Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Chick Ex ovo Kultur och Ex ovo CAM analysen: hur det verkligen fungerar

doi: 10.3791/1620 Published: November 30, 2009

Summary

Den chick chorioallantoic membran (CAM) är ett unikt, naturligt immunförsvar stödjande kultur miljö att studera angiogenes och Tumörgenesens. Denna video artikeln visar de olika stegen i chick

Abstract

Kyckling ägg i den tidiga fasen av avel är mellan in vitro och in vivo-system och ger en vaskulär testmiljö inte bara att studera angiogenes, utan också för att studera Tumörgenesens. Efter chick chorioallantoic membran (CAM) har utvecklat, kan dess blodkärl nätverk är lättillgängliga, manipuleras och observerade och därför ger en optimal miljö för angiogenes analyser. Eftersom det lymfoida systemet inte är fullt utvecklat förrän i slutet stadier av inkubation, tjänar kycklingembryo som ett naturligt immunförsvar värd klara av transplanterade vävnader och celler utan artspecifika restriktioner. Förutom att vårda utveckla allo-och implanterad ger CAM blodkärl nätverk ett unikt stödjande miljö för tumörceller intravasation, spridning, och vaskulär gripandet och ett arkiv där greps celler extravasera att bilda mikro metastashärdar.

För försöksändamål, i de flesta av de senaste studierna CAM avslöjades genom att skära ett fönster genom äggskalet och experimenten utfördes i ovo, resulterar i betydande begränsningar i tillgängligheten av CAM och möjligheter för observation och fotodokumentation av effekter. När skalet mindre kulturer kycklingembryo användes 1-4, inga experimentella uppgifter och, om offentliggöras vid alla var överlevnaden för dessa kulturer låg. Vi förfinade metoden för ex ovo kultur kycklingembryon avsevärt genom att införa ett rationellt kontrollerad extrudering av ägget innehåll. Dessa ex ovo kulturer öka tillgängligheten till CAM och kycklingembryo, vilket gör det lätt in vivo dokumentation av effekter och underlätta experimentell manipulation av embryot. Detta möjliggör en framgångsrik ansökan till ett stort antal vetenskapliga frågor: (1) Som en förbättrad angiogenes analys 5,6, (2) en experimentell inrättats för underlättat injektioner i glaskroppen för kycklingembryo ögat 7-9, (3) som en testmiljö för spridning och intravasation av spridda tumörceller från etablerade cellinjer inokuleras på CAM 10-12, (4), ett förbättrat upprätthålla system för lyckad transplantation och kultur lem knoppar av kyckling och möss 13 samt (5 ) för ympning, förökning, och åter ympning av fast primära tumörvävnad från biopsier på ytan av CAM 14.

I denna video artikeln beskriver vi inrättandet av en raffinerad chick ex ovo kultur-och CAM-analysen med överlevnad över 50%. Förutom att vi erbjuder en steg för steg demonstration av framgångsrik tillämpning av ex ovo kultur för ett stort antal vetenskapliga applikationer.


Daniel S. Dohle, Susanne D. Pasa, och Sebastian Gustmann bidragit lika för denna studie.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

All utrustning och reagenser måste köpas steril eller behöver värme eller ånga steriliseras eller steriliseras med 70% EtOH.

Författarna hävdar att experiment på djur har utförts i enlighet med Europeiska gemenskapernas direktiv (86/609/EEG) i enlighet med riktlinjerna av NIH angående skötsel och användning av djur för försöksändamål förfaranden och de regler som anges av Institutional Animal Skötsel och användning kommittén (IACUC) vid universitetet i Duisburg-Essen (Tyskland).

Del 1: Inkubation av ägg

  1. Befruktade ägg kan förvaras vid 13 ° C i upp till en vecka.
  2. Ägg inkuberas under 72 timmar, som ligger horisontellt i en kuvös med ett rörligt bricka, roterande äggen 12 gånger om dagen kontinuerligt. Luftfuktigheten hålls vid 60 - 62%, inkubation temperaturen på 37,5 ° C.
    Obs: Innan du börjar inkubation, smuts, fjädrar och avföring avlägsnas omsorgsfullt från äggskal mekaniskt av torr avtorkning med gemensamma, grått papper sicksack handdukar, som har en grov snarare än en mjuk ytstruktur. Torka av äggen med etanol eller desinfektionsmedel, dock betydligt minskad överlevnad av embryona, oberoende av använda vätskan.

Del 2: Ex ovo kultur

  1. Efter inkubation i 72 timmar, är ägg som tas ur inkubatorn.
    Obs: ägg inkuberas i 72 timmar eftersom - enligt våra experiment - av okänd anledning, men i samförstånd med Auerbach et al.1 tidigare utvecklingsstadier hade signifikant lägre överlevnad. Vid steg senare än 72 timmar äggulan säck som ännu inte omfattas av CAM blir tunnare och tenderar att ansluta sig till äggskalet ledande (i) till små blödningar i området följsamhet och (ii) bristning av äggulan-säcken membran. Därför presenterade metoden inte är tillämplig på embryon är äldre än 72 timmar.
  2. Den övre sidan av ägg, där embryot är bosatt, präglas av blyertspenna eftersom embryot emot rotationen till en viss grad.
  3. Ägget hålls horisontellt med pennan märket på topp och sprucken i kanten av en 80 mm trekantig magnetisk omrörare om orienterade vinkelrätt mot den långa axeln av ägget.
    Notera: För en bättre känsla, ska inga handskar användas, men händerna ska desinficeras med 70% EtOH. Det är viktigt att äggskal samt ägg membran öppnas. Läckage av äggvita är ett säkert tecken på att ägget membranet har perforerad.
  4. Ägget hålls nära botten av petriskålen att undvika ytterligare läckage av äggvita.
    Obs: Under den inledande öppningen förfarandet är det viktigt att äggvitan på botten av petriskålen fortfarande är ansluten till resten inne i ägget som detta resulterar i ett vakuum inuti ägget som håller äggulan med embryot ovanpå insidan ägget. Det vakuum kan regleras antingen genom tryck med fingret som kontrollerar insläpp av luft in i ägget eller genom att lyfta ägget som ökar kolumnen anslutna äggvita dvs vakuum.
  5. Genom att försiktigt sätta press på meridianen som löper genom sprickan och ekvatorn i ägget med tummen och långfingret är det möjligt att reglera vakuum. Innehållet i ägget kan sedan överföras till petriskålen oskadad, om ägget med äggulan är försiktigt lyfts och båda halvorna av skalet är noggrant åtskilda. Embryot och äggulan fartyg bör ligga på toppen av ett oskadat äggula.
    Obs: Om penna markerar inte hålls på topp, kanske embryot skadas när sprickbildning skalet. Om äggen inte är spruckna noga nog eller embryona är äldre än 72 timmar (se ovan), pinnar äggulan säcken till skalet och ofta spricker. Samma sak händer när fuktighet inkubatorn är lägre än 60% eller ägg är inte roteras under inkubationstiden.
  6. Ex ovo kulturer är tillbaka till en inkubator och förvaras på 37,5 ° 38,2 ° C och 60% luftfuktighet. CO 2 eller O 2 utbudet är inte nödvändigt om inkubatorn inte är stängd hermetiskt (ventilation galler delvis öppna!) Och speciella petriskålar med distanser mellan lock och fat används.
    OBS: Flytta av de embryon bör hållas till ett minimum under de första dagarna av inkubationen. För mycket agitation leder till hög dödlighet. Från 9 inkubation dagen och framåt, embryona är mindre känsliga för agitation.
    Döda embryon bör tas bort omedelbart för att undvika infektioner.
    Om cellodling inkubatorer används, som är lufttätt förslutna, O 2 tillgången är obligatorisk för de embryon inte dö. Fukt är viktigt för CAM att inte torka ut och om inkubation temperaturen är lägre än 37 ° C, kommer embryona utvecklas för långsamt.

Del 3: Tillämpning av ämnen för angiogenes analyser

  1. Autoklaveras vikt filterpapper (50,5 mm i diameter) är stansade ett hålslaget och användas som underlag (bärare) för flytande ämnen tillämpas på CAM.
    Notera: Nästan alla bärarmaterial (se tabell nedan) orsakade irritation av CAM, särskilt när tillämpas före inkubering dag 10, eftersom det ändrade utveckla arkitektur CAM-fartyg. Detta även potentiellt inerta ämnen såsom hydroxietylcellulosa folie, Teflon svampar (PTFE-pledgets), kollagen svampar, kollagen folie, steril gasbinda (kompresser), runda täckglas, och ringar kisel, som alla orsakade falskt positiva resultat. Filterpapper verkade förorsakar minsta irritation och därför används i våra analyser.
  2. När CAM är fullt utbyggt kan upp till sex olika prover skall tillämpas och deras effekter kan jämföras på en enda CAM.
  3. För att undvika uttorkning filter ytterligare doser (3 mikrogram modersmål angiotropin) eller buffert (5 l PBS) bör appliceras varje dag.
  4. Från dag 3 efter ansökan, blodkärl orientera mot angiogena ämnen på filtren, medan mönstret av blodkärlen som omger kontroller är oförändrad.
    Obs: CAM bör inte förväxlas med gulan-säcken. CAM är en dynamisk utveckling av struktur medan äggulan säcken är statisk med små variationer under utveckling. På att utveckla dag tre u-CAM kan redovisas för första gången vid den bakre änden av embryot som en liten vesikler. Mellan dag tre och dag tio den inledande vesikler expanderar och skapar ett vikt två lager membran igenväxning äggulan säcken i allt snabbare takt. Appliceringsstället bör halvvägs mellan embryot och veck i CAM (gränsen) som annars embryot hindrar mikroskopisk observation av effekter i genomlysning. Alternativt kan filtret med den angiogena ämnet internaliseras när CAM fortsätter att växa.

Del 4: Inokulering av celler på CAM

4.1.Preparation av celler

  1. Sammanflytande celler överförs från kultur kolven till FALCON rören med hjälp av en steril 25 ml plastpipetten med hjälp av en pipett stöd.
  2. För att uppskatta mobilnummer, är 15 l av cellsuspensionen överförs till ett Neubauer kammare och celler räknas manuellt i mikroskop.
  3. Falcon rör centrifugeras i 3 min vid 1000 rpm vid rumstemperatur och supernatanten tas bort.
  4. För levande cell tracking, celler spädas med PBS till önskad koncentration (här: 2x10 7 celler / ml) och färgas med t.ex. PKH26 (Sigma), en röd fluorescerande levande cell membran märkning kit, enligt tillverkarens protokollet.
    Celler är resuspenderas i cellodling medium (företrädesvis Dulbecco ändrade örn medium; DMEM) till önskad koncentration för injektion (10 7 celler / ml) eller inokulering (3x10 6 celler / ml). Olika celler koncentrationer tillämpas för injektionsvätskor vs ympning enligt koncentrationerna redan publicerats i litteraturen 15-17 och vår erfarenhet.

4,2 Inokulering av celler på CAM

  1. Ringar (~ 1 mm tjocklek) har skurits ut från en 1 ml pipettspets eller en perifer venkateter (PVL) röret med hjälp av en vass skalpell och tillämpas på webcam en E6-E14 odlade kycklingembryo ex ovo.
    Observera: Försök att inte "såg" flera gånger men att skära igenom pipettspetsen eller kateter slang med en skära med en ny, mycket skarp skalpell för att undvika skarpa kanter på den resulterande ringarna. Kolla ringarna under mikroskop för skarpa kanter till följd av mikrosprickor.
  2. Beroende på storleken av ringarna 20 l 3x10 6 celler / ml celler pipetteras totalt i en ring eller som delade volymer i flera ringar.
    Obs: I vissa fall traumatisering av CAM genom att försiktigt skrapa är en förutsättning, t ex för att underlätta ympning av celler 17 och kapillarisering av transplantat (se nedan). Om däremot traumatisering av CAM inte avsedda eller contraindicative, t.ex. för studier av invasiva potential tumörceller, bör ringarna inte användas för ympning, men celler bör tillämpas direkt som tillämpning av ringar eller ringar själva kan inducera mikro lesion . Om ringarna används bör dessa skäras så tunt som möjligt för att minimera vikt och undvika indrag av CAM.

Del 5: Intravitreala injektion av celler

  1. En Hamilton mikroliter spruta sköljas flera gånger med 70% EtOH och slutligen med steril PBS.
  2. Mikro sprutan är fylld med det färdiga färgade eller ofärgade cellsuspension (se del 4.1).
    Obs: injektionsstället måste noggrant utvalda, för att inte skada blodkärlen i CAM eller närliggande strukturer av embryot (brain!) med över penetrering med nålen. Injektionen ska ske under en dissektion kikare.
  3. Under mikroskop kontrollFörsiktigt, men snabbt tränga in i CAM och lager ögat med nålen och kontinuerligt injicera 10 till maximal 20 l cellsuspension (företrädesvis spätts i PBS) i glaskroppen av odlade kycklingembryo ex ovo.
    Obs: Om CAM inte kan penetreras med nål, kan det tas bort på en plats med få eller inga blodkärl genom att försiktigt riva sönder den med två pincett.
  4. Nålen bör vara 1-2 sekunder in i ögat för att undvika en förlust av det injicerade cellsuspension av läckage.

Del 6: dissekering av knoppar kyckling lem

  1. Ägg är ur kuvösen efter 3 till 4 dagars inkubation (E3/E4 = Hamburger Hamilton (HH) stage18-23)
  2. Ägg är spruckna i kanten av en trekantig magnetisk omrörare och överföras till en petriskål (detaljer: se del 2) och embryot dissekeras från den anslutna äggulan fartyg genom att klippa en cirkel med Spring sax.
  3. Embryot överförs till en ny petriskål fylld med kallt, sterilt PBS med hjälp av ett litet avlopp sked och tvättade av typ agitation.
  4. Embryot överförs till en liten petriskål fylld med steril PBS och fri från omgivande membran, försiktigt riva sönder dem med fin pincett.
  5. Limb knoppar skiljs av mikrokirurgisk pincett så nära kroppen som möjligt, förstått och överförs till CAM av en 8-10-dagar gamla odlade värd kyckling ex ovo (se ympning förfarande).

Del 7: Förberedelse av knoppar mus lem

  1. Tid gravid parningar sätts upp och på morgonen den dag då en vaginal plug upptäcks hos kvinnor parning är utsedd dräktighetens dag 0.
  2. Den dräktiga offras av halsdislokation då utvecklingen av embryon nått embryonala dag (E) 10 till 13 och fixerade på en vax ombord.
  3. Bukväggen är fuktad med 70% EtOH, skär längs mittlinjen och huden klaffarna är fasta sidled stift.
  4. Både horn i livmodern tas bort från buken, fristående och överförs till en bägare med kallt PBS.
  5. Embryona är separerade, överförs till en petriskål och livmoder väggen och embryonala membran avlägsnas försiktigt med hjälp av tång.
  6. Limb knoppar är avskurna med hjälp av vårens sax eller loss av fina pincett så nära kroppen som möjligt, förstått och överförs till CAM 8-10-dagar gamla värd kyckling odlade ex ovo (se ympning förfarande).

Del 8: Insamling av tumörprover

  1. Tumör biopsier samlas i 2 ml Eppendorf-rör fyllt med tumör-specifika odlingssubstrat (här: Leibovitz på medellång) och förvaras i rumstemperatur.
  2. Tumör biopsier skärs i 1-2 mm3 stycken av sterila skalpeller.
    Obs: Om tumörprover var för små, kanske de inte fäster CAM, om de var för stora, kan CAM skadas och embryot skulle dö.
  3. En bit från kärnan av biopsi provet ympas CAM 8-10-dagar gamla värd kyckling odlade ex ovo (se ympning förfarande).
    Anm: Med material från ytan av biopsi ökar risken för kontaminering med muskler och bindväv.

Del 9: Ympning förfarande

  1. För ympning av lem knoppar eller tumör exemplar, den fullt utvecklade CAM 8-10-dagar gamla kycklingembryon odlade ex ovo används.
  2. Transplantaten är idealiskt beläget på CAM nära en Y bifurkation av ett blodkärl.
  3. Vid önskad applikationsstället är CAM selektivt traumatiserade genom försiktig skrapning av (tång) den övre peridermal delen av dubbla epiteliala skiktet medan den basala lagret intakt.
    OBS: Det är viktigt att undvika blödning eller synlig ruptur av kapillärer.
  4. Transplantatet överförs till CAM med minimal PBS bifogas. Beroende på transplantat, kan det placeras en eller två gånger på en plats i CAM, där ingen slutlig ympning är avsett att undanröja orimliga PBS och slutligen ympade på traumatiserade beredd CAM-sajt.
  5. Transplantatet är fattade av fina pincett och lager på CAM. Beroende på känsligheten i transplantat kan lätt tryck appliceras (inte lämplig för lem knoppar) för att manövrera ympa in en resulterande indrag för CAM (lämplig för tumörprover).
    OBS: Eftersom chick immunsystemet utvecklas i embryonala dag (E) 18, ska ex ovo xenografter kulturer inte förlängas längre än E17 som värd kycklingembryon ofta dör.
    Det är viktigt att ha tillgång värd dygnet runt, respektive kycklingembryon odlade ex ovo, tidsinställda att sammanfalla med en källa av givare vävnad som du väljer.

Del 10: Re-ympning

  1. Värden kycklingembryo dödas genom halshuggning.
  2. CAM medbifogade transplantatet avlägsnas genom ett cirkulärt snitt med spetsiga sax och överförs till en petriskål fylld med PBS.
  3. Överdriven CAM är klippt från transplantatet till våren sax undantag för fd applikationsstället.
  4. I händelse av större tumörprover är transplantat skär i halvor eller flera mindre delar och åter ympas med skäreggen vänd mot nya webcam i den andra värden.

Del 11: representativa resultat

Figur 1
Figur 1. Shell-mindre kyckling kultur
Kyckling embryon i olika utvecklingsstadier odlade ex ovo i petriskålar.

Figur 2
Figur 2. Ex ovo CAM angiogenes analys
Befruktade hönsägg inkuberades horisontellt vid 37 ° C och luftfuktighet på 60 - 62% och sprucken i petriskålar på embryonala dag 4 (E4). Inkubering fortsatte på samma villkor. På E10 sterila filterpapper (5,5 mm i diameter) var lager på toppen av CAM och dränkta med antingen 5 l PBS eller 3 mikrogram infödda angiotropin6. Kapillärer visade tydligt anpassning till de angiotropin indränkt filterpapper på E14.

Figur 3
Figur 3. Ex ovo ympning av lem knoppar
Limb knoppar från chick (E3/E4) och mus (E13) har ympats på CAM skal mindre kyckling kulturer. Blodkärl från CAM in extremiteten knopparna efter två dagar. Utvecklingen av lem knoppar fortsatte i dessa ex ovo kulturer nådde en två fingerben skede i brud och visa minskning av interdigitala duk i murina lem knoppar.

Figur 4
Figur 4. Ex ovo ympning av tumör prov
En biopsi prov av urinblåsan karcinom var inympas på CAM av en 10-dagar gamla odlade kycklingembryo ex ovo. Efter två dagar i kultur, var tumören exemplar ansluten till CAM-kärlsystemet och efter 7 dagar, fanns flera blodkärl in i transplantatet observerats.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Innovativ eller bara en annan brud kultur-protokollet?

Med tidigare skal mindre kultur protokollen 1-4 den totala överlevnaden av kycklingembryon var låga, t ex ca. 30% 1. Den raffinerade ex ovo kultur protokoll som beskrivs i denna video artikeln, däremot möjliggör överlevnad över 50%. Jämfört med klassisk ovo kulturer ex ovo kultur kycklingembryon underlättar avsevärt tillgänglighet CAM och kycklingembryo och gör sin experimentella manipulation och kontinuerlig uppföljning. Denna kultur metod kan användas för en mängd olika program som sträcker sig från ökad angiogenes analyser 5,6, att underlättas injektioner i glaskroppen för kycklingembryo ögat 7-9, intravasation analyser 10-12, förbättrad ympning och tillväxt lem knoppar 13 och innovativa underhåll av tumörprover 14. Därmed bidrar ex ovo kulturen ett användbart verktyg i utvecklings-, angionesis och tumör forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Författarna vill tacka J. Kueper och J. Wittschier för utmärkt tekniskt bistånd och professor Ruebben för generöst leverera tumörvävnad.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Fertilized Eggs Animal Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH
Mice Animal Charles River Laboratories
Incubator Type 3000 with rotating egg tray Tools Siemens AG 9503 Maintain at 37°C with relative humidity set above 60%
Egg incubator BSS 160 Tools Grumbach, Germany 8101 Maintain at 37-387deg;C with relative humidity set above 60%
PBS Reagent Sigma-Aldrich PBS should be cold (> 4°C) and sterile
Dulbecco’s modified eagle’s medium Reagent Sigma-Aldrich D 6429 DMEM culture medium
Leibovitz’s L-15 Medium Reagent Invitrogen 31415-029 here: collection medium for tumor samples
Tumor cell -specific medium Reagent Sigma-Aldrich each research group should use the medium they culture their tumors cells in or common culture media, e.g. Leibovitz’s Medium or Dulbecco’s modified eagle’s medium
supplemented with 15% fetal bovine serum (FBS), 4mM L-glutamine and 50 μM insulin
70% EtOH Reagent Sigma-Aldrich
Magnetic stir bar, triangled 80 mm Tool VWR international 442-0391 A triangled magnetic stir bar serves well to crack the eggs shell.
Forceps DUMONT #5 Tool Fine Science Tools 11252-30 bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip)
Forceps DUMONT #7 Tool Fine Science Tools 11271-30 curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip)
Spring scissors, straight, 8cm Tool Fine Science Tools 15000-00 fine, small straight blades
Fine Iris scissors, straight Tool Fine Science Tools 14094-11 Use to cut our the CAM
Standard scissors, straight, sharp/blunt Tool Fine Science Tools 14007-14 Use for decapitation or cervical dislocation
microliter syringe 1702 TLLX, 25 μl Tool Hamilton Co 80222 Use for injection into the vitreous
Hamilton 33-G needle (15 mm) Tool Fine Science Tools 18073-15 Use for injection into the vitreous
Sterile scalpels Tool Use for dissecting tumor samples
Small drain spoon Tool Geuder 15758 Use to transfer of small chick embryos
Wax board with fixing pins Tool Home made Use to fix of animals for dissection
Petri dishes 60 x 15 mm Tool Greiner Bio-One 628102
Petri dishes 92 x 16 mm Tool Sarstedt Ltd 82.1472
Sterile Petri dish 100 x 20 mm Tool Greiner Bio-One 664160 extra deep, with spacers for ventilation
Beaker Tool 300-600 ml
FALCON tubes Tool Falcon BD 15 ml and 50 ml
Eppendorf tubes Tool Eppendorf 1.5 ml and 2 ml
1ml pipette tips Tool Use to cut plastic rings for application of substances / cells
Peripheral venous catheter (PVL) Tool Viggo® Use to cut silicon rings from the tube for application of substances / cells
Pipettes and tips Tool Eppendorf
Autoclaved folded Filters 595 1/2, 110 mm diameter Tool Schleicher Schuell 311643 Carrier, which caused least irritation of the CAM; used in the paper
PTFE-Pledget, non resorbing, 6,3 x 152.4 x 1.6 mm Tool santec-medical REF 277, LOT 832/511-1 Carrier; caused false positive results
Hxdroxyethylcellulose Tylose H 100000 Reagent Carrier mixed with Kollidon 17 PF; caused false positive results
Kollidon 17 PF Reagent BASF S30200 mixed with Hydroxyethylcellulose; caused false positive results
Collagen Biomatrix TissuDura Tool Baxter Internationl Inc. REF B2246000999999 Carrier; caused false positive results
Round glass cover slips, 11 mm Tool Assistent Germany 1001/0011 Carrier; causes false positive results
Bovine Collagen Sponge Tool Wyeth Animal Health Carrier; caused false positive results
Resodont Absorbable Collagen Membrane Tool Resorba Woundcare Germany LOT 280303 Carrier; caused false positive results
Non-Woven Swabs Tool Fink Walter GmbH REF 328132 Carrier; caused false positive results

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 41, 391-394 (1974).
  2. Tufan, A. C., Akdogan, I., Adiguzel, E. Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of development neurobiology. Neuroanatomy. 3, 8-11 (2004).
  3. Deryugina, E. I., Quigley, J. P. Chick embryo chorioallantoic membrane models to quantify angiogenesis induced by inflammatory and tumor cells or purified effector molecules. Methods Enzymology. 444, 21-44 (2008).
  4. Ribatti, D. Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis. Int. Rev. Cell Mol. Biol. 270, 181-224 (2008).
  5. Höckel, M., Sasse, J., Wissler, J. H. Purified monocyte-derived angiogenic substance (angiotropin) stimulates migration, phenotypic changes, and "tube formation" but not proliferation of capillary endothelial cells in vitro. J. Cell Physiol. 133, 1-13 (1987).
  6. Wissler, J. H. Engineering of blood vessel patterns by Angio Morphogens [Angiotropins]. Materialwiss. Werkstofftech. 32, 984-1008 (2001).
  7. Kistler, H. B. J. r., LaVail, J. H. Penetration of horseradish peroxidase into the optic nerve after vitreal or vascular injections in the developing chick. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 20, 705-716 (1981).
  8. Halfter, W. Change in embryonic eye size and retinal cell proliferation following intravitreal injection of glycosaminoglycans. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49, 3289-3298 (2008).
  9. Oppitz, M., Busch, C., Shriek, G., Metzger, M., Just, L., Drews, U. Non-malignant migration of B16 mouse melanoma cells in the neural crest and invasive growth in the eye cup of the chick embryo. Melanoma Res. 17, 17-30 (2007).
  10. Uchibayashi, T., Egawa, M., Nakajima, K., Hisazumi, H., Tanaka, M., Endo, Y., Sasaki, T. Responses of tumour cell lines implanted onto the chorioallantoic membrane of chick embryo to anticancer agents in combination with hyperthermia. Urol. Res. 20, 237-239 (1992).
  11. Demir, R., Naschberger, L., Demir, I., Melling, N., Dimmler, A., Papadopoulus, T., Sturzl, M., Klein, P., Hohenberger, W. Hypoxia generates a more invasive phenotype of tumour cells: an in vivo experimental setup based on the chorioallantoic membrane. Pathol. Oncol. Res. (2008).
  12. Kunzi-Rapp, K., Genze, F., Kufer, R., Reich, E., Hautmann, R. E., Gschwend, J. E. Chorioallantoic membrane assay: vascularized 3-dimensional cell culture system for human prostate cancer cells as an animal substitute model. J. Urol. 166, 1502-1507 (2001).
  13. Hall, B. K. Grafting of organs and tissues to the chorioallantoic membrane of the embryonic chick. TCA Manual. 4, (3), 881-883 (1978).
  14. Kunzi-Rapp, K., Kaskel, P., Steiner, R., Peter, R. U., Krahn, G. Increased blood levels of human S100 in melanoma chick embryo xenografts' circulation. Pigment Cell Res. 14, 9-13 (2001).
  15. McFall, R. C., Sery, T. W., Makadon, M. Characterization of a new continuous cell line derived from a human retinoblastoma. Cancer Research. 37, 1003-1010 (1977).
  16. Deryugina, E. I., Zijlstra, A., Partridge, J. J., Kupriyanova, T. A., Madsen, M. A., Papagiannakopoulos, T., Quigley, J. P. Unexpected effect of matrix metalloproteinase down-regulation on vascular intravasation and metastasis of human fibrosarcoma cells selected in vivo for high rates of dissemination. Cancer Research. 65, 10959-10969 (2005).
  17. Kim, J., Kovalski, K., Ossowski, L. requirement for specific proteases in cancer cell intravasation as revealed by a novel semiquantitative PCR-based assay. Cell. 94, 353-362 (1998).
Chick<em> Ex ovo</em> Kultur och<em> Ex ovo</em> CAM analysen: hur det verkligen fungerar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Dünker, N. Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works. J. Vis. Exp. (33), e1620, doi:10.3791/1620 (2009).More

Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Dünker, N. Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works. J. Vis. Exp. (33), e1620, doi:10.3791/1620 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter