 18073-15 Use for injection into the vitreous
Sterile scalpels Tool Use for dissecting tumor samples
Small drain spoon Tool Geuder 15758 Use to transfer of small chick embryos
Wax board with fixing pins Tool Home made Use to fix of animals for dissection
Petri dishes 60 x 15 mm Tool Greiner Bio-One 628102
Petri dishes 92 x 16 mm Tool Sarstedt Ltd 82.1472
Sterile Petri dish 100 x 20 mm Tool Greiner Bio-One 664160 extra deep, with spacers for ventilation
Beaker Tool 300-600 ml
FALCON tubes Tool Falcon BD 15 ml and 50 ml
Eppendorf tubes Tool Eppendorf 1.5 ml and 2 ml
1ml pipette tips Tool Use to cut plastic rings for application of substances / cells
Peripheral venous catheter (PVL) Tool Viggo® Use to cut silicon rings from the tube for application of substances / cells
Pipettes and tips Tool Eppendorf
Autoclaved folded Filters 595 1/2, 110 mm diameter Tool Schleicher Schuell 311643 Carrier, which caused least irritation of the CAM; used in the paper
PTFE-Pledget, non resorbing, 6,3 x 152.4 x 1.6 mm Tool santec-medical REF 277, LOT 832/511-1 Carrier; caused false positive results
Hxdroxyethylcellulose Tylose H 100000 Reagent Carrier mixed with Kollidon 17 PF; caused false positive results
Kollidon 17 PF Reagent BASF S30200 mixed with Hydroxyethylcellulose; caused false positive results
Collagen Biomatrix TissuDura Tool Baxter Internationl Inc. REF B2246000999999 Carrier; caused false positive results
Round glass cover slips, 11 mm Tool Assistent Germany 1001/0011 Carrier; causes false positive results
Bovine Collagen Sponge Tool Wyeth Animal Health Carrier; caused false positive results
Resodont Absorbable Collagen Membrane Tool Resorba Woundcare Germany LOT 280303 Carrier; caused false positive results
Non-Woven Swabs Tool Fink Walter GmbH REF 328132 Carrier; caused false positive results

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References

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Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Dünker, N. Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works. J. Vis. Exp. (33), e1620, doi:10.3791/1620 (2009).More

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