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Biology

Poussin doi: 10.3791/1620 Published: November 30, 2009

Summary

La membrane chorio-allantoïde de poulet (CAM) est un environnement unique et naturellement immunodéficients culture favorable pour étudier l'angiogenèse et de la tumorigenèse. Cet article vidéo montre les différentes étapes de poussin

Abstract

Les œufs de poule dans la première phase de reproduction sont entre données in vitro et in vivo et de fournir un environnement de test vasculaire non seulement d'étudier l'angiogenèse mais aussi d'étudier la tumorigenèse. Après que la membrane chorio-allantoïde de poulet (CAM) a mis au point, son réseau de vaisseaux sanguins peut être facilement accessible, manipulé et observé et permet donc un réglage optimal pour les essais d'angiogenèse. Comme le système lymphoïde n'est pas complètement développée jusqu'aux stades tardifs de l'incubation, l'embryon de poulet sert d'hôte immunodéprimé naturellement capable de soutenir les tissus et les cellules greffées sans restrictions spécifiques à l'espèce. En plus de nourrir le développement d'allo-et xénogreffes, le réseau de vaisseaux sanguins CAM offre un contexte favorable à la intravasation cellules tumorales, la diffusion et l'arrestation vasculaire et un référentiel dans lequel les cellules arrêtées s'extravaser pour former des micro foyers métastatiques.

À des fins expérimentales, en moer des études récentes, le CAM a été exposée en coupant une fenêtre à travers la coquille d'oeuf et expériences ont été réalisées in ovo, ce qui entraîne des limitations significatives dans l'accessibilité de la CAM et possibilités pour l'observation et la documentation photographique des effets. Quand le shell-moins des cultures de l'embryon de poulet ont été utilisés 1-4, pas de détails expérimentaux ont été fournis et, si publiées, les taux de survie de ces cultures étaient faibles. Nous avons affiné la méthode de culture in ovo ex d'embryons de poulet de façon significative par l'introduction d'une extrusion contrôlée rationnelle de la teneur en œuf. Ces cultures ex ovo améliorer l'accessibilité de l'embryon CAM et Chick, ce qui permet facilement dans la documentation in vivo des effets et de faciliter la manipulation expérimentale de l'embryon. Cela permet à l'application réussie d'un grand nombre de questions scientifiques: (1) Comme un essai d'angiogenèse amélioration de 5,6, (2) un dispositif expérimental mis en place pour les injections de faciliter l'établissement ee vitré de l'oeil d'embryon de poulet 7-9, (3) comme un environnement de test pour la diffusion et la dispersion de intravasation cellules tumorales à partir de lignées cellulaires établies inoculées sur la CAM, 10-12 (4) en tant que système de maintien amélioré pour la transplantation réussie et culture de bourgeons de membres de poulet et 13 souris ainsi que (5) pour le greffage, de propagation, et de nouveau la greffe de tissu tumoral solide primaire obtenu à partir de biopsies de la surface de la came 14.

Dans cet article, nous décrivons la vidéo mise en place d'une culture raffinée poussin ex ovo et le dosage CAM avec des taux de survie de plus de 50%. En plus nous offrons une démonstration étape par étape de l'application réussie de la culture ex ovo pour un grand nombre d'applications scientifiques.


Daniel S. Dohle, Susanne D. Pasa, et Sebastian Gustmann contribué également à cette étude.

Protocol

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Tout le matériel et les réactifs doivent être achetés stérile ou doit être stérilisé à la vapeur ou de la chaleur ou stérilisé avec de l'EtOH 70%.

Les auteurs indiquent que les expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les Communautés européennes Directive du Conseil (86/609/CEE), en suivant les directives du NIH concernant le soin et l'utilisation des animaux à des procédures expérimentales et les règlements établis par l'Animal institutionnel Soin et utilisation comité (IACUC) à l'Université de Duisburg-Essen (Allemagne).

Partie 1: Incubation des œufs

  1. Les œufs fécondés peuvent être stockés à 13 ° C pendant une semaine.
  2. Les œufs sont incubés pendant 72 heures, couché horizontalement dans un incubateur avec un plateau mobile, la rotation des oeufs 12 fois par jour en continu. L'humidité est maintenue à 60 - 62% Température d'incubation à 37,5 ° C.
    Remarque: Avant de commencer l'incubation, la saleté, les plumes et les excréments sont soigneusement retirésdes coquilles d'œuf mécaniquement par un essuyage à sec avec communs, des serviettes en zigzag gris-mains en papier, qui ont une grossière plutôt que d'une structure de surface douce. Essuyer les oeufs avec de l'éthanol ou de désinfection, toutefois, le taux de survie significativement réduit des embryons, quel que soit le liquide utilisé.

Partie 2: Ex ovo culture

  1. Après 72 heures d'incubation, les œufs sont retirés de l'incubateur.
    Remarque: Les œufs sont incubés pendant 72 heures parce que - selon nos expériences - pour des raisons inconnues, mais en accord avec les stades Auerbach al.1 et de développement antérieurs avaient un taux de survie nettement inférieurs. A des stades plus tard 72 heures le sac vitellin qui n'est pas encore couvert par le CAM devient plus fine et a tendance à adhérer à la coquille d'oeuf d'attaque (i) à de petites hémorragies dans le domaine de la conformité et (ii) la rupture du jaune-sac membrane. Par conséquent, la méthode présentée n'est pas applicable aux embryons âgés de plus de 72 heures.
  2. Laface supérieure des oeufs, où l'embryon se trouve, est marqué par le crayon depuis embryon résiste à la rotation dans une certaine mesure.
  3. L'œuf est maintenu à l'horizontale avec la marque de crayon sur le dessus et craqué sur le bord d'un 80 mm agitation magnétique barre triangulaire portant orientés perpendiculairement à l'axe longitudinal de l'œuf.
    Remarque: Pour une meilleure sensation, pas de gants devraient être utilisés, mais les mains doivent être désinfectés avec de l'EtOH 70%. Il est important que la coquille d'oeuf ainsi que la membrane de l'œuf sont ouverts. Fuite de blanc d'oeuf est un signe sûr que la membrane de l'œuf a été perforée.
  4. L'oeuf est maintenu à proximité du fond de la boîte de Petri pour éviter une fuite supplémentaire de blanc d'oeuf.
    Remarque: Lors de la procédure d'ouverture initiale, il est important que le blanc d'oeuf sur le fond de la boîte de Pétri est toujours connecté au repos à l'intérieur de l'œuf que cela entraîne dans le vide à l'intérieur de l'œuf qui détient le jaune d'oeuf avec l'embryon le haut à l'intérieur l'œuf. Le vide peut être réglée soitpar une pression du doigt, qui commande l'entrée d'air dans l'oeuf ou de la levée de l'oeuf qui augmente la colonne de blanc d'oeuf soit reliée au vide.
  5. En appuyant légèrement sur le méridien qui traverse la fissure et l'équateur de l'œuf par le pouce et milieu, il est possible de réguler le vide. Le contenu de l'œuf peut ensuite être transféré à la boîte de Petri en bon état, si l'oeuf avec le jaune est délicatement soulevé, et les deux moitiés de la coquille sont soigneusement séparés. L'embryon et les vaisseaux vitellins devrait se situer au-dessus d'un jaune d'oeuf intact.
    Remarque: Si la marque de crayon ne sont pas conservées au-dessus, l'embryon peut être blessé quand casser la coquille. Si les œufs ne sont pas fissurés avec assez de soin ou les embryons sont âgés de plus de 72 heures (voir ci-dessus), le sac vitellin se colle à la coquille et souvent des ruptures. La même chose se produit lorsque l'humidité de l'incubateur est inférieur à 60% ou d'oeufs ne sont pas pivotées pendant l'incubation.
  6. Ex ovo cultures sont retournés dans uncubator et maintenu à 37,5 ° 38,2 ° C et une humidité de 60%. CO 2 ou O 2 d'alimentation n'est pas nécessaire si l'incubateur n'est pas fermé hermétiquement (grille de ventilation partiellement ouverte!) Et spéciales des boîtes de Pétri avec des entretoises entre le couvercle et le plat sont utilisées.
    Remarque: Le déplacement des embryons doivent être conservés au minimum pendant les premiers jours d'incubation. Des résultats d'agitation trop des taux de mortalité élevés. De jour 9 incubation partir, les embryons sont moins sensibles à l'agitation.
    Les embryons morts doivent être enlevés immédiatement pour éviter les infections.
    Si incubateurs de culture cellulaire sont utilisés, qui sont hermétiquement fermés, O 2 offre est obligatoire pour les embryons ne pas mourir. L'humidité est essentielle pour la CAM ne pas se dessécher et si la température d'incubation est inférieure à 37 ° C, les embryons se développent trop lentement.

Partie 3: Application de substances pour des essais de l'angiogenèse

  1. Autoclavé pliés papiers filtres (50,5 mm de diamètre) sont découpées par une perforatrice et utilisée comme matériau de support (support) pour les substances liquides appliquées à la CAM.
    Remarque: Presque chaque matériau de support (voir le tableau ci-dessous) a provoqué une irritation de la CAM, en particulier lorsqu'elle est appliquée avant 10 jours d'incubation, comme il a changé l'architecture CAM développe navire. Cela a également inclus des substances potentiellement inertes comme feuille hydroxyéthylcellulose, éponges Téflon (PTFE-pledgets), des éponges de collagène, feuilles de collagène, de la gaze stérile (tampons), lamelles couvre-objets ronds, et les anneaux de silicium, qui ont tous causé des résultats faussement positifs. Papier filtre a semblé causer la moindre irritation et a donc été utilisé dans nos tests.
  2. Lorsque le CAM est complètement développé, jusqu'à 6 échantillons différents peuvent être appliqués et leurs effets peuvent être comparés sur un seul CAM.
  3. Pour éviter le dessèchement des doses filtres supplémentaires (3 mg natif angiotropine) ou de tampon (5 pi de PBS) devrait être appliqué de nouveau tous les jours.
  4. De jour 3 après vess demande, le sangels orienter vers les substances angiogéniques sur les filtres, alors que le motif de vaisseaux sanguins autour de commandes est inchangé.
    Remarque: Le CAM doit pas être confondu avec le jaune-sac. Le CAM est une structure dynamique tout en développant le sac vitellin est statique avec des écarts peu au cours du développement. Sur le développement de trois jours de la CAM en développement peut être reconnu pour la première fois à l'extrémité caudale de l'embryon comme une petite vésicule. Entre trois jours et dix jours de la vésicule initiale se développe, la création d'un plié en deux couches de membrane overgrowing le sac vitellin à un rythme croissant. Le site d'application doit être à mi-chemin entre l'embryon et le pli de la CAM (frontière), sinon l'embryon empêche l'observation microscopique des effets de la lumière transmise. Sinon, le filtre avec la substance angiogénique est internalisé lorsque la CAM ne cesse de croître.

Partie 4: Ensemencement des cellules sur la CAM

4.1.Preparation decellules

  1. Les cellules confluentes sont transférés du flacon de culture dans des tubes Falcon de l'utilisation d'une pipette stérile 25 ml en plastique à l'aide d'une pipette aide.
  2. Pour estimer le nombre de cellules, 15 ul de la suspension cellulaire est transférée à une cellule Neubauer et les cellules sont comptées manuellement sous un microscope.
  3. Tubes Falcon sont centrifugés pendant 3 min à 1000 rpm à température ambiante et le surnageant est éliminé.
  4. Pour le suivi des cellules vivantes, les cellules sont diluées avec du PBS à la concentration souhaitée (ici: 2x10 7 cellules / ml) et colorées avec par exemple PKH26 (Sigma), un rouge fluorescent Kit étiquetage direct de la membrane cellulaire, selon le fabricant protocole.
    Les cellules sont remises en suspension dans un milieu de culture cellulaire (de préférence milieu de Dulbecco modifié Eagle; DMEM) à la concentration souhaitée pour l'injection (10 7 cellules / ml) ou par inoculation (3x10 6 cellules / ml). Concentrations cellulaires différentes sont appliquées pour préparations injectables vs inoculation selon conconcentrations déjà publiées dans la littérature 15-17 ans et notre expérience.

4.2 Ensemencement des cellules sur la CAM

  1. Anneaux (~ 1 mm d'épaisseur) sont découpées à partir d'une pointe de pipette de 1 ml ou un cathéter veineux périphérique (PVL) du tube par l'utilisation d'un scalpel tranchant et appliquée à la came d'un embryon in ovo E6-E14 chiches cultivées ex.
    Remarque: Essayez de ne pas "vu" plusieurs fois, mais pour couper à travers la pointe de pipette ou d'un tube cathéter avec une coupe à l'aide d'un nouveau scalpel très pointu pour éviter les arêtes vives sur les anneaux qui en résultent. Vérifiez les cernes sous le microscope pour arêtes vives résultant de micro-fissures.
  2. En fonction de la taille de l'anneaux 20 pl de 3x10 6 cellules / ml sont déposés à la pipette dans des cellules totale dans une bague ou les volumes divisé en plusieurs cycles.
    Remarque: Dans certains cas, traumatisme de la CAM par grattage doux est un pré-requis, par exemple pour faciliter l'inoculation des cellules 17 et capillarisation de grafts (voir ci-dessous). Si, toutefois, traumatisme de la CAM n'est pas destiné ou contraindicative, par exemple pour des études sur le potentiel invasif des cellules tumorales, les anneaux ne doivent pas être utilisées pour l'inoculation, mais les cellules doivent être appliquées directement dans l'application des bagues ou anneaux eux-mêmes pourraient induire une lésion micro . Si les anneaux sont utilisés, ils doivent être coupés aussi mince que possible pour minimiser le poids et éviter l'indentation de la CAM.

Partie 5: injection intravitréenne de cellules

  1. Une seringue Hamilton microlitre est rincée plusieurs fois avec de l'EtOH 70% et enfin avec du PBS stérile.
  2. La seringue est rempli de micro la suspension de cellules colorées ou non colorées préparée (voir la partie 4,1).
    Remarque: Le site d'injection doit être choisi avec soin, pour ne pas blesser les vaisseaux sanguins des structures CAM ou à proximité de l'embryon (brain!) de plus de la pénétration de l'aiguille. L'injection doit se faire sous une loupe binoculaire de dissection.
  3. Sous le contrôle de microscope, Avec soin, mais pénètrent rapidement la CAM et couches pour les yeux avec l'aiguille de la seringue et d'injecter en continu de 10 à maximum 20 pl de suspension de cellules (de préférence dilué dans du PBS) dans le corps vitré de l'ovo embryon de poulet en culture ex.
    Remarque: Si le module CAM ne peut être pénétré par l'aiguille, il peut être retiré à un site avec des vaisseaux sanguins peu ou pas doucement le déchirer avec deux pinces.
  4. L'aiguille doit demeurer 1-2 secondes dans l'œil pour éviter une perte de la suspension de cellules injectées par la fuite.

Partie 6: La dissection des bourgeons de membres de poulet

  1. Les œufs sont retirés de l'incubateur après 3 à 4 jours d'incubation (E3/E4 = Hamburger Hamilton (HH) stage18-23)
  2. Les œufs sont fissurés sur le bord d'un barreau aimanté triangulaire et transféré dans une boîte de Pétri (détails: voir partie 2) et l'embryon est disséqué par les vaisseaux vitellins connectés en coupant un cercle avec des ciseaux à ressort.
  3. L'embryonest transféré dans une boîte de Pétri remplie de nouveau à froid, PBS stérile à l'aide d'une cuillère petit drain et lavé par agitation genre.
  4. L'embryon est transféré dans une petite boîte de Petri remplie de PBS stérile et libéré de membranes entourant soigneusement les déchirer avec des pinces fines.
  5. Les bourgeons de membres sont détachés par pince de microchirurgie au plus près du corps que possible, saisie et transférée à la CAM d'un ovo 8-10-jours d'âge poulet ex hôtes cultivées (voir greffer procédure).

Partie 7: Préparation des bourgeons de membres de la souris

  1. Accouplements Temps enceintes sont mis en place et le matin du jour où un bouchon vaginal est détecté dans l'accouplement des femelles est désigné 0 jour de gestation.
  2. La femme enceinte est sacrifiés par dislocation cervicale lorsque le développement de l'embryon atteint jour embryonnaire (E) 10 à 13, et fixé sur une planche de cire.
  3. La paroi abdominale est humidifié avec de l'EtOH 70%, couper le long de la ligne médiane et lalambeaux cutanés sont fixées latéralement par des épingles.
  4. Les deux cornes de l'utérus sont retirés de l'abdomen, détaché et transféré dans un bécher avec du PBS froid.
  5. Les embryons sont séparés, transféré dans une boîte de Pétri et paroi de l'utérus et les membranes embryonnaires sont retirés avec précaution à l'aide d'une pince.
  6. Les bourgeons de membres sont coupés par l'utilisation de ciseaux à ressort ou détachés par une pince fine au plus près du corps que possible, saisie et transférée à la CAM de 8 à 10 jours d'âge ovo poulet ex hôtes cultivées (voir greffer procédure).

Partie 8: Collection d'échantillons tumoraux

  1. Biopsies tumorales sont collectées dans 2 tubes Eppendorf ml remplis avec un milieu de culture de cellules tumorales spécifiques (ici: moyen Leibovitz) et conservé à température ambiante.
  2. Biopsies tumorales sont coupés en 1-2 morceaux par mm3 scalpels stériles.
    Remarque: Si les échantillons tumoraux étaient trop petits, ils pourraient ne pas joindre à la CAM, si elles étaient trop grandes, le CAM pourrait être Injurouge et l'embryon pourrait mourir.
  3. Un morceau du cœur de l'échantillon de biopsie est greffé sur la CAM de 8 à 10 jours d'âge ovo poulet ex hôtes cultivées (voir greffer procédure).
    Note: Prendre matière de la surface de la biopsie augmente le risque de contamination par des muscles ou du tissu conjonctif.

Partie 9: Greffage procédure

  1. Pour la greffe de bourgeons de membres ou d'échantillons tumoraux, le CAM pleinement développé d'embryons de poulet 8-10-un jour de culture in ovo ex est utilisé.
  2. Les greffons sont idéalement placés sur la CAM à proximité d'une bifurcation Y d'un vaisseau sanguin.
  3. Sur le site de l'application souhaitée, la CAM est sélectivement traumatisés par grattage hors douce (forceps) de la partie supérieure peridermal de la double couche épithéliale, laissant intacte la couche basale.
    Remarque: Il est essentiel pour éviter les saignements ou une rupture des capillaires visibles.
  4. La greffe est transférée à la CAM avec un minimum de PBS joindreed. Selon le greffe, il peut être placé une ou deux fois sur un site de la CAM, où aucun finale de greffage est destiné à éliminer l'excès de PBS et puis finalement greffé sur le site CAM traumatisés préparé.
  5. La greffe est saisi par une pince fine et couche sur la CAM. En fonction de la sensibilité de la greffe, une légère pression peut être appliquée (ne convient pas pour les bourgeons de membres) pour manoeuvrer le greffon dans une empreinte résultant de la CAM (pour des échantillons de tumeurs).
    Remarque: Comme le système immunitaire poussin se développe à jour embryonnaire (E) 18, ex ovo cultures xénogreffes ne doit pas être prolongée au-delà E17 que les embryons de poussins d'accueil meurent souvent.
    Il est important d'avoir CAM hôte disponibles, respectivement ovo embryons de poulet ex cultivées, coïncidant avec une source de tissu du donneur de votre choix.

Partie 10: Re-greffe

  1. L'accueil d'embryon de poulet est tué par décapitation.
  2. Le CAM avecle greffage joint est enlevé par une coupe circulaire avec des ciseaux pointus et transféré dans une boîte de Pétri remplie de PBS.
  3. CAM excessive est découpée à partir de la greffe par des ciseaux à ressort à l'exception du premier site d'attachement.
  4. Dans le cas de grands échantillons de tumeurs, le greffon est coupée en deux ou en plusieurs morceaux plus petits et de nouveau greffée avec l'arête de coupe tournée vers la came de nouveau le deuxième hôte.

Partie 11: Les résultats représentatifs

Figure 1
Figure 1. La culture de poulet sans coquille
Embryons de poulet de stades de développement différents en culture in ovo ex en boîtes de Petri.

Figure 2
Figure 2. Ex ovo test angiogenèse CAM
Œufs de poule fertilisés sont incubés horizontalement à 37 ° C et une humidité de 60 - 62% et craquelée dans Petriplats à jour embryonnaire 4 (E4). Incubation a été poursuivie dans les mêmes conditions. A E10 papiers filtres stériles (5,5 mm de diamètre) ont été superposés au-dessus de la CAM et trempées avec 5 pi de PBS ou 3 pg natif angiotropin6. Capillaires ont montré l'alignement évident vers la angiotropine papier filtre imbibé à E14.

Figure 3
Ex ovo Figure 3. Greffes de bourgeons de membres
Les bourgeons de membres du poussin (E3/E4) et la souris (E13) ont été greffées sur la CAM de cultures de poulet sans coquille. Les vaisseaux sanguins de la CAM entré dans les bourgeons de membres au bout de deux jours. Le développement des bourgeons de membres a continué dans ces cultures ex ovo atteignant une deuxième étape dans la phalange de poulet et d'afficher la réduction des voiles interdigitaux chez les bourgeons de membres murins.

Figure 4
Figure 4. Ex inoculation in ovo de toumor échantillon
Un échantillon de biopsie de cancer de la vessie a été inoculé sur la CAM d'un 10-ovo d'un jour d'embryon de poulet cultivés ex. Après deux jours de culture, le prélèvement tumoral a été connecté au système vasculaire CAM et après 7 jours, les vaisseaux sanguins multiples qui entrent dans le greffon n'a été observé.

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Discussion

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Novateur ou juste un autre protocole de culture poussin?

Avec les anciens protocoles de culture sans coquille 1-4 le taux de survie total des embryons de poulet ont été faibles, par exemple ca. 30% 1. Le protocole ex ovo culture raffinée décrit dans cet article la vidéo, en revanche, permet des taux de survie de plus de 50%. Par rapport à la musique classique dans des cultures in ovo culture ex ovo d'embryons de poulet facilite grandement l'accessibilité de l'embryon de poulet et CAM et permet leur manipulation expérimentale et la surveillance continue. Cette méthode de culture peut être utilisé pour une grande variété d'applications allant de l'angiogenèse tests améliorés 5,6, à des injections de facilité dans le corps vitré de l'œil embryon de poulet 7-9, 10-12 dosages intravasation, le greffage améliorée et la croissance des bourgeons de membres 13 et la maintenance innovante des échantillons de tumeurs 14. Ainsi, la culture ex ovo contribue-nouseful outil dans la recherche développement, angionesis et de la tumeur.

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Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier J. et J. Kueper Wittschier d'assistance technique excellente et le professeur Ruebben pour alimenter généreusement matériel tumoral.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Fertilized Eggs Animal Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH
Mice Animal Charles River Laboratories
Incubator Type 3000 with rotating egg tray Tools Siemens AG 9503 Maintain at 37°C with relative humidity set above 60%
Egg incubator BSS 160 Tools Grumbach, Germany 8101 Maintain at 37-387deg;C with relative humidity set above 60%
PBS Reagent Sigma-Aldrich PBS should be cold (> 4°C) and sterile
Dulbecco’s modified eagle’s medium Reagent Sigma-Aldrich D 6429 DMEM culture medium
Leibovitz’s L-15 Medium Reagent Invitrogen 31415-029 here: collection medium for tumor samples
Tumor cell -specific medium Reagent Sigma-Aldrich each research group should use the medium they culture their tumors cells in or common culture media, e.g. Leibovitz’s Medium or Dulbecco’s modified eagle’s medium
supplemented with 15% fetal bovine serum (FBS), 4mM L-glutamine and 50 μM insulin
70% EtOH Reagent Sigma-Aldrich
Magnetic stir bar, triangled 80 mm Tool VWR international 442-0391 A triangled magnetic stir bar serves well to crack the eggs shell.
Forceps DUMONT #5 Tool Fine Science Tools 11252-30 bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip)
Forceps DUMONT #7 Tool Fine Science Tools 11271-30 curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip)
Spring scissors, straight, 8cm Tool Fine Science Tools 15000-00 fine, small straight blades
Fine Iris scissors, straight Tool Fine Science Tools 14094-11 Use to cut our the CAM
Standard scissors, straight, sharp/blunt Tool Fine Science Tools 14007-14 Use for decapitation or cervical dislocation
microliter syringe 1702 TLLX, 25 μl Tool Hamilton Co 80222 Use for injection into the vitreous
Hamilton 33-G needle (15 mm) Tool Fine Science Tools 18073-15 Use for injection into the vitreous
Sterile scalpels Tool Use for dissecting tumor samples
Small drain spoon Tool Geuder 15758 Use to transfer of small chick embryos
Wax board with fixing pins Tool Home made Use to fix of animals for dissection
Petri dishes 60 x 15 mm Tool Greiner Bio-One 628102
Petri dishes 92 x 16 mm Tool Sarstedt Ltd 82.1472
Sterile Petri dish 100 x 20 mm Tool Greiner Bio-One 664160 extra deep, with spacers for ventilation
Beaker Tool 300-600 ml
FALCON tubes Tool Falcon BD 15 ml and 50 ml
Eppendorf tubes Tool Eppendorf 1.5 ml and 2 ml
1ml pipette tips Tool Use to cut plastic rings for application of substances / cells
Peripheral venous catheter (PVL) Tool Viggo® Use to cut silicon rings from the tube for application of substances / cells
Pipettes and tips Tool Eppendorf
Autoclaved folded Filters 595 1/2, 110 mm diameter Tool Schleicher Schuell 311643 Carrier, which caused least irritation of the CAM; used in the paper
PTFE-Pledget, non resorbing, 6,3 x 152.4 x 1.6 mm Tool santec-medical REF 277, LOT 832/511-1 Carrier; caused false positive results
Hxdroxyethylcellulose Tylose H 100000 Reagent Carrier mixed with Kollidon 17 PF; caused false positive results
Kollidon 17 PF Reagent BASF S30200 mixed with Hydroxyethylcellulose; caused false positive results
Collagen Biomatrix TissuDura Tool Baxter Internationl Inc. REF B2246000999999 Carrier; caused false positive results
Round glass cover slips, 11 mm Tool Assistent Germany 1001/0011 Carrier; causes false positive results
Bovine Collagen Sponge Tool Wyeth Animal Health Carrier; caused false positive results
Resodont Absorbable Collagen Membrane Tool Resorba Woundcare Germany LOT 280303 Carrier; caused false positive results
Non-Woven Swabs Tool Fink Walter GmbH REF 328132 Carrier; caused false positive results

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Poussin<em&gt; Ovo ex</em&gt; Culture et<em&gt; Ovo ex</em&gt; CAM Test: Comment il fonctionne vraiment
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Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Dünker, N. Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works. J. Vis. Exp. (33), e1620, doi:10.3791/1620 (2009).More

Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Dünker, N. Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works. J. Vis. Exp. (33), e1620, doi:10.3791/1620 (2009).

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